紫杉醇對視網膜Müller細胞的影響

席懿璇,葉亞婷,竇國睿,常天芳,牛亞麗1,,周子義,儲昭節

0 引言

紫杉醇(Paclitaxel,PTX)是20世紀90年代從紅豆杉中分離提純出的四環二萜類天然抗腫瘤藥物,具有聚合和穩定微管的作用,致使快速分裂的腫瘤細胞在有絲分裂階段被牢牢固定,使癌細胞復制受阻斷而死亡[1]。PTX對于食道癌、乳腺癌、卵巢癌和白血病等多種疾病具有一定的療效,但隨著臨床的不斷深入研究,發現PTX在腫瘤疾病的治療過程中可導致一系列不良反應,骨髓抑制、神經毒性、消化道反應、過敏反應和肌肉疼痛、關節疼痛等均為常見不良反應[2]。近年來關于PTX化療導致的黃斑水腫病例偶有報道[3-4],但并未對其具體發生機制進行闡述。而推測集中于PTX干擾Müller細胞所維持的視網膜神經感覺滲透梯度,對Müller細胞具有潛在毒性[5]。為明確PTX對Müller細胞的影響,本研究將體外培養的Müller細胞作為實驗對象,觀察PTX對Müller細胞增殖、細胞周期、形態及屏障功能的影響,為闡明PTX導致黃斑水腫的具體機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1材料鼠Müller原代細胞為自行提取。DMEM 培養基(高糖)購于Gibco公司(美國)。PTX購于MedChemExpress(MCE)公司(美國)。流式細胞儀及配套試劑盒購自Invitrogen(美國)。Cell Counting Kit-8(CCK8)試劑盒購自武漢華美公司(美國)。IL-6(ab259341)、TNF-α(ab307164)、碳酸酐酶十四(CA XIV,ab184180)、MCP-1 (ab308522)、VEGF (ab32152)、鬼筆環肽(ab176753)抗體購自Abcam公司(英國)。β-actin(81115-1-RR)抗體及其二抗購自武漢三鷹公司。酶標儀(ELX800,Bio-Teck,美國)。

1.2方法

1.2.1細胞的提取及分組將新生第6～8d C57BL/6J小鼠腹腔麻醉后,摘取眼球浸泡在10% DMEM中2h左右。在37℃下消化45min(消化液:DMEM 0.5mL,0.25%胰蛋白酶1mL,膠原蛋白酶Ⅰ 1mL)。消化完成后剝取視網膜并制成細胞懸液,500g離心5min,用10% DMEM重懸后通過100μm篩,密度按每6～9只眼接種在100mm培養皿中孵育。當細胞融合至70%左右,進行后續傳代培養或后續實驗。使用免疫熒光鑒定小鼠視網膜中提取的Müller細胞。免疫熒光結果顯示Müller細胞特異性標記物AQP4和GS呈陽性(圖1A)。將Müller細胞分為兩組:對照組(正常培養)、PTX藥物處理組,藥物處理濃度依次為0.005、0.05、0.5、5mg/L。

圖1 PTX藥物刺激后對Müller細胞增殖和凋亡的影響 A:Müller細胞鑒定圖;B:各濃度細胞不同時間點增殖圖;C:各濃度細胞不同時間點凋亡圖。

1.2.2CCK8法檢測細胞增殖情況100μL的Müller細胞以每毫升7×104個接種于96孔板中,將96孔板放置于37℃、5% CO2細胞培養箱中進行培養,培養至細胞貼壁后,更換培養基培養12h,按照對照組、0.005、0.05、0.5、5mg/L藥物濃度梯度分別培養12、24、36、48、72h,每個孔中加入CCK-8溶液10μL繼續孵育3h;酶標儀測定450nm處吸光度(OD)值。

