谷氨酰胺轉氨酶對黑小麥粉面團理化特性的影響

陳圓圓,蔣文靜,趙祎,任元元,曾卓華,劉麗,劉偉,鐘耕,4*

1(西南大學 食品科學學院,重慶,400715)2(四川省食品發酵工業研究設計院有限公司,四川 成都,611130) 3(重慶市農業技術推廣總站,重慶,400020)4(川渝共建特色食品重慶市重點實驗室,重慶,400716)

黑小麥(TriticumaestivumL.)是指籽粒顏色較深,呈紫、藍、紫藍和紫黑等顏色小麥類作物的統稱,由黑麥和普通小麥雜交而得。與普通小麥相比,黑小麥的營養價值更高,含有更豐富的賴氨酸、微量營養素和花色苷、總酚、總黃酮、二十八烷醇、阿魏酸、戊聚糖等多種生物活性物質,具有降血壓、防治糖尿病、預防癌癥、延緩衰老等功能[1]。且黑小麥富含的膳食纖維比普通小麥高14.3%,在預防腸道疾病、控制體重、降低血清膽固醇等方面有很高應用價值[1]。黑小麥是重要的天然黑色谷物資源,具有巨大的產品開發潛力,符合未來食品發展趨勢。目前國內外對黑小麥的研究主要集中在育種栽培及籽粒營養價值方面,而對其產后加工和產品研發方面的研究很少[1-3]。由于黑小麥粉面筋蛋白強度較低且存在大量膳食纖維,致使黑小麥加工產品的開發受到限制[1]。

谷氨酰胺轉氨酶(glutamine transaminase, TG)是一種催化?；D移的酶,能催化蛋白質及肽和各種伯胺之間產生交聯,可有效改善面團流變學特性,提升加工性能[4]。當蛋白質或肽鍵中賴氨酸殘基的ε-氨基作為?；荏w,TG能催化賴氨酸殘基上的ε-氨基和谷氨酰胺殘基上的γ-羥酰氨基聚合交聯,形成蛋白質分子間和分子內的ε-(γ-谷氨酰)賴氨酸異肽鍵,因此可改善蛋白質結構和功能,提升面團加工性能和產品品質[5-6]。YANG等[7]研究TG對富含纖維面條品質的影響結果表明,TG能促進蛋白質交聯,提升面條質構和感官性能,降低蒸煮損失,改善面條微觀結構。王佳玉等[8]研究TG對全麥粉面團拉伸和流變特性的影響結果表明,TG能增大全麥粉面團拉伸阻力,增加儲能模量(G′)和損耗模量(G″),并證實TG誘導蛋白質分子交聯,增強全麥粉面團強度。KANG等[9]研究TG及冷藏對全麥粉面團理化性質的影響發現,TG不僅影響全麥粉面團組成,還影響面條理化性質。夏明敬[10]研究發現,TG能增大藜麥-小麥混合粉吸水率,延長穩定時間,且能增大混合體系糊化黏度,抑制面包老化。

已有研究探討TG對全麥粉[8]、燕麥粉[11]、藜麥粉及小麥粉[10]面團特性的影響,其改善面筋蛋白,提升面團理化性質及加工產品品質的作用受到國內外學者廣泛關注。但關于TG能否有效改善黑小麥粉面團面筋蛋白強度及提升面團理化性質的研究報道很少。因此本文著重探討TG對黑小麥粉面團物理特性包括糊化特性、熱機械學特性、流變學特性和拉伸特性的影響,并從化學性質如蛋白質二級結構、巰基與二硫鍵的變化以及微觀結構給予解釋。旨在為開發黑小麥食品、提高其食用品質提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑小麥粉,優麥鮮(重慶)面業有限公司,經檢測黑小麥粉主要成分為水分[(13.40±0.05)%],濕面筋[(23.07±0.16)%],灰分[(1.06±0.01)%](干基計,后同),脂肪[(2.61±0.23)%],蛋白質[(13.07±0.14)%],淀粉[(58.52±0.52)%],花青素[(2.17±0.11) mg/100 g],多酚[(21.18±0.19) mg/g],膳食纖維[(6.42±0.29)%],戊聚糖[(1.33±0.00)%]。

