DNA甲基化修飾在眼科疾病發(fā)病進程中的作用研究進展

楊朝暉,劉金鵬,郭大東,畢宏生,3

0 引言

早在1944年Avery等[1-2]在研究肺炎球菌中存在的生物活性物質(zhì)中就發(fā)現(xiàn)了DNA甲基化修飾,到20世紀80年代,研究證實DNA甲基化修飾參與了基因調(diào)控和細胞分化等重要的生命過程,人們逐漸意識到DNA甲基化修飾在生命發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。DNA甲基化修飾屬于表觀遺傳修飾的范疇,表觀遺傳修飾是指在不改變DNA序列的前提下產(chǎn)生穩(wěn)定可遺傳的表型變化,并且隨著環(huán)境的變化能夠發(fā)生可逆性的改變[3-4]。隨著研究的發(fā)展,近年來人們發(fā)現(xiàn)DNA甲基化修飾可能參與了多種眼病的發(fā)病進程,包括Fuchs角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良(Fuchs endothelial corneal dystrophy,FECD)、糖尿病視網(wǎng)膜病變、年齡相關性黃斑變性、葡萄膜炎、近視、視網(wǎng)膜母細胞瘤和葡萄膜黑色素瘤等,這為尋找相關眼病的發(fā)病機制以及發(fā)現(xiàn)新的治療靶點提供了思路,本文就DNA甲基化修飾在眼病中的作用作簡要綜述。

1 DNA甲基化修飾

DNA甲基化修飾是最早發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳修飾方式之一,是指通過DNA甲基轉移酶將S腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)的甲基基團共價添加到CpG二核苷酸的胞嘧啶5’位碳原子上形成5-甲基胞嘧啶(5mC)(圖1)。DNA甲基化修飾是一種動態(tài)可逆的酶促反應過程,依賴DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase, Dnmts)發(fā)揮作用。Dnmt1是維持型甲基轉移酶,執(zhí)行維持甲基化功能,即能夠將DNA雙鏈中僅有一條鏈甲基化的DNA完全甲基化,而Dnmt3a和Dnmt3b執(zhí)行從頭甲基化功能,是指不依賴已有的DNA甲基化鏈在非甲基化位點引入甲基,為未修飾的DNA建立新的甲基化模式。

圖1 DNA甲基化修飾示意圖。

DNA甲基化修飾常發(fā)生于CpG島(CpG islands,CGIs),CGIs是富含CG序列的區(qū)域,通常存在于基因啟動子中[5]。在正常細胞中,DNA甲基化修飾確保了基因表達的適當調(diào)節(jié)和穩(wěn)定的基因沉默,一旦DNA甲基化修飾發(fā)生異常改變,就會引起疾病的發(fā)生。目前已證實,DNA甲基化修飾與多種眼科疾病密切相關,異常的DNA甲基化修飾可嚴重危害人類的眼健康。

2 DNA甲基化修飾異常和眼科疾病

2.1DNA甲基化修飾與角結膜疾病

2.1.1DNA甲基化修飾與FECD 角膜內(nèi)皮細胞的穩(wěn)態(tài)對于維持角膜透明度至關重要。FECD角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良是一種雙側角膜內(nèi)皮細胞功能障礙引發(fā)的角膜混濁和視力喪失的疾病,分為早發(fā)性FECD和遲發(fā)性FECD。研究表明,遲發(fā)性FECD的角膜內(nèi)皮細胞中miR-199b啟動子DNA高甲基化導致miR-199b-5p表達下調(diào),使其調(diào)控的靶基因Snai1和ZEB1表達增加,證實miR-199b-5p可能作為預防或減緩FECD疾病進展的潛在治療靶點[6]。Khuc等[7]發(fā)現(xiàn),遲發(fā)性FECD中基因SLC4A11的啟動子DNA高甲基化可導致SLC4A11基因沉默,進而影響離子運輸功能,導致角膜內(nèi)皮失代償。因此,啟動子區(qū)的DNA甲基化修飾異常可能與FECD有關。

