電化學傳感器檢測食品中有機磷農藥殘留的研究進展

王惠,潘無雙,錢玟,林德賢,劉書亮,陳姝娟,何利

(四川農業大學 食品學院,四川 雅安,625014)

有機磷農藥是指磷酸酯或是硫代磷酸脂化合物,依照結構可分為磷酸酯、亞膦酸酯和磷酰胺及其相應的硫代衍生物[1]。有機磷農藥可與乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE)結合,生成磷酰化膽堿酯酶而無法水解乙酰膽堿,使得體內乙酰膽堿蓄積,導致膽堿能神經和部分中樞神經的過度興奮,從而產生中毒癥狀[2]。有機磷農藥的持續使用導致了環境和食品的污染,嚴重影響了人類健康。目前,用于食品中有機磷農藥殘留的檢測方法包括毛細管電泳法、膠體金法、酶聯免疫吸附法、色譜法、分光光度法和比色法[3]等,然而這些方法都存在一定的局限性,如操作步驟復雜、成本高、難以實現快速檢測、酶試劑易失活、結果不穩定以及重復性較差等缺點。針對上述問題,一些檢測食品中有機磷農藥殘留的新方法被開發,其中電化學傳感器由于其檢測速度快、成本低、靈敏度高而備受關注。

圖1 電化學傳感器檢測有機磷農藥Fig.1 Electrochemical sensors detect organophosphorus pesticides

可將電化學傳感器分為2個部分,分別是識別元件和信號轉換元件,利用電化學分析,一般以電極作為信號轉換器,以電勢或者電流為表現信號對目標物質進行檢測。檢測有機磷農藥常用的識別元件包括以下三類:1)以生物材料作為識別元件,例如AChE、有機磷水解酶(organophosphorus hydrolase, OPH)、核酸適配體、微生物、抗體等;2)以有機物為識別元件,如分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers, MIP)和肟類化合物等;3)以無機物為識別元件,如CuO、ZrO2、TiO2等。

1 電化學生物傳感器

1.1 電化學酶傳感器

電化學酶傳感器是以酶為識別元件的電化學傳感器,根據酶的不同作用,又可將電化學酶傳感器抑制型和催化型。

電化學抑制酶傳感器的識別元件大多采用 AChE或丁酰膽堿酯酶(butyrylcholinesterase,BChE),底物為乙酰膽堿(acetylcholine,ACh),AChE或BChE可以催化ACh,加入有機磷農藥后,有機磷農藥與AChE或BChE結合,從而抑制ACh的催化反應。檢測原理如下:將AChE或BChE固定在玻碳電極上,AChE或BChE可以將ACh催化生成電活性物質,產生電信號,加入有機磷農藥后,有機磷農藥的磷酸基團會和AChE或BChE發生共價結合,使AChE或BChE的催化能力降低,導致催化ACh生成的電活性物質減少,電信號會隨之變化,如圖2-a所示。

a-AChE為識別元件;b-OPH或產OPH微生物為識別元件;c-抗體為識別元件圖2 電化學生物傳感器檢測有機磷農藥的原理Fig.2 Principles of electrochemical biosensors to detect organophosphorus pesticides

GONG等[4]在修飾了Au-PPy交錯的網絡狀納米材料上負載了AChE用于甲基對硫磷的檢測,該傳感器具有良好的再現性,且檢出限為2 ng/mL。VIGNESH等[5]在AChE為識別元件的基礎上加以改善放大電信號的材料,修飾碳納米管并采用戊二醛交聯AChE包裹的牛血清蛋白納米復合材料對甲基對硫磷進行檢測,得到更低的檢出限:3.75×10-11mol/ L(0.099 ng/mL)。

此外,以AChE為識別元件的傳感器還可用來檢測久效磷、毒死蜱、甲基對硫磷、倍硫磷等有機磷農藥,均呈現較低的檢出限及較高的準確性[6-9]。以AChE作為識別元件制備的電化學傳感器材料易得,成本較低,但特異性較差,研究發現, AChE的活性也受氨基甲酸酯類農藥的影響,因此電化學AChE傳感器用于食品中時,會導致檢測有機磷農藥殘留的結果偏大。