TG(300 U/g,食品級),泰興市東圣生物科技有限公司;所用其余化學試劑均為國產分析純;所用水均為純水。

1.2 儀器與設備

RVA-Tec Master快速黏度分析儀,瑞典波通儀器公司;Mixolab混合實驗儀,法國肖邦公司;DHR-1流變儀,美國TA公司;TA.xt plus質構儀,英國Stable Micro Systems公司;Phenom臺式掃描電鏡,荷蘭Phenom公司;Spectrum 100傅里葉變換紅外光譜儀,美國Perkin Elmer股份有限公司;CHA-B水浴恒溫振蕩器,常州亞特實驗儀器有限公司;QL-861渦旋混合器,海門市齊林貝爾儀器制造有限公司;MC 759紫外可見分光光度計,上海菁華科技儀器有限公司;5804 R離心機,德國Eppendorf公司;SY-10真空冷凍干燥機,北京松源華興科技發展有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 混合粉及面團的制備

黑小麥粉中分別添加0%、0.2%、0.5%、0.8%、1.1%、1.4%(質量分數)TG,混勻制備成混合粉。分別稱取混合粉100 g,緩慢加入40 ℃溫水,加水量以混合實驗儀測得各自最佳吸水率計,攪拌和面10 min,取出面團用保鮮膜包裹靜置30 min,待測。

1.3.2 混合粉糊化特性測定

參考GB/T 24853—2010《小麥、黑麥及其粉類和淀粉糊化特性測定快速粘度儀法》,將3.49 g混合粉和25 mL水轉移至干燥潔凈樣品筒,快速攪拌分散,使用快速黏度分析儀(rapid visco analyzer, RVA)測定其成糊特性。

1.3.3 面團熱機械學特性測定

參考MOZA等[12]的方法并適當修改。采用Mixolab混合實驗儀,選擇Chopin+標準協議模式,和面轉速保持80 r/min,調整混合粉重量和加水量使目標扭矩C 1值保持在(1.10±0.05) N·m,面團重量默認75 g,水分基準默認濕基14%,水箱溫度為30 ℃。測定黑小麥粉吸水率、形成時間、回生值等指標。

1.3.4 面團動態流變學特性測定

參考LI等[13]的方法并適當修改。采用PP 25圓形檢測探頭,間距設置2 mm,取1.3.1節制備的面團中心樣品約3 g平鋪于流變儀載物臺,將探頭降至預設間距,刮除溢出圓形檢測探頭外多余樣品,并在面團邊緣覆蓋二甲基硅油防止實驗過程中面團邊緣水分蒸發。設定平衡時間5 min以消除殘存應力,溫度25 ℃,應變振幅0.1%,每數量級點數取5,在0.1～20 Hz掃描頻率范圍進行頻率掃描。

1.3.5 面團拉伸特性測定

參考LIU等[14]的方法并稍作改動。取1.3.1節制備的面團樣品約30 g,置于質構儀面團制備槽,壓制形成60 mm×2 mm面團條,將面團條置于質構儀測試區域內,用A/KIE探頭立即測定。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜測定

參考楊明柳等[5]的方法并適當修改。將1.3.1面團樣品真空冷凍干燥,研磨過200目篩以備用,取約100 mg凍干樣品粉末置于傅里葉變換紅外光譜儀平臺,采用反射掃描模式,用空氣做背景掃描。用OMNIC 8.2軟件對酰胺I區進行傅里葉自去卷積,再用Peak Fit 4.0軟件進行二階求導,作高斯曲線擬合。根據各吸收峰的位置及面積計算蛋白質二級結構各組分所占比例。

