超聲波輔助提取花生紅衣工藝優化及抗菌抗氧化性能研究

戴卿印,陸運龍,黃茜,秦志永*

1(廣西大學 資源環境與材料學院,廣西 南寧,530004) 2(有色金屬及材料加工新技術教育部重點實驗室,廣西 南寧,530004)

花生,一年生豆科草本植物[1],世界上第二大重要的豆類作物和第四大食用油料作物,是油脂和蛋白質的主要來源?；ㄉt衣含有多種多酚化合物(酚酸、類黃酮和二苯乙烯),如各種花青素和原花青素等,具有降血糖、清除自由基、促進血小板生成、降血脂等多種生理功能[2],同時還具有強化毛細血管、促進血液循環的功效,有助于提高視力、改善關節的靈活性、增強心臟活力,預防大腦病變等作用[3-4]。研究表明其中的多酚化合物有可能成為未來膳食補充劑和功能性成分的可持續來源[5],應用在各種食品和制藥領域[6]。盡管花生紅衣有這些有益的特性,但它仍然是一種未得到充分利用的自然資源,更多地只是將這種副產品作為動物飼料來使用。為了提高花生多酚在增強化學穩定性和感官特性以及延長加工食品保質期方面的潛力,需要進行更多的研究來開發有效的提取工藝。

許多研究發現采用固-液提取技術(浸漬、超聲、索氏提取和熱回流)和不同的有機溶劑對花生紅衣的提取率較高,主要是因為氫鍵作用可以提高酚類物質的提取效率[7]。超聲波法具有提取率高、提取時間短,操作簡便、成本低、產物易純化、設備要求低等優點[8-9],被廣泛應用于天然產物及生物活性物質提取等領域[10-11]。響應面法(response surface method,RSM)是一種評估多個因素及其相互作用對一個或多個響應變量的影響的有效方法,該方法用于工藝優化,可獲得最優的工藝因素條件[12]。雖然花生紅衣的一些化合物已經被鑒定出來,但許多仍是未知的,這是因為不同提取方法、提取劑、工藝都會影響其化合物的產率及種類,花生紅衣酚類提取物的活性強弱受其酚類物質含量的影響[13]。此外,對于花生紅衣提取物對各類細菌的抑菌抗菌性能以及抗氧化性能的研究并不深入。

本試驗采用RSM法探究了花生紅衣多酚的最佳提取條件,優化了料液比、溶劑濃度、溫度和時間等工藝參數;并通過液質聯用儀鑒定了花生紅衣中主要的物質成分,最后測定了花生紅衣提取物的總酚含量、抗氧化特性,并對4種革蘭氏陽(陰)細菌的抑菌抗菌性能進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生紅衣,安徽省昊州某供應商;磷酸緩沖液(pH=6.8)、乙醇(分析純)、甲醇(HPLC級)、福林酚(分析純)、沒食子酸(分析純)、DPPH(分析純)與ABTS(分析純)等試劑,上海麥克林公司;Mueller-Hinton(MH)瓊脂培養基、LB培養基、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、大腸埃希氏菌(ATCC25922)、鼠傷寒沙門氏菌(ATCC14028)與單增李斯特菌(ATCC191115),廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

040S超聲波清洗儀,深圳利興隆有限公司;96孔板,南通試驗器材有限公司;LBI-375-N細菌培養箱,上海龍躍儀器設備有限公司;JIDI-20D高速離心機,廣州吉迪儀器有限公司;RE52CS旋轉蒸發儀,上海亞榮儀器有限公司;UV-2450紫外分光光度計儀,日本島津公司;AGILENT 6460液質聯用儀,美國安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 花生紅衣提取物(peanut scarlet extractive,PSE)的制備

將花生紅衣磨碎后,過120目篩網,稱取5 g花生紅衣粉末浸泡于80%乙醇溶液6 h(料液比值為0.05 g/mL);采用超聲清洗儀輔助提取40 min(超聲溫度60 ℃);采用高速離心機離心10 min(6 000 r/min),使用0.22 μm的水系濾膜除去雜質,利用旋轉蒸發儀回收提取液中的乙醇溶液,冷凍干燥后,獲得PSE,置于4 ℃冰箱中保存備用。

1.3.2 PSE的提取工藝優化

1.3.2.1 超聲時間對總多酚提取率的影響

超聲提取時間分別為20、40、60、80、100 min;超聲溫度為30 ℃,料液比值固定為0.07 g/mL。采用紫外分光光度計測定PSE中總多酚含量。

1.3.2.2 超聲溫度對總多酚提取率的影響

設置超聲清洗儀的溫度分別為30、40、50、60、70 ℃;超聲時間固定為30 min,料液比值固定為0.05 g/mL,乙醇體積分數為80%。采用紫外分光光度計測定PSE中總多酚含量。

