多元線性回歸-分光光度法同時測定食用油中的鄰苯二甲酸酯類物質

李瑞月,鐘山*,張漓杉,符芬華,韋锃弦

1(桂林電子科技大學 生命與環境科學學院,廣西 桂林,541004)2(桂林云璟科技有限公司,廣西 桂林,541004)

鄰苯二甲酸酯(phthalic acid esters,PAEs)又稱酞酸酯,主要作為增塑劑用于聚氯乙烯、聚乙烯等塑料制品的生產,以改進其可塑性和柔韌性[1]。研究表明PAEs是一種環境污染物,含有雌激素成分,可通過呼吸、飲食和皮膚接觸等進入生物體內,嚴重影響生物體的生殖、發育行為[2]。此外,由于PAEs與聚合物之間是通過氫鍵和范德華力相連接,在塑料中呈游離狀態,且屬于脂溶性物質,因此在與油脂類物質接觸時極易發生遷移[3]。我國是食用油消費大國,從銷售市場來看,食用油的包裝以塑料制品為主,存在PAEs從塑料包裝轉移至食用油中的風險[4],因此測定食用油中PAEs遷移含量對監控食用油等食品安全具有重要意義。

市場上,使用最廣泛的PAEs類增塑劑主要為:鄰苯二甲酸二正丁酯(dibutyl phthalate, DBP)、鄰苯二甲酸二辛酯(dioctyl phthalate, DOP)、鄰苯二甲酸丁芐酯(butyl benzyl phthalate, BBP)、鄰苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate, DEP)和鄰苯二甲酸二異丁酯(diisobutyl phthalate, DIBP)等[5]。目前PAEs的檢測方法主要有:高效液相色譜法[6]、高效液相色譜-質譜聯用法[7]、氣相色譜-質譜聯用法[8]、氣相色譜法[9]等,存在方法操作復雜、運行成本高、測定及分析時間長等缺點[10],且許多有測定需求的企事業單位無法獲得上述高端測試儀器,對于PAEs的分析檢測存在局限,因此有必要探討一種簡易、快速且成本低廉的PAEs分光光度檢測方法。通過實驗得知,PAEs在紫外區190～300 nm內具有特征吸收光譜峰[11],且線性關系良好,可用于對PAEs進行測定分析。分光光度法設備投資小、分析過程簡單可靠[12],但因一種塑料制品中通常添加有多種PAEs類增塑劑,以確保其產品性能,且PAEs結構相似測定時會產生相互干擾,普通分光光度法無法對其準確定性[11]。

為解決上述多組分相互干擾的問題,近年來研究者提出了許多用化學計量學方法代替普通化學分離來同時測定相互干擾組分的方法,如:偏最小二乘法(partial least-square, PLS)[13]、主成分分析(principal component analysis, PCA)[14]、主成分回歸(principal components regression, PCR)[15]和多元線性回歸分析(multiple linear regression, MLR)[16]等。其中,多元線性回歸以數據降維為目的,根據歷史實驗數據的變化規律,探究多個自變量對計算結果的影響,尋找自變量與因變量之間的回歸方程式,從而確定模型參數[16]。較PLS、PCA、PCR而言,MLR具有原理簡單、準確性高、適用范圍廣等優點,能夠克服組分間相互干擾的問題[17]。本文通過多元線性回歸分析,結合線性擬合多個自變量和因變量的關系,從而確定回歸模型的各個參數,建立可靠的預報模型[18]。目前,依據光具有加和性的特點把MLR與分光光度法結合的方法已被廣泛用于多組分含量的同時測定中,但對于PAEs類增塑劑的同時測定未見報道。

本研究建立了MLR聯合紫外-可見分光光度法,采用波段連續檢測,結合有機溶劑溶解并提取、固相萃取柱凈化等前處理方法,建立同時測定DBP、DOP、BBP 3種物質的模型A和同時測定DBP、DOP 2種物質的模型B兩個模型,分別對應不同類型食用油樣品及不同測定需求。該方法為實際食用油樣品中PAEs的快速測定和篩查提供了可行的解決辦法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DOP標準溶液(純度≥98%)、DBP標準溶液(純度≥98%)、BBP標準溶液(純度≥98%)、甲醇、乙腈、正己烷、丙酮、二氯甲烷(均為色譜純),上海阿拉丁化學試劑。實驗用水為超純水。