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡情況將對數生長期的Müller細胞以每毫升7×104個接種于96孔板中,將其放置37℃、5% CO2細胞培養箱中培養,細胞貼壁后更換無血清培養基繼續培養12h,按照對照組、0.005、0.05、0.5、5mg/L藥物濃度梯度分別培養12、24、36、48、72h,0.1%胰蛋白酶消化Müller細胞,1000r/min離心5min;加入Annexin V-FITC,室溫下避光孵育20min,加入碘化丙啶(PI)染色液混勻,冰浴避光孵育5min。使用流式細胞儀檢測熒光染色后的細胞,并使用BD FACSuite軟件進行分析,綠色熒光為Annexin V-FITC,紅色熒光為PI。

1.2.4流式細胞術檢測細胞周期細胞培養方法與1.2.3相同,細胞貼壁后更換無血清培養基培養12h,然后按照對照組、0.05mg/L藥物濃度培養24h,0.1%胰蛋白酶消化,加入預冷70%乙醇并固定24h,固定后加入Trition X-100、RNA酶,37℃水浴30min,PI染色。流式細胞儀檢測以標準程序進行測定,測定結果計數,對測定結果進行整理與分析。

1.2.5免疫熒光觀察細胞形態將Müller細胞以每毫升2×105個的接種密度接種到細胞共聚焦培養皿中培養,細胞培養至70%時更換培養基培養12h,將對照組、0.05mg/L PTX的培養基以換液方式加入共聚焦培養皿中培養24h;4% PFA室溫固定20～30min,然后在1%牛血清白蛋白(albumin from bovine serum,BSA)和0.5% Trition X-100[磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)稀釋]的封閉溶液中封閉30min。加入鬼筆環肽(Phalloidin)染料(1∶200),并用上述封閉液稀釋, 4℃濕盒中孵育24h。PBS洗滌共聚焦培養皿,用含4,6-二氨基-2-苯基吲哚(4,6-diamino-2-phenyl indole,DAPI)封片液進行染色密封,在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6Westernblot檢測蛋白表達水平分別收集對照組、0.05mg/L PTX處理24h后的細胞至Ep管,加入適量的RIPA細胞裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑(100∶1)進行離心,吸取上清為細胞總蛋白;加入30μg蛋白進行電泳分離,將蛋白轉至PVDF膜上,轉膜時間根據蛋白自身分子量決定;轉膜后放置在TBST配制的5%脫脂牛奶中,常溫條件下封閉2h;將封閉完成的PVDF膜與IL-6、TNF-α、CA XIV、MCP-1、VEGF抗體(1∶1000)4℃下孵育24h,孵育后用TBST洗膜;孵育完成的PVDF膜與同源二抗(1∶10000)進行共同孵育,常溫條件下共同孵育2h,孵育后用TBST洗膜。在PVDF膜上淋灑適量ECL化學發光液,在暗室中進行掃膜與成像。利用Image J Program掃描和測量條帶的相對光密度(內參β-actin)。

1.2.7qRT-PCR檢測mRNA表達水平收集對照組、0.05mg/L PTX處理24h后的細胞至Ep管(經DEPC處理)中,加入適量的Trizol溶液使其完全裂解;加入1/5總體積的氯仿,充分混合并離心;將上層水相移至新管并加入同體積的異丙醇溶液低溫離心,移除上清液后加入無水乙醇再次低溫離心,倒出上清液,使Ep管干燥并加入DEPC水,而后使用TaKaRa試劑盒進行RNA反轉錄,反轉錄體系為2μL 5×PrimeScript RT Master Mix、2.5μL Total RNA、5.5μL RNase Free dH2O,37℃下反應15min。采用TaKaRa PrimeScritTMRT(Perfect Real Time)試劑盒進行qRT-PCR實驗,采用β-actin為作為內參對照,qRT-PCR體系為10μL TB Green Premix Ex Taq Ⅱ、0.8μL PCR Reverse Primer(10μmol/L)、0.8μL PCR Forward Primer(10μmol/L)、0.4μL ROX Reference Dye、6μL RNase Free ddH2O和2μL cDNA。反應程序為95℃變性10s、60℃退火20s、72℃延伸20s。