1.3.7 巰基與二硫鍵的測定

將1.3.1節面團樣品真空冷凍干燥,研磨過200目篩以備用。取150 mg凍干樣品粉末,參考YANG等[7]的方法測定巰基與二硫鍵的含量。

1.3.8 掃描電子顯微鏡觀察

參考LI等[13]的方法并適當修改。將1.3.1節制備的面團切成長約20 mm×3 mm×3 mm的長方體樣品,放入-40 ℃冰箱12 h,取出立即真空冷凍干燥(-70 ℃)12 h以上,直至冷凍干燥完全。將凍干樣品自然掰斷,斷面向上,用導電膠將觀察樣品黏在金屬圓盤上,真空條件鍍金處理,將圓盤放入掃描電鏡觀察艙,電壓設定10 kV,放大倍數2 000倍,觀察樣品斷面表面結構并拍照。

1.4 數據分析

實驗結果以平均值±標準偏差表示。利用IBM SPSS Statistics 22.0軟件對實驗數據進行方差(ANOVA)分析,采用Waller-Duncan檢驗,P<0.05表示差異顯著。采用Origin 2018軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 TG對黑小麥粉糊化特性的影響

淀粉糊化是淀粉分子膨脹分散在水中形成膠體溶液的過程,伴隨著淀粉分子間氫鍵的斷裂。如表1所示,黑小麥粉的峰值黏度、最低黏度均隨TG添加量的增加呈先增后減的趨勢,分別在TG添加量為1.1%、0.8%時達到最大值,與TG添加量0%相比,分別增大了5.41%、6.01%;最終黏度隨TG添加量的增加呈上升趨勢。這與王佳玉等[8]研究結果相似。黏度的增加可能是由于TG的加入促進蛋白質交聯聚集,使游離于面筋蛋白結構外可糊化的淀粉總量增加[8]。但過量TG造成蛋白質分子過度交聯聚集,在面筋蛋白與淀粉粒的競爭吸水中導致淀粉粒有效吸水分子減少,部分淀粉顆粒膨脹破裂,淀粉間氫鍵斷裂,加熱糊化時流動阻力變小,致使黏度開始下降[15]。衰減值可反映淀粉的耐剪切性,其值越低,淀粉耐剪切性越強[16]。隨TG添加量的增加,黑小麥粉衰減值呈先減小后增大的趨勢,說明少量TG的加入會增強淀粉顆粒的耐剪切性,但較多TG會間接導致淀粉粒有效吸水分子減少,淀粉分子崩解與氫鍵斷裂,抗機械剪切力減弱。隨TG添加量的增加,黑小麥粉峰值時間和糊化溫度變化趨勢不明顯,但都比TG添加量為0%時大,TG促進蛋白質分子交聯聚集,蛋白之間結合更緊密,面團結構變得更緊密,使峰值時間和糊化溫度變高。因此,在黑小麥粉中添加適量TG,會使黑小麥粉淀粉體系黏度間接增大、峰值時間和糊化溫度變高,衰減值降低,黑小麥粉淀粉糊化特性得到提升。夏明敬[10]在研究TG對藜麥-小麥粉面團的影響結果也表明,TG通過影響蛋白及蛋白與淀粉間的相互作用而間接影響淀粉糊化特性。