2.1.2DNA甲基化修飾與其他角結膜疾病角膜是眼球生理結構的最外層,極易受到外界的刺激和傷害。角膜的堿性灼傷因為伴隨著新生血管形成和纖維化成為眼睛最難處理的損傷之一。在角膜損傷小鼠模型中發(fā)現(xiàn),Dnmt3b的表達升高導致mTOR啟動子發(fā)生從頭甲基化,使得mTOR表達下調(diào),從而延緩角膜新生血管的生成[8],證實DNA甲基化修飾在PI3K/AKT/mTOR信號軸中發(fā)揮作用。而在角膜損傷修復過程中發(fā)現(xiàn),角膜上皮創(chuàng)傷愈合期間Dnmt1和Dnmt3b表達顯著上調(diào)可導致全基因組DNA甲基化,并通過靶向miR-200a和CDKN2B增強進角膜上皮傷口的愈合過程[9],為治療角膜上皮傷口愈合提供新型潛在藥物靶點。圓錐角膜是一種可能導致視力喪失的角膜疾病,受到遺傳和環(huán)境因素的雙重影響。Kabza等[10]對人類角膜組織進行DNA甲基化修飾測序發(fā)現(xiàn)圓錐角膜組織中12個下調(diào)基因和6個上調(diào)基因位于已確定的甲基化差異區(qū)域附近。進一步研究發(fā)現(xiàn),分泌型糖蛋白WNT5A和WNT3的外顯子區(qū)域高度DNA甲基化修飾引起了WNT5A下調(diào)、WNT3上調(diào),說明DNA甲基化修飾能夠通過多種不同機制影響WNT通路,參與調(diào)節(jié)角膜上皮干細胞的增殖功能。眼組織的瘢痕修復多與纖維化密切相關,在結膜上皮細胞中發(fā)現(xiàn),miR-200位點啟動子的DNA去甲基化對于延緩人結膜上皮細胞中的間充質(zhì)轉化至關重要[11]。上述研究表明,開發(fā)基于表觀遺傳學的新型治療藥物用于治療與上皮細胞間充質(zhì)轉化相關的結膜疾病,具有重要價值和光明前景。

2.2DNA甲基化修飾與葡萄膜炎葡萄膜炎(uveitis)是常見的眼內(nèi)炎癥性疾病,嚴重者可導致視覺障礙甚至失明。我們前期研究發(fā)現(xiàn),葡萄膜炎患者外周血中DNA去甲基化酶TET2的過度表達能夠導致Notch1基因的低甲基化,促進初始CD4+T細胞分化為Th17亞群,從而影響葡萄膜炎患者Th17/Treg比例的平衡,表明Notch1基因的低甲基化與葡萄膜炎的發(fā)生密切相關[12]。另有研究證實,與活動性葡萄膜炎患者相比,臨床癥狀緩解患者的外周血單核細胞在FOXP3啟動子和TIGIT基因座的CpG位點的DNA甲基化修飾水平較低,通過體外功能研究證實臨床緩解患者TIGIT的高表達,可有效抑制T細胞增殖,這為治療復發(fā)性葡萄膜炎提供了治療方向[13]。在實驗性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)大鼠視網(wǎng)膜中觀察到Tbx21的兩個CpG位點,和Rorc的一個CpG位點在EAU期間顯示出顯著的甲基化變化,進而影響Th1和Th17轉錄因子的表達并促進EAU的發(fā)展[14]。Zou等[15]在EAU大鼠模型中發(fā)現(xiàn),DNA甲基化抑制劑zebularine可以靶向CD4+T細胞控制眼內(nèi)炎癥和視網(wǎng)膜損傷,提示zebularine有可能成為葡萄膜炎新候選治療藥物,但缺乏臨床研究證據(jù)。

2.3DNA甲基化修飾與視網(wǎng)膜疾病

2.3.1DNA甲基化修飾與視網(wǎng)膜發(fā)育多項研究證實DNA甲基化修飾在許多動物的視網(wǎng)膜發(fā)育中發(fā)揮重要作用。在小鼠視網(wǎng)膜胚胎祖細胞(retinal progenitor cells,RPCs)中,控制視桿和視錐光傳導基因表達的啟動子區(qū)域高度甲基化,然而在成熟的光感受器中,這些區(qū)域相對于RPC是未甲基化或低甲基化的,證實DNA去甲基化途徑是視網(wǎng)膜中光感受器發(fā)育所必需[16]。此外也有研究表明,小鼠視網(wǎng)膜視桿光感受器的全基因組甲基化模式可能隨著年齡的增長而變化,與年齡有關的DNA甲基化修飾的變化不是隨機的,而是定位在特定區(qū)域[17]。綜上所述,DNA甲基化修飾是暫時性的,TET酶將甲基轉化為羥甲基胞嘧啶,隨后轉化為甲酰胞嘧啶和羧基胞嘧啶,然后通過堿基切除修復,促進基因的去甲基化。在雛雞中發(fā)現(xiàn)TET3是DNA去甲基化和視網(wǎng)膜再生的重要因素,積極的DNA去甲基化能夠消除表觀遺傳障礙從而再生視網(wǎng)膜[18],因此DNA甲基化修飾在視網(wǎng)膜發(fā)育過程中發(fā)揮基因表達調(diào)節(jié)劑的重要作用。