統計學分析:使用軟件GraphPad Prism v9.1.0.221.進行統計學結果分析,所有的數據均使用均數±標準差表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1PTX對細胞增殖的影響CCK8法檢測細胞增殖結果顯示,PTX組在處理細胞后不同時間點細胞增殖率較對照組均下降(圖1B)。低濃度(0.005、0.05mg/L)PTX處理細胞12h后細胞增殖未受到抑制,細胞存活率為93.1%,高濃度(5mg/L)PTX刺激細胞72h后細胞存活率為37.9%,說明PTX抑制Müller細胞增殖,且與時間和藥物濃度呈依賴性。

2.2PTX對細胞凋亡的影響流式細胞術檢測細胞凋亡結果顯示,PTX組在刺激細胞后不同時間點細胞凋亡率較對照組均升高(圖1C)。在PTX組不同處理條件中,對照組、0.005、0.05、0.5、5mg/L PTX刺激細胞12h,細胞凋亡率無明顯差異。不同濃度PTX處理細胞48h時,細胞凋亡率較對照組均升高(圖1C)。PTX組處理細胞72h時,細胞壞死。在PTX不同處理條件中,0.05mg/L PTX處理24h細胞凋亡率最低,因此在后續實驗中選擇該藥物濃度和作用時間。

2.3PTX對細胞周期的影響流式細胞儀檢測細胞周期結果顯示,0.05mg/L PTX藥物處理細胞24h后,細胞周期較對照組發生改變(圖2),PTX藥物將細胞阻滯于G2-M期。

圖2 流式細胞儀檢測細胞周期 A:對照組;B:0.05mg/L PTX組。

2.4PTX對細胞形態的影響0.05mg/L PTX藥物處理細胞24h后,細胞形態發生明顯變化(圖3)。正常細胞呈現細長纖維狀,細胞形態比較清晰、成簇或平行排列。而在PTX藥物的刺激下,細胞數量明顯減少且細胞皺縮趨于圓形。

圖3 免疫熒光觀察細胞形態。

2.5Westernblot和qRT-PCR檢測相關因子表達結果Western blot實驗結果表明,0.05mg/L PTX處理細胞24h后與對照組相比Bcl-2表達降低;Bax表達較對照組升高(圖4A、B,表1),差異均有統計學意義(P<0.01),CA XIV較對照組表達升高,VEGF較對照組表達降低(圖4C、D,表1),差異均有統計學意義(P<0.05)。

表1 兩組細胞間相關蛋白表達情況比較

Western blot與qRT-PCR實驗結果表明,0.05mg/L PTX處理細胞24h后細胞炎癥因子IL-6、TNF-α及趨化因子MCP-1蛋白相對表達較對照組均升高(圖5),差異具有統計學意義(均P<0.05)。當PTX停止處理24～72h后,Western blot結果顯示炎癥因子IL-6、TNF-α及細胞趨化因子MCP-1蛋白相對表達較0.05mg/L PTX藥物組均降低(圖6),差異均有統計學意義(FTNF-α=3.712,FIL-6=9.341,FMCP-1=5.142,均P<0.05)。

圖5 PTX刺激Müller細胞后MCP-1、TNF-α、IL-6蛋白表達水平與mRNA表達水平示意圖 A:蛋白電泳圖;B:IL-6、MCP-1、TNF-α蛋白表達統計圖;C:IL-6、MCP-1、TNF-α mRNA相對表達統計圖。

3 討論

紫杉醇是在紫衫中提取出的具有抗腫瘤作用的物質[6],Wani等[7]明確了提取物關鍵成份的結構組成,紫杉醇具有較強的疏水性,在體內釋放后可在釋放位置有效保留[8],紫杉醇也具有抑制平滑肌細胞增殖的作用[9-10]。紫杉醇的這些特性使得其在腫瘤方面的療效顯著,但臨床應用時也會引起較多不良反應,黃斑水腫是不良反應之一,可對視力造成威脅,發病率約在0.5%[11]。

