大鯢肽-硒螯合物對D-半乳糖致小鼠氧化應激損傷保護作用

趙世博,劉俊霞,何琳琳,姜鵬飛,程虎,金文剛*

1(陜西理工大學 生物科學與工程學院,秦巴生物資源與生態環境省部共建培育國家重點實驗室,陜西 漢中,723001)2(陜西理工大學 陜西省資源生物重點實驗室,陜西 漢中,723001) 3(陜西理工大學 陜南秦巴山區生物資源綜合開發協同創新中心,陜西 漢中,723001) 4(大連工業大學 食品學院,國家海洋食品工程技術研究中心,遼寧 大連,116034) 5(漢中市龍頭山水產養殖開發有限公司,陜西 漢中,723001)

大鯢為我國特有的兩棲動物,具有豐富的營養價值和藥用價值[1]。大鯢肉富含優質蛋白,必需氨基酸含量高,不飽和脂肪酸含量高,通過酶解后的大鯢肽具有抗氧化、免疫調節的功能[2],具有較大開發利用潛力。活性氧能夠攻擊蛋白質,致使細胞膜脂質過氧化,使蛋白質交聯變性、酶活性喪失、細胞老化甚至死亡[3]。D-半乳糖(D-galactosidase,D-gal)能夠導致氧化應激,進而導致表觀上和生理上的退行性衰老。近年來,開發具有抗衰老作用的多肽類物質成為研究熱點。ZHANG等[4]對D-半乳糖誘導的衰老小鼠分別灌胃Na2SeO3、SeMet、大豆肽和含硒大豆肽,發現含硒大豆肽可以提高小鼠肝臟超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶-1(glutathione peroxidase, GSH-Px)的活力,降低天冬氨酸轉氨酶、谷丙轉氨酶和核因子(nuclear factor kappa-B,NF-κB)含量,可通過調節絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/NF-κB通路抑制腦的氧化應激,且含硒肽在抗氧化活性方面優于其他硒補充劑。YU等[5]采用D-半乳糖誘導建立衰老大鼠模型,通過灌胃大鼠堇葉碎米薺富硒肽,發現富硒肽可增加衰老大鼠血清中的SOD、GSH-Px、過氧化氫酶(catalase, CAT)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC),降低活性氧(reactive oxigen species, ROS)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平,并激活Nrf2(調控抗氧化應激的一種關鍵轉錄因子)/血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)/醌氧化還原酶1(quinone oxidoreductase 1,QO1)通路,抑制衰老大鼠NF-κB通路來減輕神經炎癥。ZHU等[6]通過分離純化獲得堇葉碎米薺富硒肽,并利用堇葉碎米薺富硒肽灌胃D-半乳糖誘導氧化應激損傷小鼠,研究結果發現堇葉碎米薺富硒肽可提高小鼠血清和心臟、肝臟組織中的抗氧化酶活力,降低MDA和蛋白質羰基含量。

課題組前期優化制備了大鯢肽-硒螯合物,并比較了多肽和肽硒螯合物的結構特征和抗氧化活性[7],發現大鯢肽-硒螯合物具有更強的體外抗氧化活性。已有研究報道了大鯢肽對D-半乳糖致小鼠機體氧化損傷的修復作用[8],然而有關大鯢肽-硒螯合物的體內抗氧化活性,尚未見報道。為此,本研究通過D-半乳糖誘導建立小鼠氧化應激損傷模型,探究大鯢肽硒螯合物對氧化損傷小鼠不同組織抗氧化指標的影響,旨在為大鯢活性肽高值產品開發提供理論和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凍干大鯢肽(giant salamander peptides, GSP)(分子質量低于3 000 Da)和大鯢肽-硒螯合物(giant salamander peptide-selenium chelate, Se-GSP),由陜西省資源生物重點實驗室提供,制備方法和部分性質詳見文獻[7]。昆明種小鼠[CKX(陜)2018-001],由西安交通大學醫學部實驗動物中心提供。

亞硒酸鈉,天津市大茂化學試劑廠;D-半乳糖,上海麥克林生化科技有限公司;BCA試劑盒、T-SOD試劑盒、MDA試劑盒、GSH-Px試劑盒、T-AOC試劑盒、GSH試劑盒、蛋白質羰基測試盒,南京建成生物工程研究所;4%多聚甲醛,阿拉丁公司;二甲苯,國藥集團化學試劑有限公司;石蠟切片,上海華靈康復器械廠。