2.2 TG對黑小麥粉面團熱機械學特性的影響

黑小麥粉在混合實驗儀的變溫與揉混雙重作用下形成黑小麥粉面團,面粉水合形成面團本質是面筋蛋白質吸水形成面筋網絡結構的過程[8]。由表2可知,黑小麥粉面團吸水率隨TG添加量的增加而逐漸降低。吸水率的降低可能是由于在面筋蛋白吸水過程中,水分子與氨基酸殘基等親水基團結合,而TG作用于蛋白質使面筋蛋白相互交聯,肽鏈氨基酸殘基相互交聯,因此肽鏈上氨基酸親水性殘基數量減少,面團吸水率下降,有利于強化面筋網絡結構[17-18]。黑小麥粉面團形成時間與穩定時間隨TG添加量的增加先增大后減小,且均在TG添加量為1.1%時達到最大值,與TG添加量0%相比,分別增大了326.27%、16.84%,表明添加TG使黑小麥粉面團穩定性與面筋強度上升,強化了面筋蛋白結構,這與李鑫等[19]研究結果一致。這是因為TG促進蛋白質分子發生交聯及聚集,使面筋蛋白之間結合更加緊密,增強二硫鍵穩定性,延緩面筋網絡形成,延長面團吸水過程,從而延長面團形成時間與穩定時間[16]。但當TG添加量為1.4%時,面團形成時間與穩定時間開始降低,這是由于TG添加量過多致蛋白質分子過度交聯聚集,反而不利于面筋蛋白整體形成穩定緊密的結構。隨TG添加量的增加,黑小麥粉面團峰值扭矩與最大黏度值呈先升后降的趨勢,且均在TG添加量為1.1%時達到最大值,與TG添加量0%相比,分別增加了14.45%、12.90%,表明添加TG增大了黑小麥粉面團黏度,與上述表1中TG對黑小麥粉黏度的影響結果一致。蛋白質弱化度可反映面筋強度,其值越低,代表面筋強度越強[15]。TG的加入降低了黑小麥粉面團蛋白質弱化度,當TG添加量為1.1%時有最低值0.56 N·m,與TG添加量0%(0.65 N·m)相比,蛋白質弱化度降低了13.85%,增強了面團筋力,使面筋網絡結構更牢固,面團加工性能更好?；厣蹬c淀粉重排有關,反映淀粉老化程度和產品貨架期,理論上其值越低,淀粉越不易老化,產品貨架期越長[16]。TG的加入增強了面筋網絡結構,降低了淀粉分子發生重排的速率,導致回升值降低,其中TG添加量為1.1%時回升值達到最低值0.83 N·m,與TG添加量0%(1.04 N·m)相比降低了20.19%,有利于延緩淀粉老化與延長產品貨架期。綜合來看,TG的加入提升了黑小麥粉面團熱機械學特性,其中TG添加量為1.1%時提升效果最顯著。

表2 TG對黑小麥粉面團熱機械學特性的影響Table 2 Effect of TG on thermo-mechanical properties of black wheat dough

2.3 TG對黑小麥粉面團動態流變學特性的影響

G′,又稱彈性模量,代表物體在受到外力作用時的變形程度,G′越大,物體受外力時變形越小,彈性越好;G″,又稱黏性模量,代表物體在受到外力作用時抵抗流動的能力,G″越大,物體受外力時越不易流動,黏性越強。由圖1可知,不同TG添加量的黑小麥粉面團G′和G″均隨掃描頻率的增加而增大,即所有樣品的G′和G″均表現出頻率依賴性,面團表現為弱凝膠流變學體系[20]。且隨頻率的增加,所有面團樣品的G′始終高于G″,表明各面團彈性性質占優勢,具有典型黏彈性。同一頻率下,與TG添加量0%相比,TG的加入增大了黑小麥粉面團的G′和G″,這與KANG等[9]研究結果一致。且隨TG添加量的增大,G′和G″均呈先升后降的趨勢,在TG添加量為0.8%時黑小麥粉面團具有最高的G′和G″,這表明TG可明顯提高黑小麥粉面團黏彈性,可能是因為TG促進黑小麥粉面團中蛋白質分子交聯聚集,增強面團強度,改善面筋網絡結構[21],一定程度上減小了黑小麥粉中纖維對蛋白質分子交聯和面筋網絡對淀粉顆粒包裹的干擾作用,從而使以蛋白質和淀粉為基質形成的黑小麥粉面團黏彈性增加[16]。但添加過量TG會導致蛋白質過度交聯聚集,部分淀粉顆粒被迫溶出,不利于面筋網絡結構的整體強度與緊密性,黏彈性有所下降。BAUER等[22]研究結果也表明,添加TG使小麥粉面團黏彈性與強度增大,但添加量過高會致面團面筋網絡結構喪失,加工性能變差,產品品質降低。因此,在實際生產中,選擇合適添加量TG可顯著提高黑小麥粉面團黏彈性,增強面團強度。

a-儲能模量(G′);b-損耗模量(G″);c-耗損角正切值(tan δ)圖1 TG對黑小麥粉面團儲能模量(G′)、損耗模量(G″)、耗損角正切值(tan δ)的影響Fig.1 The influence of TG on storage modulus (G′), loss modulus (G″), and loss tangent (tan δ) of black wheat dough

