游動放線菌產(chǎn)阿卡波糖高通量篩選模型的建立及優(yōu)化

周健,李翔飛,2,李闖,2,劉坤,2,趙世光,2,薛正蓮,2*

1(安徽工程大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,安徽 蕪湖,241000) 2(安徽省工業(yè)微生物分子育種工程實驗室,安徽 蕪湖,241000)

20世紀(jì)七十年代初FROMMER等從猶他游動放線菌的培養(yǎng)液中分離得到一種C7N-氨基環(huán)醇類假性四糖物質(zhì)即阿卡波糖(acarbose)[1-2],它的結(jié)構(gòu)組成包括不飽和氨基環(huán)醇、脫氧己糖和麥芽糖3個部分[3]。阿卡波糖是一種競爭性的α-葡萄糖苷酶抑制劑,由于它能夠通過抑制小腸壁細(xì)胞的α-葡糖苷酶活性,以減緩腸道中寡糖、雙糖或多糖的消化吸收,從而降低餐后血糖水平[4]。因此自1990年以來,一直被用作Ⅱ型糖尿病的常用藥物[5]。常壓室溫等離子體(atmospheric pressure room temperature plasma,ARTP)作為一種新型的高效誘變技術(shù),具有突變效率高、突變譜圖廣、操作簡單、且安全無污染等特點,是現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)中選育優(yōu)勢突變菌株和構(gòu)建高附加值微生物細(xì)胞工廠的有效方法之一[6-7]。但是,由于突變的方向具有不確定性,如何快速、高效的從數(shù)以萬計的突變子文庫中篩選得到陽性菌株至關(guān)重要,因此建立阿卡波糖高通量篩選方法是十分必要的。

目前針對于放線菌突變菌株的篩選方法,常用的是基于理化性質(zhì)的篩選方法,比如利用抑菌圈或抗性進(jìn)行初篩,然后再進(jìn)行搖瓶發(fā)酵[8],并利用HPLC對其進(jìn)行定量分析,比較費時費力,且無法實現(xiàn)對大量突變株文庫進(jìn)行分離篩選[9]。由于阿卡波糖不具有抑菌能力,單純依靠抗性初篩并不能達(dá)到較高篩選效果,而對所有突變菌均進(jìn)行HPLC檢測工作量大效率低。而以微孔板作為載體的高通量篩選技術(shù),目前在放線菌生物活性物質(zhì)的篩選、菌種篩選以及新藥的研發(fā)[10-13]等方面得到廣泛應(yīng)用。近些年,α-淀粉酶抑制劑篩選的碘-淀粉比色法[14]、3,5-二硝基水楊酸(3, 5-dinitrosalicylic acid,DNS)[15]、電泳法[16],以及微量板篩選方法[17]在產(chǎn)阿卡波糖菌株的篩選中相繼得到運用[18-20]。與其他方法相比較,微量孔板篩選一次可以實現(xiàn)對大批量樣品同時檢測,高效便捷,大大節(jié)約了菌株選育的時間成本以及經(jīng)濟(jì)成本。當(dāng)前,多孔板培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)在微生物學(xué)領(lǐng)域得到了成功的應(yīng)用,相對于傳統(tǒng)搖瓶培養(yǎng),該技術(shù)具有高平行度,高效率,低工作量,低消耗等優(yōu)勢[21-22]。將多孔板培養(yǎng)與微量板篩選技術(shù)相結(jié)合,可以從培養(yǎng)檢測雙方面來節(jié)省人力和時間,大大提高工作效率。

本研究采用新型ARTP育種方法[23-25]誘變阿卡波糖產(chǎn)生菌游動放線菌,建立多孔板發(fā)酵結(jié)合酶標(biāo)儀檢測的高通量篩選模型,并在孔板中對種子培養(yǎng)基和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行組合式優(yōu)化,以提高孔板發(fā)酵效率,為后續(xù)利用孔板發(fā)酵快速篩選阿卡波糖高產(chǎn)菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

游動放線菌(Actinoplanessp.SE50)實驗室保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