1.2 儀器與設備

Evolution 201紫外-可見分光光度計,賽默飛世爾科技公司;Spectra Max M3 全波長多功能酶標儀,美國Molecular Devices公司;DSX-18L高壓蒸汽滅菌鍋,上海博訊醫療生物儀器有限公司;F10高速勻漿機,天津恒奧科技發展有限公司;Allegra X-30R型離心機,Beckman coulter有限公司;HistoCore Arcadia生物組織包埋機、RM2015組織攤片機、HistoCore AUTOCUT 切片機、DM3000光學顯微鏡,德國Leica公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型建立及分組給藥

取6周齡,體重18～22 g的雄性昆明小鼠,在溫度(22±2) ℃,相對濕度50%～70%,12 h光照周期的條件進行適應性喂養,期間自由飲食飲水,每天同一時間段測定體重,觀察小鼠的活動并記錄。適應性喂養1周后,采用隨機抽樣的方法,將小鼠分為8組,每組10只,分別是正常對照組(Normal)、模型對照組(Model)、陽性對照組(AA)、大鯢肽低劑量組(GSP-L)、大鯢肽高劑量組(GSP-H)、大鯢肽-硒螯合物低劑量組(Se-GSP-L)、大鯢肽-硒螯合物高劑量組(Se-GSP-H)、亞硒酸鈉組(Na2SeO3)。除正常對照組外,對其余7組小鼠進行腹腔注射600 mg/(kg·bw)D-半乳糖構建氧化應激損傷模型。正常對照組小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水,每日一次,持續注射9周。建模4周后,7個試驗組分別給予對應的干預,分組及給藥情況見圖1。其中正常對照組小鼠給予L-抗壞血酸(L-ascorbicacid,AA)100 mg/(kg·bw)[8],GSP的低劑量和高劑量分別為100 mg/(kg·bw)、400 mg/(kg·bw)[9],Se-GSP的低劑量組和亞硒酸鈉劑量組是根據《中國居民膳食指南》中的硒每日推薦攝入量60 μg/d換算而得。連續灌胃4周,每天根據每只小鼠的體重進而調整灌胃體積。本研究中相關動物實驗內容符合實驗動物倫理委員會的基本要求并經過審批(批準號:DLPU2022103)。

圖1 各組小鼠分組、建模及給藥情況Fig.1 Classification, modelling, and administration of mice in each group

1.3.2 體重和臟器指數的測定

觀察小鼠的外觀和形態變化,定期檢測并記錄小鼠的體重,并對小鼠的體重變化進行分析。試驗結束后,用乙醚致小鼠昏迷,眼球取血,取血后將小鼠脫臼處死。解剖小鼠并取出小鼠的肝臟、心臟、脾臟、腎臟、胸腺等組織器官,用預冷的生理鹽水沖洗,濾紙吸干水分,對其進行稱重并計算臟器指數。組織稱重結束后,將不同的器官分開存放于-80 ℃冰箱中保存備用。臟器指數的計算如公式(1)所示:

1.3.3 血清及組織勻漿的制備

試驗結束后,小鼠乙醚麻醉后進行眼球取血,將收集的血液在37 ℃條件下靜置1 h,后在4 ℃冰箱中放置12 h,2 500 r/min條件下離心10 min,用移液器吸取上層液體,獲取血清樣本,將各組小鼠血清進行抗氧化指標的檢測。

準確稱取組織,用預冷的生理鹽水對組織進行漂洗,濾紙擦干,稱重,用剪刀將組織剪碎后放入高速勻漿器中,加入9倍體積(料液比)預冷的生理鹽水,在冰水浴條件下充分勻漿,并將勻漿于4 ℃,3 000 r/min的條件下離心10 min,取上清液備用。

1.3.4 抗氧化指標測定

根據ELISA試劑盒說明書,測定各組小鼠的血清、肝、腦、心臟中T-AOC活力、SOD活力、GSH活力、GSH-Px活力、MDA含量、蛋白質羰基含量;其中肝、腦、心臟組織的總蛋白含量均按照試劑盒說明書測定。