1.3.2.3 料液比值對總多酚提取率的影響

設置花生紅衣粉末質量與70%乙醇溶液的料液比值分別為0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 g/mL;超聲溫度固定為40 ℃,超聲時間固定為40 min,乙醇體積分數為90%。采用紫外分光光度計測定PSE中總多酚含量。

1.3.2.4 乙醇體積分數對總酚提取率的影響

設置提取液中乙醇體積分數為50%、60%、70%、80%、90%;超聲時間溫度分別固定為50 min與50 ℃;料液比值固定為0.03 g/mL。采用紫外分光光度計測定PSE中總多酚含量。

1.3.3 PSE提取工藝的優化

基于單因素試驗的優化結果,總酚含量為效應值,利用RSM對超聲時間、超聲溫度、料液比值以及乙醇體積分數等4個因素進行3水平響應面優化試驗分析,每組試驗重復3次,實驗設計如表1所示,通過Design-Expert 13軟件的Box Behnken設計設定RSM試驗因子水平值,確定花生紅衣提取物最佳工藝條件。

1.3.4 PSE粗提率的測定

PSE中的總多酚含量(total polyphenols content, TPC)參照MUNOZ等[14]方法并稍作修改,將PSE超聲溶解于無水乙醇溶液中,將該溶液、福林酚試劑和20% Na2CO3溶液以不同比例混合在10 mL容量瓶中,常溫避光反應40 min后,用紫外分光光度計(波長為760 nm)測定PSE的TPC,PSE中的TPC以沒食子酸當量表示(mg/g)[15]。PSE的粗提率(E,%)計算如公式(1)所示:

(1)

式中:m1為提取前花生紅衣的質量,mg;m2為提取后花生紅衣的質量,mg。

1.3.5 PSE中生物活性成分的測定

參照JAEGER等[16]的方法稍作修改,將所得PSE超聲溶解于甲醇溶液(1 mg/L)中,采用液質聯用儀(柱溫30 ℃,流速0.3 mL/min),對PSE的化學組成進行定性分析。其中流動相A為乙腈溶液,流動相B為甲醇溶液;按梯度洗脫,進樣量15 μL,運行時間10 min。

1.3.6 PSE自由基清除性的計算

PSE溶解于無水乙醇中,配制質量濃度分別為500、250、125、62.5、31.25 μg/mL的PSE提取溶液,取其上清液0.5 mL與5 mL的DPPH溶液混合(DPPH配制成0.1 mmol/L的乙醇溶液),避光反應1 h,采用紫外分光光度計測定樣品在517 nm處的吸光度,復合膜的DPPH清除活性的計算如公式(2)所示:

(2)

式中:Acontrol為空白對照組的吸光度;Asample為試驗組的吸光度。

為了測定PSE的ABTS陽離子自由基清除效果,取0.737 mL ABTS的甲醇溶液(7.4 mmol)和1.43 mL過硫酸鉀水溶液(2.6 mmol)的混合物避光反應12 h,將原液用蒸餾水稀釋一定倍數后,使混合物在734 nm處的吸光度保持在0.7不變;然后將5 mL混合溶液與0.5 mL PSE乙醇溶液混合,避光反應10 min,使用紫外分光光度計測定734 nm處的吸光度,復合膜ABTS清除活性的計算如公式(3)所示。

(3)

式中:Acontrol為空白對照組的吸光度;Asample為試驗組的吸光度。

1.3.7 PSE的抑菌測定

1.3.7.1 細菌培養

選取革蘭氏陽性細菌:金黃色葡萄球菌(S.aureus)和單增李斯特細菌(L.monocytgenes),革蘭氏陰性菌:大腸桿菌(E.coli)和鼠傷寒桿沙門氏菌(S.typhimurium)作為試驗菌株。將上述4種細菌凍干粉溶解后加入至LB肉湯中,在37 ℃的恒溫振蕩器中培養24 h,轉移到固體培養基(MH培養基)中進行復蘇。在后續接種步驟中,再次使用滅菌后的接種環將培養基中細菌接種到LB肉湯(50 mL)中,將培養液振蕩24 h(37 ℃,110 r/min)使其生長。

1.3.7.2 最小抑菌濃度測定

選取S.aureus、E.coli、S.typhimurium、L.monocytogenes作為試驗菌株,稱取冷凍干燥后的PSE溶解于蒸餾水中。采用二倍稀釋法[17]將PSE溶液質量濃度分別稀釋為9.6、4.8、2.4、1.2、0.6、0.3、0.15 mg/mL;吸取上述500 μL的PSE溶液、25 μL細菌懸液(菌濃度為105CFU/mL)以及500 μL的LB培養基至96孔板中,以磷酸緩沖液(PBS,pH值為7.4)為陽性對照,不含細菌懸液和PSE溶液的孔板為陰性對照,每組試驗平行3次,最后將上述孔板放入恒溫振蕩器中(37 ℃,110 r/min)振蕩培養24 h,記錄溶液中細菌生長情況。將孔內溶液渾濁的樣品編號記為“+”,表明溶液中有細菌繁殖;將孔內溶液澄清的樣品記為“-”,表明溶液無細菌繁殖,并將該樣品濃度記為最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)[18]。