分離、斜面培養(yǎng)基(g/L):蔗糖30、蛋白胨5、L-酪氨酸1、KCl 0.5、MgSO4·7H2O 0.5、K2HPO4·3H2O 1、瓊脂18,pH 7.0～7.3。

種子培養(yǎng)基(g/L):黃豆餅粉40、丙三醇20、玉米淀粉10、碳酸鈣2,pH 6.4～7.0。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖23、麥芽糖96、黃豆餅粉10、CaCl23.5、谷氨酸鈉5、K2HPO4·3H2O 1、丙三醇5、碳酸鈣3、FeCl3·6H2O 0.5,pH 6.4～6.7。

24孔板發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):黃豆餅粉30、丙三醇15、碳酸鈣4、玉米淀粉10、葡萄糖23、麥芽糖96、CaCl23.5、谷氨酸鈉5、K2HPO4·3H2O 1、FeCl3·6H2O 0.5,pH 6.4～6.7。

1.2 阿卡波糖快速檢測方法的建立

1.2.1 阿卡波糖測定原理

2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麥芽糖苷(2-chloro-4-nitrophenyl-α-galactopyranosylmaltoside,Gal-G2-α-CNP)作為測定淀粉酶活力的常用試劑,可以被α-淀粉酶水解為兩部分且無副產(chǎn)物生成,其中水解產(chǎn)物2-氯-4-硝基苯酚(2-chloro-4-nitrophenol,CNP)在特定波長具有特征吸收峰,該過程不需要任何的輔助因子參與[17]。

阿卡波糖能夠與淀粉酶產(chǎn)生競爭性結(jié)合作用,從而阻礙淀粉酶與底物的正常結(jié)合,抑制產(chǎn)物生成。利用這一原理,建立了底物-酶-抑制劑篩選模型。

1.2.2 CNP檢測波長的選擇

取適量0.10 mmol/L的CNP標(biāo)準(zhǔn)溶液,全波長掃描測定最大吸收峰波長。

對該酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物以及不添加淀粉酶添加檢測樣品阿卡波糖的體系進(jìn)行全波長掃描,以pH 6.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液作為參比,確定產(chǎn)物的最佳檢測波長,以排除反應(yīng)體系中其他物質(zhì)的干擾。

1.2.3 不同pH下CNP標(biāo)準(zhǔn)曲線

由于CNP的摩爾消光系數(shù)(ε)隨溶液pH變化很大,為確定酶促反應(yīng)產(chǎn)物的最佳檢測pH范圍,測定了pH 2.2、3.0、4.8、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0條件下不同濃度CNP的顯色情況。

1.2.4 最適反應(yīng)條件的優(yōu)化

由于溫度、pH、反應(yīng)時間等是酶催化反應(yīng)的重要影響因素,為了保證α-淀粉酶活力發(fā)揮到最大,分別對這3個因素進(jìn)行了考察。

基于CNP在不同pH條件下吸光度穩(wěn)定性,所選反應(yīng)體系磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液pH區(qū)間為5.0～7.5。按照200 μL反應(yīng)體系,在96孔板內(nèi)依次加入pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液130 μL,5 mmol/L Gal-G2-α-CNP溶液40 μL,10 U/mL α-淀粉酶溶液30 μL,反應(yīng)每隔10 min用酶標(biāo)儀檢測一次,直至反應(yīng)趨于穩(wěn)定,以確定最佳反應(yīng)pH及時間。在最佳pH和時間下分別在26、28、30、32、34、36 ℃反應(yīng),以確定酶促反應(yīng)最佳溫度。

1.3 阿卡波糖快速檢測方法的優(yōu)化

1.3.1 酶催化反應(yīng)比例的優(yōu)化

取5 mmol/L的Gal-G2-α-CNP溶液10、20、30、40、50 μL,分別加入10 U/mL α-淀粉酶溶液10、20、30、40、50、60、70、80 μL,pH 6.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液稀釋到200 μL,搖勻。以緩沖液為空白參比,30 ℃反應(yīng)50 min后,在最佳檢測波長處檢測吸光度,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線以確定中Gal-G2-α-CNP溶液添加量。