1.3.5 組織器官病理學觀察

將小鼠解剖后,取小鼠腦組織、肝組織固定,石蠟包埋切片進行蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,按照以下步驟操作,光學顯微鏡下觀察組織的病理學形態并記錄:

1.4 數據分析

每個試驗重復3次,取平均值。利用SPSS 26.0 統計分析軟件對試驗數據進行t檢驗、單因素方差分析和鄧肯多重比較,以P<0.05表示差異顯著,使用Origin 2021和GraphPad Prism 9軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 Se-GSP對D-半乳糖誘導氧化損傷小鼠體重、臟器指數影響

通過頸背部皮下注射和腹腔注射D-半乳糖是目前公認的構建氧化應激損傷模型的方法之一[10],半乳糖在醛糖還原酶的催化下,可還原為半乳糖醇,造成線粒體老化、自由基損傷、非酶糖基化反應和免疫功能障礙等問題[11]。連續4周腹腔注射600 mg/(kg·bw)的D-半乳糖后,小鼠毛色變得沒有光澤,毛發易脫落,行動遲緩,消瘦,易倦怠,體重增加緩慢,出現明顯的衰老體征。小鼠的體重變化是反映機體生長發育的一個重要指標,試驗期間各組小鼠平均體重呈緩慢增加趨勢。圖2為建模期間和建模后小鼠體重變化,氧化損傷模型形成初期,各組小鼠體重基本一致,組間無顯著差異(P>0.05)。建模期間各組小鼠平均體重逐漸增加,最后模型組小鼠體重極顯著低于正常對照組小鼠(P<0.01),表明建模成功。通過灌胃5周的受試物,導致小鼠體重增加。其中空白對照組、模型對照組以及陽性對照組小鼠體重增量分別為(17.28±1.72) g,(10.5±0.83) g和(15.48±2.14) g。空白對照組和陽性對照組小鼠體重增量顯著高于模型對照組(P<0.05)。但Se-GSP-L組、Se-GSP-H組和亞硒酸鈉組小鼠的體重增量與模型對照組無顯著差異(P>0.05)。陽性對照組、Se-GSP-L和Se-GSP-H組小鼠體重分別為(43.86±3.73) g、(42.7±4.11) g和(42.86±6.14) g,與模型組小鼠體重(40.62±2.29) g相比顯著增加(P<0.05)。GSP-L和GSP-H組小鼠體重與模型組相比顯著增加(P<0.05)。灌胃亞硒酸鈉小鼠體重為(41.57±0.35) g與模型組小鼠體重無明顯差異(P>0.05),說明灌胃GSP、Se-GSP可以提高氧化應激損傷小鼠的體重,低劑量的GSP、Se-GSP具有促進衰老小鼠恢復生長的作用。關百婷等[9]

A-體重變化;B-體重增量圖2 不同受試物對小鼠的影響Fig.2 Effect of different subjects of mice注:同一指標上標注字母不同表示差異顯著(P<0.05),下同。

報道的灌胃大鯢活性肽能顯著增加D-半乳糖衰老小鼠體重,大鯢活性肽的低、中、高劑量組小鼠體重均高于模型組,并十分接近正常對照組小鼠的體重。

臟器指數可以間接揭示動物體內因氧化作用而導致的損傷程度,脾臟和胸腺在機體中有著重要的免疫功能,其體積的減小可表明機體存在一定程度上的衰老[12]。各組SPF級雄性昆明小鼠灌胃相應受試物5周后,其臟器指數變化如圖3所示。正常對照組的心臟指數、肝臟指數、腎臟指數、脾臟指數以及胸腺指數分別為(8.89±4.14)%、(41.30±6.93)%、(17.68±7.29)%、(5.12±0.96)%、(2.51±0.39)%。模型對照組的心臟指數、肝臟指數、腎臟指數、脾臟指數和胸腺指數分別為(6.50±1.59)%、(49.47±8.44)%、(16.04±1.41)%、(3.52±0.43)%和(1.92±0.23)%。陽性對照組的心臟指數、肝臟指數、腎臟指數、脾臟指數以及胸腺指數分別為(8.44±1.50)%、(43.27±5.05)%、(18.05±2.98)%、(5.04±1.43)%和(2.20±0.73)%。正常對照組的各臟器指數與模型對照組的臟器指數均具有顯著性差異(P<0.05),表明小鼠氧化應激損傷模型建立成功。陽性對照組所有臟器指數均與空白對照組無顯著差異(P>0.05)。亞硒酸鈉組小鼠的臟器指數除心臟指數外,其他臟器顯著高于模型組(P<0.05)(圖3)。GSP-L組、GSP-H組、Se-GSP-L組和Se-GSP-H組小鼠的心臟、肝臟、腎臟、脾臟和胸腺指數介于模型對照組與空白對照組之間。以上結果表明,GSP和Se-GSP均可在一定程度上減輕器官的萎縮,這與關百婷等[9]研究結果相符。