2.3.2DNA甲基化修飾與糖尿病視網(wǎng)膜病變糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病常見的眼底病變,可導致視力的不可逆性損傷。研究發(fā)現(xiàn),糖尿病患者的視網(wǎng)膜線粒體腫脹,線粒體融合蛋白MFN2啟動子DNA甲基化修飾導致其表達下調(diào),而Dnmt抑制劑能夠維持糖尿病中的線粒體穩(wěn)態(tài),并可減輕糖尿病患者視網(wǎng)膜病變的發(fā)展[19]。半胱氨酸β合成酶(CBS)和亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)的啟動子DNA高甲基化可以干擾同型半胱氨酸的正常清除,進而導致同型半胱氨酸的循環(huán)水平升高,從而增加視網(wǎng)膜病變風險[20]。對人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞ACBRI 181細胞中進行MeDIP-seq等測序后通過高血糖大鼠模型進行研究發(fā)現(xiàn),葉酸對DR視網(wǎng)膜微血管細胞DNA甲基化修飾的調(diào)節(jié)具有重要影響[21],葉酸和維生素B12與維持同型半胱氨酸的代謝密切相關,因此補充葉酸和維生素B12可能延緩糖尿病患者視網(wǎng)膜病變的發(fā)病進程,降低DR的風險,但其治療效果背后的DNA甲基化修飾機制仍需進一步探究。此外,Dnmt1在糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜中表達升高,但引起絲氨酸消旋酶(serine racemase,SR)表達增加,表明正調(diào)節(jié)因子可能會超越糖尿病視網(wǎng)膜中甲基化的沉默效應,導致DR的發(fā)生[22]。因此,Dnmt抑制劑有可能成為治療DR的有效方法,但其是否存在與癌癥治療藥物類似的副作用,是否會影響視網(wǎng)膜的結構與功能,仍需進一步研究。

Rac1啟動子中H3K9me3的增加有助于Dnmt1的活化,Dnmt1通過DNA甲基化-羥甲基化增加Rac1表達,使得Nox2表達升高,產(chǎn)生胞質(zhì)活性氧損傷視網(wǎng)膜線粒體從而導致視網(wǎng)膜病變的發(fā)生[23]。肥胖/高脂血癥能夠進一步增強線粒體DNA(mtDNA)和Rac1啟動子的表觀遺傳修飾,加速線粒體損傷,促進DR的發(fā)展。因此,保持良好生活方式也可能有利于調(diào)節(jié)糖尿病患者的表觀遺傳修飾從而延緩視網(wǎng)膜病變的進展[24],而對Rac1 DNA甲基化修飾的干預可能是DR的治療手段。

在DR的發(fā)展過程中,視網(wǎng)膜線粒體的損傷可能是由于堿基錯配增加引起的。Mishra等[25]發(fā)現(xiàn)DNA甲基化修飾和堿基錯配之間呈正相關關系,通過調(diào)節(jié)DNA甲基化修飾水平可顯著抑制堿基錯配,并能阻止DR的發(fā)展。糖尿病患者在控制血糖后,視網(wǎng)膜病變也會繼續(xù)進展,這種“代謝記憶”現(xiàn)象可能與DNA甲基化修飾和堿基錯配之間的串擾有關。此外,研究發(fā)現(xiàn)應用DNA甲基化修飾抑制劑可以通過維持線粒體動力學和DNA穩(wěn)定性來防止視網(wǎng)膜功能損傷[26]。綜上所述,DNA甲基化修飾的相關檢測指標有望成為診斷DR的新型標志物,而DNA甲基化修飾引起的基因表達水平的改變可能在不久的將來成為DR治療的靶點。

2.3.3DNA甲基化修飾與色素性視網(wǎng)膜炎色素性視網(wǎng)膜炎(retinitis pigmentosa,RP)是一種遺傳性視網(wǎng)膜退行性疾病,可能與DNA甲基化修飾密切相關。研究發(fā)現(xiàn),在視網(wǎng)膜胚胎祖細胞分化為光感受器的過程中,調(diào)節(jié)序列(例如啟動子、增強子)去甲基化的減少會降低相應基因的活性,導致RP的發(fā)生[27]。因此,使用基因療法對少數(shù)調(diào)節(jié)DNA去甲基化途徑的基因進行上調(diào),可以間接促進靶基因的表達,為治療RP開辟新的途徑。