1.3.2 檢測樣品阿卡波糖添加量的確定

在200 μL反應(yīng)體系中,通過調(diào)節(jié)緩沖溶液體積,分別加入0.1 g/L的阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)溶液10、20、30、40、50、60 μL,30 ℃反應(yīng)50 min后酶標(biāo)儀檢測,確定反應(yīng)體系中抑制劑的最優(yōu)添加量。

1.3.3 抑制曲線的建立

在最適反應(yīng)體系要求下按序加入緩沖液、底物Gal-G2-α-CNP、不同濃度的抑制劑阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)溶液及α-淀粉酶溶液,在最優(yōu)情況下反應(yīng)完成后,酶標(biāo)儀測定其OD值。以未添加阿卡波糖溶劑為對照,計算各濃度阿卡波糖下抑制率。抑制率計算如公式(1)所示:

(1)

式中:A0為未添加阿卡波糖時反應(yīng)體系的OD值;A1為添加阿卡波糖后反應(yīng)體系的OD值。

以阿卡波糖濃度為橫坐標(biāo),抑制率為縱坐標(biāo)構(gòu)建抑制曲線。

1.3.4 加標(biāo)回收試驗

取已知濃度的抑制劑阿卡波糖溶液,按優(yōu)化后方法進(jìn)行反應(yīng),酶標(biāo)儀測定吸光值,計算回收率。

1.3.5 酶標(biāo)儀與HPLC方法檢測阿卡波糖的擬合驗證

分別采用酶標(biāo)儀及HPLC法檢測ARTP誘變所得突變株經(jīng)孔板發(fā)酵的阿卡波糖效價,并采用Origin軟件分析兩種方法檢測結(jié)果擬合曲線。

1.4 孔板發(fā)酵

1.4.1 孔板類型選擇及優(yōu)化

隨機(jī)足量不同菌株進(jìn)行24、48孔板與搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量相關(guān)性比對,篩選出較適宜高通量篩選的孔板結(jié)構(gòu)類型。并對所選孔板發(fā)酵培養(yǎng)基中黃豆餅粉、丙三醇(甘油)、碳酸鈣含量進(jìn)行正交優(yōu)化。

1.4.2 孔板孔間差異考察

采用同一菌株的孔板發(fā)酵檢測產(chǎn)量,考察孔板孔間差異大小。

1.4.3 孔板發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

為減少種子培養(yǎng)過程,節(jié)約篩選時間及工作量,采用平板菌落直接發(fā)酵的方法,對種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基差異成分進(jìn)行整合分析和正交優(yōu)化,得出最佳孔板發(fā)酵條件,并對孔板發(fā)酵過程進(jìn)行考察。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿卡波糖快速檢測方法的建立

2.1.1 CNP檢測波長及pH測定范圍的選擇

為了確定生成產(chǎn)物CNP的最適吸收波長,如圖1-a所示,對CNP標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行全波長檢測,發(fā)現(xiàn)CNP最大吸收波長為398 nm。同時,對該酶催化反應(yīng)體系進(jìn)行全波長掃描結(jié)果顯示(圖1-b),其在398 nm處也表現(xiàn)出特征吸收峰,可見該酶促反應(yīng)特異性生成CNP。底物Gal-G2-α-CNP與待檢測樣品混合物(不加α-淀粉酶溶液)掃描結(jié)果顯示(圖1-b),其在398 nm處無吸收,因此可排除其檢測干擾。

a-CNP (0.10 mmol/L)全波長掃描;b-酶促反應(yīng)體系掃描曲線及底物Gal-G2-α-CNP與待檢測樣品混合物(不加α-淀粉酶溶液)掃描曲線;c-不同pH條件下CNP的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖1 CNP全波長掃描及pH對吸光度影響Fig.1 CNP full-wavelength scanning and the effect of pH on absorbance

pH對CNP的摩爾吸光系數(shù)ε影響顯著[17]。本研究測定了pH 2.2～8.0的不同濃度CNP的顯色情況,并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)pH值低于3.0時,與對照緩沖液相比,無明顯吸收。當(dāng)pH值為4.8～8.0時,結(jié)果如圖1-c所示。當(dāng)pH值處于6.0以下,pH增大,CNP在398 nm處吸光度也明顯增加;當(dāng)pH值達(dá)到6.0以上,CNP的吸光度基本穩(wěn)定,且與濃度之間有良好的相關(guān)性。