電化學催化酶傳感器以OPH為識別元件,對食品中有機磷農藥殘留進行檢測。OPH能識別有機磷農藥中的結構,包括P—O、P—S、P—F、P—CN[10],使有機磷農藥水解成硝基苯酚,硝基苯酚的電化學活性可以表現出電信號的變化,如圖2-b所示。基于以上原理進行了大量研究,如PEDROSA等[11]成功制備以OPH為識別元件的電化學傳感器對含有P—O的對氧磷進行檢測。除此之外,DEO等[12]以碳納米管修飾電極并負載OPH,對對氧磷和含有P—S的甲基對硫磷進行檢測。

對氧磷和甲基對硫磷是分別含有P—O和P—S的有機磷農藥,OPH可催化這2種有機磷農藥水解,生成電活性物質,從而使電信號發生變化。電化學OPH傳感器只針對上述的結構有機磷農藥,具有良好的特異性,但OPH來自特定的微生物,目前還不能擴大生產。

電化學復合酶傳感器的識別元件是采用2種及2種以上的酶。除了上述的AChE和OPH單獨作為識別元件,也可以采用復合酶作為識別元件,SAHIN等[13]研究出一種以OPH和辣根過氧化物酶作為識別元件的電化學傳感器, OPH能夠水解有機磷農藥生成酚類物質,酚類物質的水解產物可作為電子轉移的介質,在辣根過氧化物酶電極上得到電信號,將該傳感器用于二氯倍硫磷的檢測,檢測效果良好。目前,電化學復合酶傳感器開發較少,對比單一酶作為識別元件的電化學傳感器,2種或2種以上復合酶傳感器的檢出限并未大幅度降低,針對電化學復合酶傳感器還需要進一步研究。以酶作為識別元件的電化學傳感器存在一些問題,如酶不易保存,在貯藏過程易出現酶活下降的現象,且放大電信號的材料需進一步篩選,重金屬材料會導致酶變失活等,對電化學酶傳感器的進一步研究還需解決上述問題。

1.2 電化學免疫傳感器

以抗原/抗體為識別元件的電化學傳感器稱為電化學免疫傳感器。將抗原/抗體修飾到電極上,分別用于檢測抗體/抗原,利用抗原抗體的特殊反應,以電信號的形式表現,實現對目標物的檢測,如圖2-c所示。因為抗原抗體的免疫免疫反應具有特異性,電化學免疫傳感器只需利用不同的抗原或抗體,就可以實現對不同有機磷農藥的檢測,并得到較好的檢測專一性。如LIU等[14]以對氧磷半抗原為識別元件,采用競爭法對對氧磷進行檢測,將該電化學免疫傳感器用于湖水、農田水、自來水和純凈水中對氧磷殘留的檢測,都得到較好的回收率。同時MEHTA等[15]采用抗對硫磷抗體為識別元件,實現對對硫磷的特異性檢測。

但抗原/抗體大多為蛋白質,易受溫度、pH值、介質環境等因素影響而導致其生物活性降低,需要特別考慮其儲藏穩定性。有研究表明通過改善貯藏條件及采用交聯劑處理,可以延長抗原/抗體識別元件的電化學穩定性,如MEHTA等[16]將所制備的電化學傳感器放置于4 ℃的冰箱中,50 d后傳感器的輸出信號減少小于5%;YIN等[17]采用交聯劑保護抗體的生物活性,使傳感器在9周后仍保留原來信號的85%。電化學免疫傳感器特異性好、靈敏度,但其核心識別元件抗原抗體的獲取困難,因此將電化學免疫傳感器擴大生產,還需解決抗原抗體的獲取問題。