圖3 不同劑量組對小鼠器官指數的影響Fig.3 Effects of different dose groups on mouse organ index

2.2 Se-GSP對D-半乳糖誘導氧化損傷小鼠血清中抗氧化指標的影響

當D-半乳糖濃度過高時,在半乳糖氧化酶的作用下,D-半乳糖會轉變為醛糖、氫過氧化物,進而生成超氧陰離子自由基和氧衍生自由基[13]。另一方面,D-半乳糖與游離氨基酸發生反應形成糖基化終產物,促進活性氧的產生,降低線粒體呼吸鏈復合物的活性并引起氧化應激損傷[14]。大量研究表明,抗氧化活性在機體衰老過程中有著至關重要的作用,機體內存在清除自由基的防御系統,其中包括SOD、GSH-Px等抗氧化酶系[15]。T-AOC代表機體內酶類抗氧化物質、非酶類抗氧化物質的綜合[16],可反映出體系的各種抗氧化大分子、小分子和酶的總體水平。SOD是機體內一種有重要作用的抗氧化酶,能夠有效清除超氧陰離子自由基并將其歧化為水和氧氣,降低MDA和自由基代謝產物的產生[17]。GSH是機體內重要的非酶抗氧化物質,具有清除超氧陰離子自由基和過氧化氫、維持脫氧核糖核苷酸的生物合成以及維持細胞的正常發育等生理功能[18]。GSH-Px能特異地催化GSH還原過氧化物的還原反應,可阻斷過氧化物引發的自由基對機體的損害[15]。MDA是機體內自由基產生脂質過氧化的產物,常被作為評價衰老的指標之一[19],其含量隨著衰老而增加[20]。蛋白質的氧化損傷程度可由蛋白質羰基含量來表達,過氧化氫和超氧陰離子自由基對蛋白質氨基酸側鏈的氧化可進一步導致羰基產物的累積,其含量隨著年齡的增長而增加。

不同受試物對小鼠血清中SOD活力、GSH-Px活力、T-AOC含量、GSH含量、MDA含量和蛋白質羰基含量的影響見表1。

表1 GSP和Se-GSP對小鼠血清中抗氧化指標的影響Table 1 Effects of GSP and Se-GSP on antioxidant indexes in mouse serum