2.1.2 CNP檢測波長及pH測定范圍的選擇

pH以及溫度會影響酶促反應(yīng),通過優(yōu)化反應(yīng)的pH以及溫度表明(圖2),在pH值為6.5、溫度為30 ℃時,反應(yīng)效果最好。且由圖2-a可知,反應(yīng)在50 min 后吸光度基本穩(wěn)定。因此在后續(xù)實驗中以pH 6.5、30 ℃反應(yīng)50 min為最佳條件。

a-不同pH條件下反應(yīng)體系進(jìn)程曲線;b-不同反應(yīng)溫度對吸光度的影響圖2 pH、溫度及反應(yīng)時間對反應(yīng)的影響Fig.2 Effects of pH, temperature and reaction time on enzyme-catalyzed reaction

2.2 阿卡波糖快速檢測方法的優(yōu)化

2.2.1 底物Gal-G2-α-CNP溶液添加量及阿卡波糖溶液添加量的優(yōu)化

通過優(yōu)化底物Gal-G2-α-CNP溶液添加量發(fā)現(xiàn)(圖3-a),在200 μL體系中,當(dāng)α-淀粉酶濃度在0.5～4.0 U/mL,底物Gal-G2-α-CNP溶液添加量低于30 μL時,吸光度變化明顯;底物Gal-G2-α-CNP溶液添加量高于30 μL時,吸光度相當(dāng)穩(wěn)定,且在底物添加量為40 μL時,線性關(guān)系最好,線性方程為y=0.671 14x+0.125 68(R2=0.999 93)。分析原因可能是由于α-淀粉酶的量不足以完全催化Gal-G2-α-CNP反應(yīng)形成CNP,所以底物必須過飽和。故每200 μL體系中,選擇5 mmol/L Gal-G2-α-CNP 40 μL、10 U/mL α-淀粉酶溶液30 μL為最佳反應(yīng)比例。

a-Gal-G2-α-CNP添加量對吸光度的影響;b-不同阿卡波糖添加體積下進(jìn)程曲線圖3 Gal-G2-α-CNP及阿卡波糖添加量對反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of Gal-G2-α-CNP and acarbose addition on the reaction

通過分析阿卡波糖檢測閾值發(fā)現(xiàn),向200 μL體系分別添加10、20、30、40、50、60 μL阿卡波糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的結(jié)果如圖3-b所示。當(dāng)阿卡波糖添加量在10～30 μL時,反應(yīng)后體系的吸光度值波動較大;當(dāng)阿卡波糖添加量大于30 μL時,吸光度波動相對較小,且添加40 μL 阿卡波糖時,反應(yīng)后期吸光度更穩(wěn)定。故檢測樣品阿卡波糖添加量為40 μL。

綜上,阿卡波糖快速檢測方法反應(yīng)體系為40 μL 5 mmol/L Gal-G2-α-CNP溶液、30 μL 10 U/mL α-淀粉酶溶液、40 μL檢測樣品及90 μL pH 6.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液,30 ℃反應(yīng)50 min于398 nm波長處檢測。

2.2.2 抑制率曲線的建立及擬合驗證

根據(jù)上述優(yōu)化的反應(yīng)體系及抑制率計算公式,經(jīng)多次實驗測定,對結(jié)果進(jìn)行非線性擬合,得到如圖4-a所示標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=106.491 12+13.747 75 ln(x-0.004 85),R2=0.999 31。

為驗證試樣前處理過程對結(jié)果測定是否有影響,以及在測定過程中有無基體構(gòu)成干擾,需做加標(biāo)回收實驗。由表1可知,回收率在98%～102%,平均回收率為100.126 277%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為1.446 613%。由實驗結(jié)果中顯示的酶標(biāo)儀測定阿卡波糖加樣回收率,可得出實驗過程中幾乎可忽略前處理過程及水溶液基體對樣品測定的影響。