黃斑水腫是指血-視網膜屏障(blood-rentinal barrier,BRB)破壞后液體在黃斑區視網膜內積聚[12],機制可能是視網膜血管內皮細胞屏障或色素上皮細胞外屏障的功能缺陷而導致細胞外液外漏,在黃斑區外叢狀層Henle纖維之間積存而形成黃斑水腫[13]。而Müller細胞作為連接視網膜血管與神經元,維持水與K+穩態的重要分子,當Müller細胞出現功能障礙時便會造成液體積聚造成黃斑水腫[14]。PTX導致黃斑水腫的機制并不明確,沒有明確推薦的治療方案。在lvarez-Fernández等[15]研究中90%以上的病例的治療方案是停止使用紫杉醇。也有其他的藥物治療手段如碳酸酐酶抑制劑[16]、貝伐單抗[17]和地塞米松玻璃體植入物[18]等,但治療效果欠佳。

黃斑水腫種類多樣,常見的黃斑水腫如糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema,DME)、視網膜靜脈阻塞繼發黃斑水腫(retinal vein occlusion-macular edema,RVO-ME),但紫杉烷類藥物即PTX所致黃斑水腫臨床特點與上述常見黃斑水腫不同,具有黃斑囊樣水腫(CME)特征;光學相干斷層掃描(optical coherence tomography,OCT)檢查結果顯示黃斑中心凹厚度增加,黃斑囊樣改變,但熒光素眼底血管造影(fundus fluorescein angiography,FFA)檢查結果顯示無熒光滲漏或滲漏極小[19-20]。PTX引起黃斑水腫的具體機制并不明確,目前已經提出了幾種假說:(1) Kanakis等[21]提出的PTX導致的黃斑水腫的潛在原因可能是發生在中層和深層神經叢水平的水通道蛋白被影響,水通道蛋白在細胞中取決于微管的功能,而微管的功能會因為PTX的作用而改變,最終由于這種水運輸的途徑被阻塞而出現水腫;(2)有學者認為眼底血管造影中的無滲漏或極少滲漏,可能是由于PTX對視網膜血管內皮損傷較輕,導致的黃斑水腫可能是PTX對Müller細胞的毒性作用[5],Müller細胞功能出現障礙造成黃斑部分液體積聚[14]。黃斑水腫的發生機制到底是PTX影響微管功能從而影響水通道蛋白導致黃斑水腫,還是PTX對于Müller細胞的潛在毒性,亦或是二者均參與仍需進一步研究闡明。

而本實驗結果表明,PTX可以抑制體外培養的Müller細胞,且與時間和藥物濃度呈依賴性。0.05mg/L PTX處理細胞24h,細胞增殖受到明顯抑制,且促進了細胞凋亡。PTX處理Müller細胞后,細胞周期被阻滯于G2-M期,細胞形態也由形態清晰、細長纖維狀的正常形態趨于圓形,細胞數量顯著減少。長時間使用藥物PTX刺激Müller細胞后,Müller細胞基本壞死,且短時間高濃度的藥物處理Müller細胞使細胞凋亡加快。不同濃度PTX刺激細胞時的炎癥因子如IL-6、TNF-α、MCP-1的表達升高,但這種高表達可通過停止藥物刺激緩解,提示PTX致使黃斑水腫的具體機制可能與細胞炎癥關系不顯著。目前我們的研究結果表明PTX對Müller細胞的潛在毒性導致Müller細胞功能出現障礙、視網膜屏障被破壞,造成黃斑部分液體積聚,引起了此類黃斑水腫的發生。

綜上,紫杉烷類藥物對視網膜存在潛在毒性,其通過抑制Müller細胞的增殖、促進其凋亡、阻滯細胞周期、改變細胞形態等造成視網膜屏障破壞,可能參與引發黃斑水腫,具體機制有待進一步研究。