為避免實驗過程中PAEs污染,實驗均采用玻璃器皿。玻璃器皿使用前用丙酮浸泡12 h,200 ℃烘干,冷卻備用。

1.2 儀器與設備

UV-2600i紫外-可見分光光度計,日本島津公司;ME204E電子分析天平,梅特勒托利多科技(中國)有限公司;SPD-16高效液相色譜儀紫外-可見檢測器、C18色譜柱,島津儀器(蘇州)有限公司;Silica/乙二胺-N-丙基硅烷(primary-secondary amine,PSA)玻璃混合型固相萃取柱(1.0 g/6 mL),北京恩加壹科技有限公司;USE-12S 12位手動固相萃取裝置、UGC-12C 12位旋轉式水浴氮吹儀,北京優晟聯合科技有限公司;TD5M 多管架自動平衡離心機,上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制

精密移取20 μL的DOP、DBP、BBP標準溶液至100 mL容量瓶中,用甲醇定容配成質量濃度為200 mg/L 的DBP、DOP、BBP標準溶液,置于4 ℃冰箱中保存備用。

1.3.2 MLR模型建立

PAEs預報模型A和PAEs預報模型B標準物質混合溶液濃度設置見表1。依據表格取適量DBP、DOP、BBP標準溶液置于50 mL容量瓶,以甲醇為溶劑配制一定濃度的標準溶液,充分混合均勻后,用1 cm比色皿,以試劑空白做參比,用紫外-可見分光光度計測定190～260 nm波長范圍內的吸收光譜。將吸光度、波長等光譜數據導入MATLAB中,MLR基于Regress 函數軟件包編程實現,預測混合溶液中各組分的含量。

表1 PAEs預報模型A、B標準物質混合溶液濃度配比Table 1 Standard substance mixture concentration ratios of PAEs prediction model A and B

1.3.3 標準工作模型實驗方法

取適量DBP、DOP、BBP標準溶液置于50 mL容量瓶,以甲醇為溶劑配制一定濃度的標準溶液并充分混勻。后續步驟同1.3.2節。

1.3.4 實際樣品實驗方法

分別采集市場上銷售的不同品牌和不同出廠日期的塑料桶裝大豆油、花生油和菜籽油。準確稱取20.00 g(精確到0.01 g),加入5 mL乙腈,渦旋3 min,超聲提取10 min,3 500 r/min離心5 min,移取上層清液,重復上述提取步驟3次。合并3次提取的上清液待凈化。

Silica/PSA固相萃取柱凈化,活化:依次使用5 mL二氯甲烷、5 mL乙腈進行活化,棄去流出液;上樣:將上述待凈化液加入SPE柱,流速不超過1 mL/min,收集流出液;洗脫:加入5 mL乙腈,收集流出液。

合并2次流出液,加入1 mL丙酮,40 ℃氮吹至近干,甲醇準確定容至5 mL,用1 cm比色皿,紫外-可見分光光度計測定190～260 nm內的吸收光譜?？瞻讓嶒炗贸兯媸秤糜蜆悠?其他操作同上。將吸光度、波長等光譜數據導入MATLAB中,通過模型A或模型B預測實際樣品中各組分的含量,MLR基于Regress 函數軟件包編程實現。

2 結果與分析

2.1 MLR模型的建立方法及原理

2.1.1 待測PAEs物質的選擇

根據資料收集可知[8,19-25],對不同類型食用油中PAEs檢測發現,DBP、DOP、BBP、DEP、DIBP、鄰苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate,DMP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(di-n-octyl phthalate,DNOP)等物質均有不同程度的檢出,每種物質的平均檢出量見圖1。其中以DBP、DOP、BBP概率最大,在不同種類食用油中的平均檢出量分別為0.107～1.03、0.193～1.140、0.083～0.906 mg/kg,分別占總檢出量的21.35%、28.59%、20.38%,因此選擇DBP、DOP、BBP為目標待測物。

圖1 不同種類食用油中PAEs的平均檢出情況Fig.1 Average detection of PAEs in different types of edible oils

2.1.2 標準曲線及其線性相關性

取適量1.3.1節部分標準溶液于10 mL容量瓶中,用甲醇定容配制成質量濃度為0.2、0.5、1.0、1.7、2.7 mg/L的系列標準溶液。在最大吸收波長處進行吸光度測定,得到標準曲線并計算出線性方程,如表2所示,在0.2～2.7 mg/L內,3種物質濃度與吸光度均呈現良好的線性關系,相關系數R2≥0.999。

表2 DBP、DOP和BBP標準曲線的回歸方程及其線性相關性Table 2 Regression equations of DBP, DOP, and BBP, standard curves and their linear correlations