1.3 電化學核酸適配體傳感器

核酸適配體是10～50個單鏈脫氧核糖核酸或核糖核酸通過指數富集(SELEX),由配體的系統進化產生,它們能夠以高親和力特異性結合各種分析物,進而特異性折疊成三維結構,核酸適配體可以形成廣泛的結構基序,包括發夾、莖、凸起、G-四鏈體和假結,通過疏水和范德瓦爾斯相互作用、氫鍵、芳香堆積等多種相互作用與目標物識別[18]。電化學核酸適配體傳感器是利用核酸適配體與目標物質進行特異性結合實現對目標物的檢測,如圖2-c所示。

核酸適配體針對目標物質進行設計,因此具有極強特異性,此外核酸適配體還具有可重復利用性。如KAUR[19]等制備核酸適配體成功應用于生菜樣品中馬拉硫磷的檢測,該傳感器表現出優異的選擇性。GUO等[20]以核酸適配體為識別元件制備電化學傳感器用于蘋果和大白菜中毒死蜱殘留的檢測,檢測效果準確且回收率高。該傳感器不僅具有良好的選擇性和重復性,并且可以通過尿素再生,實現重復使用。核酸適配體目前被認為是基于酶和抗體的潛在替代品,相比酶和抗體,核酸適配體穩定性較好,可形成與目標物相匹配的結構,特異性好,存在可重復性,但特定核酸適配體較高的成本及復雜的篩選都限制了電化學核酸適配體傳感器的進一步發展。

1.4 電化學微生物傳感器

電化學微生物傳感器以微生物的細胞或細胞表面的活性物質作為電化學傳感器的識別元件,如從環境篩選出能夠產生有OPH的微生物,OPH與有機磷農藥結合后會使其分解產生硝基苯酚等物質,硝基苯酚等物質具有電化學活性,基于此原理檢測有機磷農藥[21],如圖2-b所示。

MULCHANDANI等[22]研制出了一種由溶解氧電極組成的電化學微生物傳感器,以微生物為識別元件,該微生物能在細胞表面表達OPH,降解有機磷農藥并消耗氧氣,該傳感器對于對氧磷的檢出限為0.1 mmol/L。電化學微生物傳感器具有創新性,但與

電化學催化酶傳感器相比存在缺陷,微生物難以固定,且不同微生物的運動方式不同,導致固定方式的復雜性;電化學微生物傳感器由于其識別元件的特殊性,導致其穩定性相對于其他傳感器較差;微生物傳代較快,難以在檢測過程中確定微生物是否存活,導致檢測結果存在誤差。

2 電化學有機物傳感器

以生物材料為識別元件的電化學傳感器在應用方面受到一定的限制,如酶和抗體等物質會出現活力降低的現象,需要放置在4 ℃的條件下進行保存;核酸適配體成本高昂等。學者們開發出了一些有機物替代生物材料用于有機磷農藥的檢測,如分子印跡聚合物、肟類化合物等。

2.1 電化學分子印跡傳感器

分子印跡聚合物molecular imprinted polymers,MIPs)是一類聚合材料,目標分子表現為模板,交聯的單體圍繞著目標分子進行排列聚合,形成特定的結合腔,結合腔的形狀和官能團可以與目標分子特異性結合,實現對目標分子的檢測[23]。電化學分子印跡傳感器是利用MIPs與目標物質的特異性結合,將該反應轉換為電信號,實現對目標物的檢測,如圖3所示。

圖3 電化學分子印跡聚合物/肟類化合物傳感器檢測有機磷農藥的原理Fig.3 Principles of electrochemical molecularly imprinted polymer/oxime compound sensors for detecting organophosphorus pesticides

研究者利用此原理通過改善修飾材料和制備MIPs的原材料從而改善電化學MIPs傳感器的檢測性能,如ZOUAOUI等[24]基于殼聚糖電沉積印跡草甘膦的MIPs,成功用于草甘膦的檢測,檢測時間為30 min。而DING等[25]通過在聚吡咯納米管的壁上和表面上印跡草甘膦位點制備得到針對于草甘膦的電化學分子印跡傳感器,將其用于檢測橙汁和大米飲料中的草甘膦殘留,回收率分別為97.45%～101.69%和94.54%～102.79%。且制備的傳感器檢測時間更短。