表1 加標(biāo)回收率Table 1 Recovery rate of standard addition

該方法的合理性可以通過與HPLC測定數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析得到證實。相關(guān)系數(shù)分析的正絕對值和正負(fù)分別代表著相關(guān)強(qiáng)度與方向。在文獻(xiàn)中,統(tǒng)計學(xué)家給出了一個確定相關(guān)強(qiáng)度大小的指標(biāo),R2=0.7為一個相對較高的相關(guān)系數(shù)[26]。由圖4-b可知,擬合曲線的相關(guān)值R2=0.896 29,這表明酶標(biāo)儀與HPLC法測定發(fā)酵液中阿卡波糖產(chǎn)量具有很好的相關(guān)性,在具有較多發(fā)酵樣品時,可以采用酶標(biāo)儀來快速、高效測定。

2.3 孔板發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 孔板類型的選擇

為了能更省時省力地進(jìn)行大批量的菌株選育,本研究隨機(jī)挑選了30株不同性狀的游動放線菌,在24孔和48孔板中進(jìn)行發(fā)酵,并與搖瓶培養(yǎng)產(chǎn)量之間進(jìn)行相關(guān)性分析對比,選擇出更合適的板型進(jìn)行高通量篩選,結(jié)果見圖5。

a-突變株24孔板與搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量之間的相關(guān)性;b-突變株48孔板與搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量之間的相關(guān)性圖5 24、48孔板與搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量之間的相關(guān)性擬合Fig.5 Correlation fitting between 24,48-microwell plates and fermentation yield in shaking flask

由圖5可知,24孔板與搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量的相關(guān)性系數(shù)(R2)高于48孔板(0.881 61>0.833 74),因此24孔板發(fā)酵產(chǎn)量與搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量更接近,原因可能與溶氧量有關(guān)。因此選擇24孔板發(fā)酵來達(dá)到快速篩選要求。

2.3.2 孔間差異對于阿卡波糖發(fā)酵的影響

根據(jù)文獻(xiàn)報道,部分菌種進(jìn)行孔板發(fā)酵結(jié)果存在孔間差異[27]。為避免存在孔間差異對后續(xù)篩選結(jié)果造成干擾,本實驗采用同一菌株對24孔板發(fā)酵孔間差異特性進(jìn)行了檢驗。結(jié)果如圖6-b所示,阿卡波糖產(chǎn)量中間孔1區(qū)<長邊緣孔2區(qū)<短邊緣孔3區(qū)(圖6-a),這種邊緣效應(yīng)可能與溶氧量或孔間水分蒸發(fā)分布不均有關(guān)。參考文獻(xiàn)[27],后續(xù)考慮通過在邊緣孔位置填充2 mL培養(yǎng)基或無菌水來有效減少邊緣效應(yīng)產(chǎn)生的影響。對此進(jìn)行實驗驗證,結(jié)果如表2所示,在P=0.05顯著水平下,此種方法下中間孔孔間差異不顯著。

表2 中間孔孔間差t檢驗Table 2 t-test of the difference between intermediate holes

a-24孔板位置示意圖;b-24孔板不同區(qū)域阿卡波糖產(chǎn)量圖6 孔板不同區(qū)域阿卡波糖產(chǎn)量Fig.6 Acarbose yield in different regions of orifice plate注:不同小寫字母表示不同類型孔間存在顯著性差異(P<0.05)。

2.3.3 孔板發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

為減少篩選過程工作量及時間,本實驗將種子液培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)過程進(jìn)行了整合,采取直接挑菌進(jìn)行孔板發(fā)酵的方式。為保證孔板發(fā)酵培養(yǎng)保留有種子培養(yǎng)基的擴(kuò)培作用和發(fā)酵培養(yǎng)基對產(chǎn)物合成作用,綜合對比分析了種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基成分差異。本實驗采用L9(34)正交試驗設(shè)計方法對黃豆餅粉、丙三醇(甘油)、碳酸鈣3種因素進(jìn)行考察(表3)。