由表1可知,與正常對照組相比,模型對照組血清中SOD活力、GSH-Px活力、GSH含量和T-AOC含量顯著降低(P<0.05),而MDA和蛋白質羰基含量顯著升高(P<0.05),說明建模成功。正常對照組小鼠血清中T-AOC和MDA含量與陽性對照組無顯著差異(P>0.05),SOD活力、GSH-Px活力、GSH含量和蛋白質羰基含量與陽性對照組有顯著差異(P<0.05)。與模型對照組相比,GSP-L小鼠血清中的T-AOC含量、SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力以及MDA、蛋白質羰基含量均有顯著差異(P<0.05)。與模型組相比,Se-GSP-L組小鼠血清中的SOD、GSH-Px活力和GSH、T-AOC含量顯著升高(P<0.05),MDA、蛋白質羰基含量均顯著降低(P<0.05),隨著劑量的增加,各指標與模型對照組差異逐漸增大。與陽性對照組相比,Se-GSP-H組小鼠血清中SOD活力、GSH-Px活力、GSH含量、T-AOC含量及MDA、蛋白質羰基含量與模型相比均有顯著差異(P<0.05)。Se-GSP-H組小鼠中T-AOC含量、SOD活力和GSH-Px活力較模型對照組分別提高了77.33%、41.35%和59.78%;MDA和蛋白質羰基含量較模型對照組分別降低了30.64%和63.72%。灌胃亞硒酸鈉的小鼠血清中T-AOC含量、SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力及MDA、蛋白質羰基含量與模型相比均有顯著差異(P<0.05)。說明低、高劑量的GSP、Se-GSP均可以提高體內抗氧化酶類和非酶類的活性。關百婷等[9]采用D-半乳糖構建衰老小鼠模型,與正常對照組相比,衰老模型小鼠血清中的MDA含量極顯著上升,SOD活力和T-AOC含量極顯著降低,灌胃大鯢活性肽后小鼠血清中MDA含量極顯著降低,SOD活力和T-AOC含量顯著升高。蔡佳佳等[21]用大鯢肉喂養D-半乳糖誘發亞急性衰老小鼠8周,與模型組相比,大鯢肉各劑量組小鼠血清SOD活性升高,MDA含量減少。翟興月等[22]采用鱘魚肽灌胃衰老模型小鼠,灌胃鱘魚肽的低、中、高劑量組均能極顯著降低血清中MDA含量,極顯著升高了小鼠血清中T-AOC含量和SOD活性,這些結論與本試驗結論一致。

2.3 Se-GSP對D-半乳糖誘導氧化損傷小鼠肝臟中抗氧化指標的影響

按照“1.3.3節”組織勻漿的制備方法,進行肝組織勻漿的制備,按照SOD活力、GSH-Px活力、GSH含量、T-AOC含量、MDA含量和蛋白質羰基含量的檢測方法對肝組織勻漿中的相關指標進行檢測,結果如表2 所示。肝臟在機體內具有解毒、代謝等功能。研究表明,D-半乳糖能夠導致肝臟的損傷[23]。由表2可知,與正常對照組相比,腹腔注射D-半乳糖的模型對照組肝臟的SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力和T-AOC含量顯著下降(P<0.05),MDA和蛋白質羰基含量顯著上升(P<0.05)。陽性對照組與正常對照組相比,SOD活力、GSH-Px活力、T-AOC含量、MDA和蛋白質羰基含量有顯著差異(P<0.05),而GSH含量無顯著差異(P>0.05)。GSP-L組小鼠肝臟中的SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力、T-AOC含量顯著增加(P<0.05),MDA、蛋白質羰基含量顯著下降(P<0.05),并隨著GSP劑量的增加差異逐漸增大。Se-GSP-L組小鼠肝臟中的SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力、T-AOC含量顯著增加(P<0.05),MDA、蛋白質羰基含量顯著下降(P<0.05),隨著劑量的增加差異逐漸增大。灌胃低、高劑量的GSP組的SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力、T-AOC含量分別顯著低于灌胃低、高劑量的Se-GSP組(P<0.05),MDA和蛋白質羰基含量分別顯著高于灌胃低、高劑量Se-GSP組(P<0.05)。Se-GSP-H組小鼠肝臟中MDA和蛋白質羰基含量較模型對照組分別降低了70.59%和71.63%。灌胃亞硒酸鈉的小鼠肝臟中各指標居于GSP-L組和Se-GSP-L組之間。張昱等[24]用藍點馬鮫魚皮抗氧化肽Fraction Ⅱ 灌胃D-半乳糖誘導氧化損傷大鼠,各劑量組的Fraction Ⅱ 能顯著提高肝臟組織的SOD、GSH-Px活性和T-AOC能力,降低MDA含量,與本試驗結果一致。

表2 GSP和Se-GSP對小鼠肝臟中抗氧化指標的影響Table 2 Effect of GSP and Se-GSP on antioxidant indexes in mouse liver

2.4 Se-GSP對D-半乳糖誘導氧化損傷小鼠心臟中抗氧化指標的影響

按照“1.3.4節”組織勻漿的制備方法,進行心臟組織勻漿的制備,按照SOD活力、GSH-Px活力、T-AOC含量、GSH含量、MDA含量和蛋白質羰基含量的檢測方法對心臟組織勻漿中的相關指標進行檢測,結果如表3所示。