電化學MIPs傳感器的識別元件通過印跡不同的有機磷農藥可以實現對其他有機磷農藥的檢測,大量研究表明,能將分子印跡聚合物用于多種有機磷農藥的檢測[26-27]。分子印跡聚合物是針對特定的目標物進行設計,具有良好特異性和重復使用性,但其制備過程復雜,且模板分子需采用純度較高的單體,制備成本較高,限制了該方法在食品中有機磷農藥殘留快速檢測領域的應用。

2.2 電化學肟傳感器

肟類化合物能與有機磷農藥結合發生反應,使其磷酰化,利用此原理制備電化學肟傳感器對有機磷農藥進行檢測,如圖3所示。WU等[28]制備識別元件4-氨基苯乙酮肟對二乙基氰基膦酸酯進行檢測,該傳感器具有較廣的檢測范圍,并能用于檢測其他有機磷農藥,如樂果、殺螟硫磷等有機磷農藥。以肟類化合物為識別元件的電化學傳感器對有機磷農藥的檢測具有良好特異性,檢出限低等優勢,但肟類化合物合成步驟繁雜且合成原料具有毒性,限制了電化學肟傳感器的大規模應用。

以有機物為識別元件的電化學傳感器雖然穩定性好,但其制備流程復雜、制備所用有機物大多存在毒性、污染較大,為了避免出現上述問題,以無機物為識別元件的電化學傳感器也被廣泛研究。

3 電化學無機物傳感器

3.1 電化學CuO傳感器

電化學無機物傳感器利用無機物與有機磷農藥進行結合,得到電信號變化,從而實現對有機磷農藥的檢測,識別元件可以為CuO、TiO2、ZrO2等無機化合物。據研究發現,銅或含銅化合物與硫代化合物具有良好的親和力[29],可以與含硫的有機磷農藥進行結合形成配合物,引起電信號的變化,如圖4所示。

圖4 電化學CuO傳感器檢測有機磷農藥的原理Fig.4 Principles of electrochemical CuO sensors to detect organophosphorus pesticides

由于馬拉硫磷和甲基對硫磷都屬于含硫的有機磷農藥,因此電化學Cu/CuO傳感器可對這類農藥進行檢測。如HUO等[30]在玻碳電極上修飾了單壁碳納米管和氧化銅納米線對馬拉硫磷進行檢測,該電化學傳感器對馬拉硫磷的檢測顯示出良好選擇性、靈敏度和較寬的線性范圍,將大蒜中加入馬拉硫磷,檢測得到回收率良好。李瓊[31]通過簡單混合的方式得到銅納米線和石墨烯/殼聚糖復合納米材料并將其成功用于甲基對硫磷的檢測。

電化學銅傳感器操作簡便,環境污染小,可以實現馬拉硫磷和甲基對硫磷等含硫有機磷農藥的檢測,但銅也能和EDTA[32]和檸檬酸[33]等物質進行配位結合,導致該檢測方法易受干擾、檢測結果準確度不高。

3.2 其他氧化物電化學傳感器

除了CuO,其他納米金屬、納米金屬氧化物及其復合物也對有機磷農藥表現出特殊催化活性和吸附性,如ZrO2等,ZrO2對磷酸基團有很強的親和力[34],GAO等[35]在玻碳電極上合成了Au、ZrO2和石墨烯復合材料對大白菜中的甲基對硫磷進行檢測,得到96.2%～102.1%的回收率。以無機物為識別元件的電化學傳感器無毒,但其與有機磷農藥配位結合力特異性不強,易受其他物質的干擾。