2.1.3 MLR模型PAEs物質混合體系濃度設置

由資料收集[8,19-25]得,DBP、DOP、BBP三種物質在食用油中的檢出量分布情況見圖2。由圖2可知,DBP、DOP、BBP三種物質在食用油中的檢出量分別集中于0.15～1.14、0.75～1.40、0.13～0.80 mg/kg。

圖2 三種PAEs物質在食用油中的檢出量分布Fig.2 Distribution of three PAEs substances detected in edible oils

根據衛辦監督函[2011]551號通告《衛生部辦公廳關于通報食品及食品添加劑中鄰苯二甲酸酯類物質最大殘留量的函》規定,食品及食品添加劑中DBP和DOP的最大殘留量分別為0.3 mg/kg和1.5 mg/kg。

因此,參考圖2檢出量分布及上述通告規定這2個因素設置預報模型中DBP、DOP、BBP 3種混合標準物質濃度配比(表1),用于測定市場上大多數食用油樣品。

2.1.4 MLR-分光光度預報模型建立原理

依照本文1.3.2節部分,以試劑空白做參比,進行紫外-可見分光光度測定。通過MATLAB運行MLR程序自動進行計算,可利用溶液選定波段范圍下的吸光度數據集合和混合溶液中目標物質的濃度已知參數求得回歸方程中aw、bw、cw、dw等未知參數,得到回歸方程組,從而建立同時測定溶液中DBP、DOP、BBP三種物質濃度的預報模型。

具體分析的流程為(以預報模型A為例):輸入自變量X1、X2、X3(16組標準物質混合溶液DBP、DOP、BBP的濃度)、因變量QW(16組標準物質混合溶液在190～260 nm波段下16×71吸光度值矩陣)→通過回歸方程,進行多元線性回歸分析(71次),得到aw、bw、cw、dw等系數→得出回歸方程組(71個)→建立預報模型→未知濃度溶液測定[17]。

所得回歸方程(以模型A為例)如公式(1)所示:

awX1+bwX2+cwX3+dwW=Qw

(1)

式中:aw、bw、cw、dw為回歸系數;Qw為W波長下的溶液吸光度。

當使用已建立的MLR模型測定未知濃度溶液時,只需要將該溶液在190～260 nm波段下吸光度數組輸入至模型,即可得出溶液中目標污染物的濃度(通過擬合方程的相關性R2優化數據組,模型自動計算R2,并選擇R2最高時的數據輸出,作為測定結果)。由于數據量較大,故使用MATLAB軟件運行程序實現自動計算。

2.2 實驗條件的優化

2.2.1 提取試劑的選擇

提取劑的選擇對提取效率至關重要。合適的提取劑應具有與水不混溶、對分析物具有良好的提取效果、低毒性等特點[26]。據已有文獻,PAEs測定可用正己烷、乙腈、二氯甲烷和甲醇等作為提取劑[20]。取某種經測定未檢出PAEs化合物的食用油,向其中加入對應標準溶液,按照本文1.3.4節部分方法,分別采用正己烷、乙腈、二氯甲烷和甲醇作為提取劑,比較不同提取溶液對3種PAEs回收率的影響。由圖3可知,當提取試劑為乙腈時,DBP、DOP、BBP的回收率均達到80%以上,提取效果較好。這可能是由于脂肪物在乙腈中的溶解度低,故實驗過程中兩者互溶和分離的效果均較好[27]。因此選擇乙腈為食用油中PAEs的提取試劑。

圖3 提取試劑對3種PAEs回收率的影響Fig.3 Effect of extraction reagents on the recovery of three PAEs

2.2.2 提取次數的選擇

根據分配定律,若不考慮其他因素如:溶液中被提取物剩余量、提取試劑使用總量等時,當提取試劑用量不變時,提取次數越多,效果越好[27]。取某種經測定未檢出PAEs化合物的食用油,向其中加入對應標準溶液,按照本文1.3.4節部分方法,分別用5 mL乙腈提取1、2、3、4次,比較不同提取次數對3種PAEs回收率的影響。由圖4可知,當提取次數為1時,3種PAEs的回收率均較低。提取第2次時,3種PAEs回收率均有較大提高,平均在79%左右。提取次數為3時,DBP、DOP、BBP的回收率均超過85%,且提取次數增加到4次時,3種物質的回收率基本不變,無明顯提高。故綜合考慮實驗整體效率及試劑使用成本,選擇提取次數為3次。

圖4 提取次數對3種PAEs回收率的影響Fig.4 Effect of number of extractions on the recovery of three PAEs