表3 GSP和Se-GSP對小鼠心臟中抗氧化指標的影響Table 3 Effects of GSP and Se-GSP on antioxidant indexes in mouse heart

與正常對照組相比,腹腔注射D-半乳糖的模型對照組心臟的SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力和T-AOC含量顯著下降(P<0.05),MDA、蛋白質羰基含量顯著上升(P<0.05),說明建模成功。陽性對照組與正常對照組相比,SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力、T-AOC、MDA和蛋白質羰基含量有顯著差異(P<0.05)。灌胃亞硒酸鈉小鼠的心臟中T-AOC含量、SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力與MDA含量與Se-GSP-L組無顯著差異(P<0.05)。Se-GSP-H組的各項指標均與正常對照組有顯著差異(P<0.05),表明高劑量Se-GSP的效果不如陽性對照藥物L-抗壞血酸。與模型對照組相比,灌胃GSP后,心臟中的SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力、T-AOC含量顯著增加(P<0.05),MDA、蛋白質羰基含量顯著下降(P<0.05),并隨著劑量的增加差異逐漸增大,表明GSP可提高衰老小鼠心臟組織的SOD、GSH、GSH-Px活力,且對D-半乳糖誘導的小鼠心臟的脂質過氧化有較好的抑制作用。與模型對照組相比,灌胃Se-GSP后,心臟中的SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力、T-AOC含量顯著增加(P<0.05),MDA和蛋白質羰基含量顯著下降(P<0.05),并隨著劑量的增加差異逐漸增大,其中Se-GSP-H組小鼠心臟中T-AOC含量較模型對照組小鼠增加了79.22%,MDA和蛋白質羰基含量較模型對照組降低了47.56%和53.48%。表明Se-GSP可提高衰老小鼠心臟組織的SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力,且對D-半乳糖誘導的小鼠心臟的脂質過氧化有較好的抑制作用。且Se-GSP-H組小鼠心臟中各指標均與GSP-H組具有顯著差異性(P<0.05)。

2.5 Se-GSP對D-半乳糖誘導氧化損傷小鼠腦中抗氧化指標的影響

按照“1.3.4節”組織勻漿的制備方法,進行腦組織勻漿的制備,按照SOD活力、GSH-Px活力、T-AOC含量、GSH含量、MDA含量和蛋白質羰基含量的檢測方法對腦組織勻漿中的相關指標進行檢測,結果如表4所示。腦是機體中結構最復雜、功能完備、且能調節人體生理活動的器官[25],氧化應激會誘導急性腦卒中、腦缺血和衰老等疾病的發生,腦組織若長期受到損傷,會造成不可逆轉的后果。因此,抑制并修復腦組織的氧化損傷十分重要。D-半乳糖能夠加速大腦組織衰老。與正常對照組比較,其余7組小鼠腦組織的SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力和T-AOC顯著降低(P<0.05),MDA和蛋白質羰基含量顯著增加(P<0.05)。與模型對照組比較,亞硒酸鈉組和GSP、Se-GSP的低、高劑量組小鼠腦組織中的SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力和T-AOC都升高,MDA和蛋白質羰基含量降低,且亞硒酸鈉組、GSP-L、GSP-H、Se-GSP-L和Se-GSP-H組的各指標與模型對照組有顯著性差異(P<0.05)。陽性對照組與正常對照組相比,除T-AOC含量無顯著差異(P>0.05)之外,其余各指標均與正常對照組有顯著性差異(P<0.05),表明D-半乳糖對小鼠大腦的損傷在抗壞血酸的作用下不可逆轉。Se-GSP-L組和Se-GSP-H組的各項指標均呈現顯著性差異(P<0.05),其中Se-GSP-L組小鼠的腦組織中的SOD、GSH、GSH-Px活力和T-AOC含量較Se-GSP-H組顯著下降(P<0.05),MDA含量、蛋白質羰基含量較Se-GSP-H組顯著上升(P<0.05)。Se-GSP-H組小鼠腦中T-AOC含量較模型對照組小鼠增加了80.00%,MDA和蛋白質羰基含量較模型對照組降低了62.47%和52.68%。表明Se-GSP和GSP均能提高D-半乳糖誘導氧化應激損傷小鼠腦組織中的SOD活力、GSH含量、GSH-Px活力和T-AOC含量,同時能夠降低腦組織中的MDA和蛋白質羰基含量。