4 不同種類電化學傳感的比較

不同的電化學傳感器在應用于實際檢測食品中有機磷農藥殘留時各有優缺點(表1)。電化學AChE傳感器成本較低,在食品中有機磷農藥殘留檢測領域的應用已經較為成熟,但該方法特異性差的問題仍未解決。電化學OPH傳感器具有良好特異性,由于目前OPH來自特定微生物,將其應用于有機磷農藥殘留的檢測需要解決其生產問題。電化學免疫傳感器特異性好,靈敏度高,但抗原/抗體獲取仍存在困難;電化學核酸適配體傳感器是近幾年研究較多的電化學傳感器,針對不同的物質可以篩選出不同的結構,特異性好,但每種有機磷農藥需要篩選與其特異性結合的適配體,特定的二級結構形成機制復雜,且核酸適配體的成本問題仍沒有得到解決。電化學微生物傳感器具有創新性,但由于微生物的特殊性,導致該電化學傳感器穩定性較差。電化學分子印跡聚合物傳感器穩定性好,易保存,可重復使用,但分子印跡聚合物的功能單體價格較為昂貴,制備時間長且多數有機物存在毒性。電化學肟傳感器針對有機磷農藥有很強特異性且來源較廣,但肟類化合物易氧化及部分肟類化合物存在毒性。電化學無機物傳感器雖然無毒,但特異性差,如銅可以和多種化合物進行配合。綜上,電化學傳感器仍需進一步優化方法,以實現在食品中有機磷農藥殘留檢測的廣泛應用。

表1 不同種類電化學傳感器用于檢測食品中有機磷農藥的優缺點Table 1 Advantages and disadvantages of different types of electrochemical sensors in detecting organophosphorus pesticides in food

5 結論與展望

電化學傳感器是食品中快速檢測有機磷農藥殘留的研究熱點,但應用于食品中的有機磷農藥殘留的檢測仍存在如下問題:(1)電化學傳感器的識別元件存在缺陷。易受介質環境其他物質的干擾;部分識別元件制備成本高,制備過程環境污染大,難以應用于實際食品中有機磷農藥殘留快速檢測。(2)放大電信號材料有待進一步研究,食品中殘留的有機磷農藥含量少,因此在制備電化學傳感器時需要修飾提高電化學性能的材料,但在使用提高電化學性能材料的同時會帶來額外的一些問題,如多孔材料吸附非檢測目標物質而帶來干擾;金屬納米材料易發生團聚現象導致檢測靈敏性降低等;(3)電化學傳感器需進一步研究其系統化和功能化。目前大多研究電化學傳感器仍配置的電化學工作站進行研究;有機磷農藥降解速度快,因此很難實現對食品中有機磷農藥殘留的快速、實時現場檢測;目前大多前處理方法仍采用國標方法的前處理方法,缺少針對于電化學傳感器的前處理方法。

電化學傳感器快速檢測食品中有機磷農藥殘留具有儀器簡單、響應速度快、檢測靈敏度低等優點,具有較高的應用潛力,尤其以下發展方向值得關注:(1)開發具有選擇特異性好、毒性低且環境友好、制備成本低的識別元件;制備靈敏性、選擇性、可重復性和穩定性俱佳的有機磷農藥殘留檢測的電化學傳感器,如研究可替代MIPs的廉價材料、改良核酸適配體篩選方法以降低識別元件成本等研究;改善電化學免疫傳感器的儲藏環境及制備條件,以保持識別元件的生物活性,增強其貯藏穩定性、延長保質期,進一步提高其在食品中有機磷農藥殘留檢測的應用潛力。(2)篩選、研究新的可提高電化學性能的材料或方法,以避免或降低由材料帶來的對電化學傳感器檢測的不利影響;(3)電化學傳感器檢測方法的系統化、功能化研究,開發適宜的樣品前處理方法配合電化學傳感器對實時、在線、現場快速檢測的需求,并配合儀器制造,將高選擇性、高靈敏度的電化學傳感器轉變為自動化、多功能化的自動檢測電化學分析儀器。