表3 因素水平表Table 3 Factor level table

24孔板發(fā)酵結(jié)果分析如表4、表5所示,由實驗結(jié)果極差分析可知,黃豆餅粉對游動放線菌產(chǎn)阿卡波糖發(fā)酵水平的影響大于甘油大于碳酸鈣(A>B>C),且A(黃豆餅粉)影響顯著。通過正交試驗得出的最優(yōu)組為試驗4,而直觀分析得出的最優(yōu)組為A2B2C2,按照試驗組4、A2B2C2條件進(jìn)行發(fā)酵,以原始培養(yǎng)基發(fā)酵為對照,對3組實驗結(jié)果進(jìn)行對比,得出阿卡波糖發(fā)酵產(chǎn)量A2B2C2>試驗組4>對照組,試驗組A2B2C2條件下,阿卡波糖產(chǎn)量為(2 183.66±6.60) μg/mL,比對照組(1 744.13±72.13) μg/mL提高了25.2%。因此最后得出24孔板發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)結(jié)果為黃豆餅粉3%,甘油1.5%,碳酸鈣0.4%。

表4 孔板發(fā)酵優(yōu)化結(jié)果與分析Table 4 Optimization results and analysis of pore plate fermentation

表5 孔板發(fā)酵優(yōu)化結(jié)果方差分析Table 5 Analysis of variance of optimization results of pore plate fermentation

通過每隔12 h取樣分析得到平板菌落直接接種24孔板發(fā)酵過程菌體生長體積分?jǐn)?shù)及阿卡波糖合成的代謝變化曲線如圖7所示,從曲線可以看出,36 h以后菌體進(jìn)入快速生長階段,48 h以后,伴隨著菌體的生長,阿卡波糖的生成迅速增加,168 h時,產(chǎn)量達(dá)到最高,延長發(fā)酵時間,產(chǎn)量會有所下降,因此選擇168 h為最佳發(fā)酵時間。

圖7 孔板發(fā)酵過程菌體生長體積分?jǐn)?shù)及阿卡波糖產(chǎn)量變化Fig.7 Changes of bacterial growth volume fraction and acarbose yield during orifice plate fermentation

3 結(jié)論與討論

高產(chǎn)突變株的篩選是菌株選育的關(guān)鍵步驟,高效、準(zhǔn)確篩選方法的選擇尤為重要。近些年來高通量篩選方法研究廣泛涉及各個方面,JOHN等[28]研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒桿菌在微孔板、搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)的生長參數(shù)具有良好的一致性;欒書慧等[29]通過ARTP誘變技術(shù)結(jié)合24深孔板發(fā)酵及以線黑粉酵母為指示菌的高通量生物測定篩選技術(shù),篩選得到兩株安絲菌素P-3產(chǎn)量穩(wěn)定提高15%的高產(chǎn)突變株;YU等[23]采用孔板發(fā)酵/酶標(biāo)儀(臺盼藍(lán)分光光度法)高通量復(fù)篩的策略篩選得到一株新霉素產(chǎn)量提高40%的高產(chǎn)突變株。由于孔板裝液量少,在大批量篩選菌株時,不僅可以節(jié)約工作量,還可以有效較少大量篩選所耗費的試劑成本。目前文獻(xiàn)報道的阿卡波糖高產(chǎn)菌株選育[9,30]基本采用的都是通過搖瓶發(fā)酵液相檢測,工作量大且時耗較長,本研究將酶標(biāo)儀檢測與孔板發(fā)酵相結(jié)合,可以很好的解決這個問題。

本文基于酶標(biāo)儀檢測方法,建立了結(jié)合孔板發(fā)酵的高通量選育模型。通過比較分析選擇24孔板發(fā)酵代替?zhèn)鹘y(tǒng)的搖瓶發(fā)酵,并對孔板發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,確定平板菌落直接24孔板發(fā)酵法采用的培養(yǎng)基中黃豆餅粉、甘油、碳酸鈣3種成分的添加量需在原始發(fā)酵培養(yǎng)基上分別改為3%、1.5%和0.4%,并對此發(fā)酵過程進(jìn)行了考察,發(fā)酵在168 h時,阿卡波糖產(chǎn)量達(dá)到最高,故以168 h作為最佳發(fā)酵時長。