2.3.4DNA甲基化修飾與年齡相關性黃斑變性年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,ARMD)是一種臨床常見的嚴重威脅視力的眼病,通過對人視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)細胞進行全基因組DNA甲基化修飾分析發(fā)現(xiàn),與對照組相比,早/中期ARMD患者的RPE細胞中SKI、GTF2H4和TNXB的DNA甲基化修飾導致其轉錄本的相對表達量顯著降低,證實DNA甲基化修飾的變化可能會導致RPE的表觀遺傳功能障礙,驅動ARMD的發(fā)生[28]。此外,應用DNA甲基化修飾和轉錄組測序相結合的方式在ARMD患者和對照組RPE層中篩選出了4827個差異甲基化CpG和456個差異表達基因,進一步通過表觀遺傳分析確定SMAD2和NGFR可作為ARMD的潛在標志物,也是ARMD的潛在治療靶點[29]。

2.4DNA甲基化修飾與眼腫瘤

2.4.1DNA甲基化修飾與葡萄膜黑色素瘤DNA甲基化修飾已被證實是癌癥發(fā)生、發(fā)展和轉移的重要表觀遺傳驅動因素,異常的DNA甲基化修飾已成為許多癌癥診斷和預后特征之一。Hou等[30]對甲基化組和轉錄組進行全基因組整合分析,篩選出40個與葡萄膜黑色素瘤發(fā)生和進展相關的甲基化驅動預后基因,其中8個基因已被證實參與了葡萄膜黑色素瘤的進展,17個基因已經(jīng)被報道與其他眼病相關。隨后確定了由10個甲基化驅動的預后基因組成的甲基化驅動標志(methylation-driven signature,MeSig),揭示了甲基化水平與生存率的相關性。Yang等[31]研究發(fā)現(xiàn),DLL3的甲基化水平與其表達水平呈正相關,DLL3的高水平表達顯著延長了葡萄膜黑色素瘤患者的總生存期,證實其可作為一種新的葡萄膜黑色素瘤診斷標志物和治療靶點應用于臨床。

2.4.2DNA甲基化修飾與視網(wǎng)膜母細胞瘤視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma,RB)是兒童最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤,起源于視網(wǎng)膜中成熟的光感受器前體細胞。通過對公共甲基化數(shù)據(jù)存儲庫檢索包含RB、正常視網(wǎng)膜和其他視網(wǎng)膜疾病的數(shù)據(jù)集進行全基因組甲基化分析,發(fā)現(xiàn)兩個CpG位點均位于TFAP2A的下游2k bp處,證實TFAP2A的甲基化狀態(tài)可能是診斷RB的一種有效手段[32]。Mao等[33]從GEO數(shù)據(jù)庫中檢索到59個被診斷為RB樣本的基因表達陣列并將其分為高浸潤亞組和低浸潤亞組,發(fā)現(xiàn)高浸潤亞組中存在全基因組DNA高甲基化模式,表明DNA甲基化修飾的改變可能在RB免疫細胞浸潤中起關鍵作用,該發(fā)現(xiàn)為研究RB的分子機制和臨床免疫治療提供新的途徑。最近一項研究發(fā)現(xiàn),眼房水與RB的腫瘤組織中檢測到相同的RB1啟動子DNA高甲基化[34],提示即使僅通過檢測眼房水中的游離細胞DNA(cell-free DNA)中RB1啟動子的DNA甲基化修飾水平,也能夠反映RB的真實情況,為臨床RB的早期診斷提供了可能。