2.2.3 掃描波段的選擇

為保證測試體系的靈敏度,選擇入射波長時應依據吸收最大、干擾最小的原則[11]。本研究以試劑空白為參比溶液,在185～300 nm對DBP、DOP、BBP標準儲備液進行光譜掃描,結果如圖5所示。DBP、DOP、BBP的最大吸收波長分別為201、200、190 nm,波譜重疊嚴重,此時若使用常規分光光度法對混合體系中的這3種物質濃度單獨測定時,必然會相互干擾而影響測定結果。此外,由圖可知,在260 nm之后,DBP、DOP、BBP三物質波段變化趨勢一致,無明顯吸收,不宜作為MLR模型選擇數據[16]。故本實驗采用MLR-分光光度法對混合體系中的DBP、DOP、BBP 3種物質濃度進行同時測定,并選擇190～260 nm作為測定波長范圍。

圖5 DBP、DOP、BBP物質的吸收光譜Fig.5 Absorption spectra of DBP, DOP, and BBP注:圖中DBP、DOP、BBP質量濃度均為1.0 mg/L,圖上所示為扣除空白溶液的吸光度值。

2.3 方法評價

2.3.1 標準工作模型、方法定量限

按本文1.3.2節部分建立預報模型A、預報模型B,為了驗證預報模型的準確性,隨機配制含DBP、DOP、BBP或含DBP、DOP的混合溶液共16組(編號A1～A8、B1～B8),分別對應預報模型A與預報模型B。按照本文1.3.3節部分測定A1～A8、B1～B8混合溶液在190～260 nm波段下的吸光度,將所得的吸光度數據導入MATLAB中,并使用已調試好的模型A和模型B進行計算,得到濃度輸出值,計算其回收率、相對誤差(relative error, RE)和平均相對誤差(mean relative error, MRE)。具體結果如表3、表4所示。該方法模型A中DBP、DOP、BBP 3種物質的定量限分別為:0.125、0.100、0.150 mg/kg,模型B中DBP、DOP的定量限分別為:0.250、0.375 mg/kg。

表3 預報模型A模擬試樣分析預測Table 3 Analysis and prediction of simulation sample of prediction model A

表4 預報模型B模擬試樣分析預測Table 4 Analysis and prediction of simulation sample of prediction model B

與模型A相比,模型B的MRE較小,為4.31%～4.65%,主要原因是兩者待測物質的數量不同。預報模型的誤差主要來源于2個方面:測定誤差和模型誤差[18]。首先測定誤差方面:本研究的測定誤差主要由前期實驗操作引入,由于模型A測定3種物質,模型B測定2種物質,故與模型B相比,模型A具有較高的測定誤差。其次模型誤差方面:MLR數學模型誤差受多種因素影響,如:自變量個數、數據相關性、樣本總數等[19],由2.1.2節部分表2中DBP、DOP和BBP標準曲線可知,一定波長下,3種物質濃度與吸光度均具有較好的相關性。此外,當模型樣品整體數量不變而減少自變量的個數時,會使體系噪聲比重減小,增強模型通用能力、提高其準確度。同時,隨著自變量個數的減少,回歸平方和會減小,使得模型在運行過程中進行數據取舍時不易遺漏重要變量,確保其準確度[28]。因此,在模型A測定DBP、DOP、BBP 3種物質的基礎上,舍去檢出量相對較低的BBP可得到精度更高的模型B。

除準確度這點不同外,模型A同模型B還有其他方面的差異。例如,模型B較模型A的工作量更少。由于模型B只測定2種物質濃度,故在前期標準物質混合溶液配制和后期模型計算運行方面工作量均少于模型A,更不用需要大量實驗和數據來優化模型時的中期參數調控階段,因此,模型B簡單、便捷的優點就更加明顯。

雖然據調查[8,19-25]BBP是食用油中檢出量排名第三的PAEs物質,但是在衛辦監督函[2011]551號通告中,規定食品及食品添加劑中 DBP 和 DOP 的最大殘留量分別為0.3 mg/kg和1.5 mg/kg,并未提及BBP的污染。反過來,BBP同多數PAEs相同,對生物體具有嚴重危害[24],故有些情況下(待測樣品中大量含有、母嬰用品/食品、兒童用品/食品)對BBP的檢測是十分必要的。因此,模型A與模型B均有各自的明顯優勢,且可適用于不同的場合。