損耗角正切tanδ=G″/G′,即面團中黏性模量與彈性模量的比例,tanδ越小,表明黑小麥粉面團中高聚物數量越多或分子聚合度越大,面團強度越大,可反映面團綜合黏彈性[23]。由圖1可知,tanδ<1,且隨頻率的增加,所有面團樣品的tanδ均先迅速減小后緩慢增加,這可能是因為在面團形成前期黑小麥粉中的纖維阻礙了面筋網絡結構的形成,致面團穩定性差,在受到外力時越易流動,面團黏性小;在達到一定頻率時,面筋蛋白緩慢聚集形成緊密的空間結構,逐漸減小纖維對面團強度的影響,面團黏性增大[16]。在同一掃描頻率下,與TG添加量0%相比,TG的加入降低了黑小麥粉面團的tanδ,且在TG添加量為0.8%時達到最低值,這正是由于TG的加入促進黑小麥粉面團中蛋白質分子間交聯形成大聚體,使高聚物數量增多,分子聚合度增大,綜合黏彈性增大,面團強度增強。

2.4 TG對黑小麥粉面團拉伸特性的影響

拉伸能量代表面團筋力;拉伸阻力代表面團強度;延展度反映面團的延伸性與可塑性;拉伸比是拉伸阻力與延展度的比值,其值越高代表面團強度越強,延伸性越差,過低則代表面團可塑性低,制作面制品時不易成型[24]。如表3所示,黑小麥粉面團的拉伸能量、拉伸阻力和拉伸比均隨TG添加量的增加逐漸增大,表明TG促進面筋蛋白分子交聯形成大聚體,增強了面團筋力與強度,使面團可塑性高,制作面制品時易成型。但延展度隨TG添加量的增加而逐漸降低,說明面團延伸性變差。張帥[25]認為面團延伸性主要歸因于面筋蛋白質分子的延伸。而TG促進蛋白質分子交聯糾纏可能阻礙了蛋白質分子的延伸。王佳玉等[8]研究TG對全麥粉面團拉伸特性的影響結果也表明,TG可有效增強全麥粉面團強度,但使其延伸性變差,適當控制酶反應時間可能會直接影響面團拉伸特性。

表3 TG對黑小麥粉面團拉伸特性的影響Table 3 Effect of TG on tensile properties of black wheat dough

2.5 TG對黑小麥粉面團蛋白質二級結構的影響

蛋白質二級結構是指多肽鏈上主鏈有規則重復的構象,其變化在一定程度上決定了蛋白質的加工性能[5]。由圖2可知,與TG添加量0%相比,不同TG添加量的黑小麥粉面團紅外光譜中吸收峰的位置差異較小,且無舊峰消失和新峰產生,說明添加TG不會改變黑小麥粉面團蛋白質二級結構的吸收峰。但峰的強度有所變化,說明TG影響了黑小麥粉面團蛋白質的空間結構。

圖2 不同TG添加量的黑小麥粉面團紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of black wheat dough with different amount addition of TG

圖3 TG對黑小麥粉面團蛋白質二級結構的影響Fig.3 Effect of TG on protein secondary structure of black wheat dough