1.3.7.3 抗菌活性(瓊脂擴散)測定

采用瓊脂擴散法測定PSE的抗菌活性,利用PBS(pH值為7.4)溶液將細菌濃度稀釋至107CFU/mL,用玻璃涂布棒將菌懸液(100 μL)均勻涂布于培養基上,采用鑷子夾取滅菌后的牛津杯平穩放置于培養基上,每個牛津杯注入不同濃度的PSE溶液,最后將培養基置于培養箱(37 ℃)培養24 h后,測量其抑菌圈的直徑。

2 結果與分析

2.1 PSE提取參數優化(單因素試驗)

2.1.1 超聲時間對PSE中總多酚提取率的影響

沒食子酸標準曲線在0.001～0.006 μg/mL的吸光度具有良好的線性關系(y=47.94x-0.011,R2=0.997);PSE中的TPC以沒食子酸當量表示(mg/g)。超聲時間對多酚提取率的影響如圖1-A 所示,當超聲時間為40 min時,TPC與粗提率值最大,分別為114.25 mg/g,35.86%;隨著超聲時間延長,TPC逐漸降低,這是因為花生紅衣在恒定功率條件下,長時間受熱造成提取物中多酚物質結構破壞,分解失活[19],降低了提取物的TPC含量。因此,最佳超聲時間為40 min。

A-超聲時間;B-超聲溫度;C-料液比;D-乙醇體積分數圖1 單因素試驗對多酚提取率的影響Fig.1 Effect of single factor experiment on the extraction rate of polyphenols

2.1.2 超聲溫度對PSE中總多酚提取率的影響

如圖1-B所示,當溫度<60 ℃時,花生紅衣多酚提取率隨著溫度升高而增加,當溫度>60 ℃時,PSE中的TPC為126.82 mg/g,粗提率為34.93%;隨著溫度逐漸增大,其TPC逐漸降低,這是因為提取溶劑在高溫時易揮發,PSE中的多酚物質易分解造成的[20]。因此最佳超聲溫度為60 ℃。

2.1.3 料液比、乙醇體積分數對PSE中總多酚提取率的影響

如圖1-C、圖1-D所示,當料液比值為0.05 g/mL時,PSE中的TPC含量最大為122.50 mg/g,粗提率為35.75%;當乙醇體積分數為80%時,PSE中的多酚提取率最大。因此,選擇料液比值為0.05 g/mL、乙醇體積分數為80%作為最佳提取工藝參數。

2.2 PSE的提取工藝響應面法優化

基于單因素優化條件,通過Design-expert 13軟件對試驗結果(TPC)進行分析(表2),優化了PSE提取工藝條件,構建了PSE多酚提取的模型[21],并對結果進行多元回歸擬合,所得二次回歸函數的模型方程為y=134.35+2.27A-0.498B-0.336 7C-0.117 0D+7AB+4.58AC+3.73AD-5.28BC+10.68BD+7.36CD-42.88A2-19.30B2-13.38C2-25.85D2;經計算可得,模型的P值≤0.000 1,說明該回歸方程顯著,失擬項為0.052 1(不顯著),回歸系數R2=0.973 3,表明方程與響應值吻合度達到了95.43%,結果還表明該函數方程可對試驗結果進行良好的評估和預測,適合花生紅衣多酚的提取工藝參數優化,其影響因素由大到小依次為乙醇體積分數>超聲溫度>超聲時間>料液比,結果值預測有效。進一步優化分析可得,花生紅衣提取最佳工藝參數分別為超聲時間40 min,超聲溫度60 ℃,料液比值為0.05 g/mL,乙醇體積分數為80%,預測提取得到的TPC最大為148.17 mg/g,最小為120.53 mg/g;而實際測量值為137 mg/g,與預測的平均提取多酚得率偏差1.97%,該結果表明優化后的工藝參數對于花生紅衣中多酚的提取具有指導性意義。

表2 制備PSE的Box-Behnken設計因子及響應值Table 2 The Box-Behnken design factors and response values of PSE