綜合兩模型在準確度、工作量等方面的差異,同時考慮到PAEs的測定需求,可得到模型A、B的推薦使用場合:模型A可能更多用于市面上銷售的中低端食用油,理論上其含有PAEs種類和量較多,使用模型A可以讓消費者對其消費產品有更加全面、清晰的認識,更好地保護消費者。而模型B則多適合一些高端食用油品的檢測,因為這類食用油在生產、制造、銷售等各方面都有完善的措施以減少PAEs危害的發生,調查顯示[27],高端食用油中PAEs檢出率很低。此時就可以選擇使用模型B測定DBP和DOP的量,以確保其達到國家相關要求,同時簡化實驗步驟和縮短運算時間,提高樣品測定速率。

2.3.2 回收率和精密度

對某一種經測定未檢出PAEs化合物的食用油進行加標回收率實驗,共設置8種添加水平,按本文1.3.4節部分進行6次平行實驗,分別使用模型A、B測定其濃度。同時通過普通紫外-可見分光光度法對加標樣品進行測定,樣品按1.3.4節部分進行提取、凈化、濃縮等預處理,并根據2.1.2節部分測定分析,結果見表5。模型A、B加標回收率和相對標準偏差(relative standard deviation,RSD),見表6。

表5 普通紫外-可見分光光度法加標試樣測定結果(n=6)Table 5 Results of ordinary UV-vis spectrophotometry spiked specimens (n=6)

表6 預報模型A、B 加標試樣預測結果分析(n=6)Table 6 Analysis of prediction results of prediction models A and B spiked specimens (n=6)

雖然普通紫外-可見分光光度法在相應的波長下對多種PAEs物質有吸收,且吸光度與濃度有較好的線性相關性(表2),但是如先前研究[11]所示,PAEs大多結構相似,最適吸收波長相近,測定時會相互干擾,故普通分光光度法不僅無法對其準確定性,且當樣品中多種PAEs并存時,測定準確度會大幅下降(表5)。而在多元線性回歸分析結合紫外-可見分光光度法測定中,對于模型A,其回收率分別為:DBP 94%～106%,DOP 94%～104%,BBP 93%～111%,RSD分別為:DBP 4.05%～4.79%,DOP 3.86%～5.13%,BBP 6.46%～7.09%;模型B的回收率分別為:DBP 95%～102%,DOP 96%～103%,RSD分別為DBP 2.56%～3.99%,DOP 2.22%～4.17%。

2.4 實際樣品測試分析

按照步驟1.3.4節對實際食用油樣品進行測定,經過模型A、B計算可分別得到樣品中DBP、DOP、BBP三物質的含量,測定結果與高效液相色譜法比較,結果見表7、表8。

表7 模型A與高效液相色譜法測定結果比較(n=6)Table 7 Comparison of model A and high performance liquid chromatography determination results (n=6)

由表7、表8可知,MLR-分光光度法與高效液相色譜法測得樣品中DBP、DOP、BBP的含量基本相近。同時,預報模型B對于油脂樣品中PAEs的測定具有更高的準確性,RSD均不超過3%,但該模型只能測定DBP、DOP 2種物質,故適用于所含PAEs類增塑劑主要為DBP、DOP且對準確性要求較高的樣品測定。預報模型A雖精度稍差于模型B,但其可同時測定DBP、DOP、BBP 3種物質,適用于同時含有DBP、DOP、BBP 3種增塑劑的樣品測定。

3 結論

a)經乙腈提取后,過Silica/PSA玻璃混合型固相萃取小柱凈化,采用多元線性回歸方法建立的同時測定DBP、DOP、BBP 3種物質的模型A和測定DBP、DOP兩種物質的模型B,結合紫外-可見分光光度法,同時測定食用油中鄰苯二甲酸酯類物質。該方法簡便、快速、成本低,適用于不具備液相、氣相、氣質聯用等較高端儀器的實驗室的樣品PAEs測定。

b)預報模型A加標回收率為93%～111%,可同時預測DBP、DOP、BBP;預報模型B加標回收率在95%～103%,可同時預測DBP、DOP且準確度較高。方法檢出限滿足食用油中鄰苯二甲酸酯類物質測試分析的相關要求。通過實驗分析探討得出,通過擴充前期實驗和改變模型相關參數可用于測定其他種類鄰苯二甲酸酯類物質。但預報模型的準確程度與待測物質數量、待測物質濃度范圍和數據相關性等有關,故在建立模型時需同時考慮以上多個因素。

c)該方法操作方便,且具有一定準確性,可為實際食用油樣品中DBP、DOP、BBP等PAEs的同時測定提供一種成本低廉、快速便捷的途徑,為食用油中塑化劑的基層監管工作提供技術支持。