表4 GSP和Se-GSP對小鼠腦中抗氧化指標的影響Table 4 Effects of GSP and Se-GSP on antioxidant indexes in mouse brain

2.6 Se-GSP對D-半乳糖誘導氧化損傷小鼠肝、腦組織的影響

HE染色是觀察形態最常用的染色方法之一[26],本研究利用HE染色對組織病理學觀察,進一步確認Se-GSP和GSP對D-半乳糖誘導氧化應激損傷小鼠的保護作用。D-半乳糖可致氧化應激損傷模型小鼠中央靜脈結構紊亂,肝細胞排列雜亂,肝索和肝竇排列不規則,胞質疏松、腫脹[27]。肝臟的HE染色結果如圖4所示,正常對照組小鼠的肝小葉完整,肝細胞群排列在中央靜脈周圍,肝細胞結構清晰完整、細胞核正常,無明顯病理變化。模型對照組小鼠肝細胞排列雜亂、胞漿內出現大量脂肪樣變性空泡,肝血竇擴張明顯。陽性對照組小鼠的肝細胞排列有序,其形態發生了略微的變化,胞內脂肪樣變性空泡減少,肝損傷減輕。低劑量Se-GSP對氧化應激小鼠肝臟的修復能力弱于高劑量Se-GSP。GSP-L組小鼠肝細胞內仍有脂肪樣空泡,肝索呈放射狀排列。亞硒酸鈉組部分肝細胞體積增大,肝索排列紊亂。高劑量Se-GSP能改善氧化應激小鼠肝細胞形態,減少中性脂肪聚集,修復部分肝臟損傷。由此可見,高劑量的Se-GSP和GSP可緩解肝細胞的破壞,維護組織功能正常,進一步延緩衰老。

圖4 小鼠肝臟組織病理切片圖(×200)Fig.4 Mouse liver histopathological section(×200)

大腦的耗氧量較大,由此導致的自由基蓄積損傷尤為明顯。隨著年齡的增加,機體的老化狀態也越發嚴重,大腦各部位的神經元細胞都在減少。其中最主要的病理改變發生在大腦皮質和海馬區[28]。GSP、Se-GSP對半乳糖誘導氧化應激損傷模型小鼠腦組織的影響如圖5所示,腦組織經HE染色后,神經細胞胞漿表現為紫紅色,細胞核呈紫藍色。空白對照組小鼠的腦組織整體結構正常,腦組織海馬區的神經元細胞排列有序,細胞核和胞漿清晰可見。模型對照組小鼠的腦組織整體結構異常,組織海馬區神經元排列紊亂,數量減少,可見大量神經元明顯固縮深染壞死,組織間質未見血管明顯地充血擴張,組織未見明顯的炎癥細胞浸潤。GSP-H組和Se-GSP-H組仍有不同程度的神經元細胞變性,但是變性細胞顯著減少,表明高劑量GSP和Se-GSP可改善D-半乳糖誘導的腦組織病理變化。

圖5 小鼠腦組織病理切片圖(×200)Fig.5 Mouse brain histopathological section(×200)

3 結論

采用D-半乳糖誘導建立氧化應激損傷小鼠模型,通過大鯢肽和大鯢肽硒螯合物干預后均顯示出了較好的拮抗肝臟、脾臟和胸腺萎縮的作用,能顯著提高小鼠血清、肝臟、心臟、腦組織中T-AOC含量、SOD活力、GSH含量和GSH-Px活力(P<0.05),同時降低MDA和蛋白質羰基含量(P<0.05)。組織病理學切片結果顯示,大鯢肽和大鯢肽硒螯合物對氧化應激損傷小鼠肝臟和腦具有較好的保護作用。與大鯢肽相比,大鯢肽硒螯合物對D-半乳糖誘導的氧化應激損傷小鼠的保護和修復作用更強,顯示出更好的體內抗氧化活性。今后還需要進一步對其進行安全性評價、胃腸道消化穩定性以及免疫調節功能進行探究,以期為大鯢肽硒螯合物相關衍生產品研發提供參考數據。