2.6 TG對黑小麥粉面團巰基與二硫鍵的影響

在黑小麥粉面團形成過程中,面筋蛋白吸水,游離巰基間互相連接,或是游離巰基轉化為二硫鍵,二硫鍵相互結合使蛋白質分子鏈擴展連接,產生交聯作用形成大分子聚合體,最終形成面筋網絡結構[27]。因此游離巰基與二硫鍵含量是反映面筋蛋白交聯程度的重要指標,游離巰基含量越低或二硫鍵含量越高,表明蛋白質交聯程度越深,面筋蛋白網絡結構越完善,面團筋力越強。由圖4可知,黑小麥粉面團游離巰基含量隨TG添加量的增加而降低,當TG添加量為1.1%時達到最低值3.12 μmol/g,與TG添加量為0%(3.83 μmol/g)相比減少18.54%。與游離巰基含量變化相對應,二硫鍵含量隨TG添加量的增加而增加,當TG添加量為1.1%時分子間二硫鍵形成最多(3.68 μmol/g)。因此添加TG能有效減少黑小麥粉面團中游離巰基含量,同時使二硫鍵含量顯著增加,YANG等[7]研究TG對富含纖維面條游離巰基與二硫鍵含量的影響也得到類似的結論,說明TG促進黑小麥粉面團游離巰基向二硫鍵轉化,蛋白質交聯程度加深,面筋蛋白網絡結構更完善,面團筋力更強。

圖4 TG對黑小麥粉面團巰基與二硫鍵含量的影響Fig.4 Effect of TG on the content of sulfhydryl and disulfide bonds in black wheat dough注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.7 TG對黑小麥粉面團微觀結構的影響

黑小麥粉面團是由圓形或橢圓形、表面較光滑、無明顯裂縫的大小淀粉顆粒、纖維與鑲嵌包裹淀粉顆粒與纖維的面筋蛋白組成的連續基質[28]。如圖5所示,未添加TG的黑小麥粉面團(圖5-a)由于存在較多纖維,阻斷了面筋網絡結構的形成,致面筋蛋白微觀結構疏松,孔洞較多,少有連續的成片面筋膜,淀粉顆粒與面筋蛋白結合度低[16]。圖5-b～圖5-d顯示隨TG添加量的增加,面筋結構更緊密穩定,孔洞減少,有連續均勻的成片面筋膜,淀粉顆粒與纖維被緊密包裹在面筋網絡結構中[7]。這進一步證實在TG的作用下,蛋白質發生交聯形成大量多聚體,促進蛋白質與淀粉顆粒、纖維之間互相黏連,使連續基質更穩定,提升面團品質與加工性能[24]。圖5-e～圖5-f表明TG添加量過多致蛋白質過度交聯,淀粉顆粒被迫暴露,面團穩定性下降,這與上述動態流變學實驗結果一致。楊怡飛[29]在研究不同添加量TG對鮮濕面微觀結構的影響中也得到相似的結論。整體來看,當TG添加量為0.8%～1.1%時黑小麥粉面團微觀結構較為完整緊密。

a-TG 0%;b-TG 0.2%;c-TG 0.5%;d-TG 0.8%;e-TG 1.1%;f-TG 1.4%圖5 TG對黑小麥粉面團微觀結構的影響(2 000×)Fig.5 Effect of TG on microstructure of black wheat dough (2 000×)

3 結論

本研究發現,TG能促進黑小麥粉面團蛋白質聚集交聯,改善黑小麥粉面團理化特性。適量TG的添加能增大黑小麥粉面團的黏度,延長形成時間與穩定時間,且能增大儲能模量和損耗模量,增強面團綜合黏彈性和拉伸強度。在蛋白質結構方面,TG使黑小麥粉面團蛋白質二級有序結構上升,蛋白彈性和結構穩定性提高;面團二硫鍵含量增加,蛋白質交聯程度加深,面筋蛋白網絡結構更完善。但TG的加入會降低黑小麥粉面團的延伸性,且TG添加過量會導致蛋白質交聯過度,淀粉顆粒被迫溶出,面團黏度開始下降,綜合黏彈性下降,穩定性降低。因此控制TG添加量對黑小麥粉面團的理化特性及蛋白結構穩定性至關重要。本文中TG添加量為1.1%時對黑小麥粉面團理化特性改善效果最顯著,可為開發黑小麥食品、提高其食用品質提供參考,也對后續研究TG對黑小麥面團品質的影響具有指導意義。在未來還可對黑小麥健康功能食品的開發及黑小麥食品品質的改良作進一步研究。