2.3 PSE主要化學組成

采用LC-MS研究了PSE的主要化學成分,如圖2 所示。采用Compoud Discoverer 2.1軟件進行總峰面積比數據(樣品/對照)對PSE進行化學組成分析。PSE中主要多酚活性化學成分為百里香酚[質量/電荷比(m/e)7 962.537,保留時間為10.501 min]和兒茶素(m/e2 607.77,保留時間為4.714 min);同時在提取物中還存在對苯二甲酸(m/e10.416,保留時間為0.327 min)、龍膽酸(m/e36.168,保留時間為0.429 min)、紫蘇酸(m/e100.312,保留時間為11.039 min)、槲皮素(m/e2.341,保留時間為8.667 min)、4-仲丁酚(m/e43.464,保留時間為0.429 min)與根匍柄菌素(m/e11.237,保留時間為16.969 min),以及其他含量較多的糖類脂肪類物質。前人報道發現紅色花生品種中主要多酚成分為原花青素、兒茶素、沒食子酸等多酚物質[22],而對黑色花生外皮而言,主要為花青素、阿魏酸和槲皮素等多酚物質[23]。這主要是因為除了溶劑種類、濃度、提取方式的影響外,花生種類也是造成化學組成差異的原因[24]。

A-正離子色譜圖;B-負離子色譜圖圖2 PSE的色譜圖Fig.2 Chromatogram of PSE

2.4 PSE抗氧化性能

PSE的抗氧化性如圖3所示,隨著PSE濃度增加,對DPPH自由基的清除率升高,而在相同的測定濃度范圍內,高濃度PSE對ABTS陽離子自由基的清除率并未有顯著的差異。當PSE質量濃度為500 μg/mL 時,PSE對2種自由基的最大清除率分別為93.93%(DPPH)與99.62%(ABTS),該結果還表明PSE對ABTS清除效果優于DPPH。這是因為PSE中多酚化合物的苯環上含有大量羥基,可通過氫原子從活性基團上轉移到自由基上來清除自由基;CAO等[25]發現花生紅衣中的二苯乙烯類化合物反式白藜蘆醇的供氫(或原子脫氫)反應是其具有優異自由基清除能力的原因。酚羥基在對位羥基上供氫(或原子脫氫)的反應,以及苯氧基4位上未配對的電子與二苯乙烯骨架的π電子之間發生π共軛效應,所生成穩定半醌自由基,導致了提取物具有較強的自由基清除能力[26]。

A-DPPH自由基清除率;B-ABTS陽離子自由基清除率圖3 PSE的DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除率Fig.3 The DPPH and ABTS radical scavenging activity of PSE

2.5 PSE最小抑菌濃度與抗菌效果

不同濃度PSE提取物對4種革蘭氏陽(陰)細菌的最小抑菌濃度如表3所示。

表3 PSE對4種細菌的MICTable 3 MIC of PSE to 4 kinds of bacteria

PSE對S.aureus與S.typhimurium的最小抑菌濃度為1.4 mg/mL;對E.coli與L.monocytogenes的最小抑菌濃度為2.8 mg/mL。研究表明花生紅衣與花生殼的提取物對革蘭氏陰性細菌的抗菌活性大于革蘭氏陽性細菌[27],但也有研究報道花生及其副營養物(花生殼、花生紅衣)提取物對革蘭氏陰性細菌有更好的抑菌效果[28]。為了進一步探究PSE對細菌的抑菌效果,采用瓊脂擴散法測定了不同濃度PSE的抑菌效果,抑菌直徑如圖4所示,當PSE濃度小于MIC時,對細菌并未產生任何抑菌效果,隨著PSE的濃度增大,對細菌的抑制效果越為明顯,這與MIC結果一致。抑菌直徑的結果表明PSE對4種細菌的抑菌效果為S.typhimurium>S.aureus>E.coli>L.monocytogenes。

培養皿上的數字1～6分別代表PSE的質量濃度為0.175、0.35、0.7、1.4、2.8、5.6 mg/mLA-S.aureus;B-E.coli;C-S. typhimurium;D-L. monocytogene圖4 不同濃度的PSE對菌株的抑菌效果Fig.4 The bacteriostatic effects of PSE with different concentrations on strains

3 結論

花生紅衣多酚提取工藝參數影響因素由大到小依次為乙醇體積分數、超聲溫度、超聲時間、料液比,結果值預測有效;最優工藝參數分別為超聲時間40 min,超聲溫度60 ℃,料液比值為0.05 g/mL,乙醇體積分數80%,最終提取的TPC為137 mg/g。LC-MS 結果表明,PSE中多酚活性化學成分主要為百里酚(m/e7 962.537)和兒茶素(m/e2 607.77)等;PSE對DPPH與ABTS均具有優異的抗氧化能力,當PSE質量濃度為500 μg/mL時,PSE對2種自由基的最大清除率分別為93.93%(DPPH)與99.62%(ABTS)。PSE對S.aureus與S.typhimurium的MIC為1.4 mg/mL,對E.coli與L.monocytogenes的MIC為2.8 mg/mL;瓊脂擴散試驗結果表明PSE對4種細菌的抑菌效果依次為S.typhimurium>S.aureus>E.coli>L.monocytogenes。