2.5DNA甲基化修飾與青光眼Burdon等[35]通過全基因組關聯(lián)性研究發(fā)現(xiàn),CDKN2B啟動子的甲基化狀態(tài)可能與正常眼壓性青光眼女性患者相關。Asefa等[36]通過對原發(fā)性開角型青光眼患者進行聯(lián)合SMR分析發(fā)現(xiàn)了27個原發(fā)性開角型青光眼的新DNA甲基化修飾位點,突出了表觀遺傳學在青光眼中的作用。假性剝脫綜合征是繼發(fā)性開角型青光眼的常見病因。賴氨酰氧化酶樣蛋白1(LOXL1)的表達通過DNA甲基化修飾在假性剝脫綜合征中發(fā)生改變,證實表觀遺傳變化的逆轉是假性剝脫綜合征的潛在治療靶點[37]。房水循環(huán)障礙是導致青光眼的重要因素之一,靶向房水循環(huán)障礙是治療青光眼的一種有效途徑。Wan等[38]通過研究發(fā)現(xiàn),生長分化因子7(GDF7)啟動子的去甲基化能夠促進GDF7基因的轉錄并導致GDF7表達增加,GDF7的表達水平增加促使小梁網(wǎng)纖維化,引起房水流出減少,從而使眼壓升高。對青光眼患者的小梁網(wǎng)細胞進行DNA甲基化修飾分析,發(fā)現(xiàn)全基因組甲基化增加同時伴隨著TGFβ1的表達增加,而使用TGFβ1處理正常小梁網(wǎng)細胞會導致Dnmt1表達增加,與青光眼患者小梁網(wǎng)細胞相似,進一步證明了DNA甲基化修飾在青光眼發(fā)展中的作用[39]。因此,DNA甲基化修飾可能為研究青光眼的表觀遺傳機制提供新的見解,并且可能成為一種創(chuàng)新的治療手段。

2.6DNA甲基化修飾與白內(nèi)障先天性白內(nèi)障在視覺系統(tǒng)發(fā)育的敏感期會嚴重影響視覺信息質(zhì)量,臨床上約一半的雙眼先天性白內(nèi)障和幾乎所有單眼先天性白內(nèi)障都因無法明確其發(fā)病機制被診斷為特發(fā)性先天性白內(nèi)障。Liu等[40]通過對先天性白內(nèi)障患者和無白內(nèi)障受試者外周血測序發(fā)現(xiàn)了大量差異化甲基化區(qū)域,證實核心基因的甲基化水平可能會干擾細胞骨架和細胞間連接的功能,引發(fā)白內(nèi)障。在高度近視并發(fā)核性白內(nèi)障的病例中通過Sequenom Mass ARRAY技術發(fā)現(xiàn)抗氧化基因GSTP1和TXNRD2啟動子中的特定CpG區(qū)域高甲基化,導致其表達水平降低,使得氧化應激增加,導致白內(nèi)障的發(fā)生[41]。以上研究結果提示,調(diào)控基因的DNA甲基化修飾水平可能為靶向治療特殊類型的白內(nèi)障提供新思路。

2.7DNA甲基化修飾與近視近視被認為是與遺傳和環(huán)境密切相關的眼病。研究發(fā)現(xiàn),長散布核元件-1(LINE-1)的甲基化水平在近視患者和形覺剝奪小鼠中明顯升高,而多巴胺可以通過降低Dnmt1來下調(diào)LINE-1甲基化水平,證實近視可能與DNA甲基化修飾水平有關[42],而LINE-1可能是治療近視的有效靶點。Seow等[43]對臍帶組織進行全基因組DNA甲基化修飾分析發(fā)現(xiàn)在早發(fā)性近視兒童中有5個CpG位點低甲基化,推斷其甲基化水平影響了相關基因的表達,與近視的發(fā)生密切相關。對18例高度近視兒童與正常受試者的全基因組甲基化水平研究發(fā)現(xiàn)PCDHA10的啟動子區(qū)域存在低甲基化,推測特定CpG島甲基化模式的改變可能與早發(fā)性高度近視有關,該研究結果為兒童確定高度近視的無創(chuàng)生物標志物提供了理論依據(jù)[44]。另有研究對18例4～12歲高度近視患者的血液樣本進行全基因組甲基化分析,鑒定出1541個高甲基化CpG區(qū)[45],證實即使在家族遺傳的情況下,環(huán)境因素和戶外時間可能仍會影響遺傳性近視相關基因的表達水平。對形覺剝奪近視豚鼠模型的鞏膜進行DNA甲基化修飾分析發(fā)現(xiàn),造模4wk后胰島素樣生長因子1(IGF-1)啟動子低甲基化導致IGF-1轉錄水平提高,影響了基因的表達,說明DNA甲基化修飾可能參與了近視的發(fā)展[46],靶向DNA甲基轉移酶可以為治療近視提供新的干預手段。

3 結語

綜上所述,DNA甲基化修飾是一種不涉及DNA序列改變的修飾方式,可通過調(diào)控基因的表達水平在眼病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。隨著高通量測序技術的迅速發(fā)展,人們對DNA甲基化修飾的認識也越發(fā)深入。依據(jù)DNA甲基化修飾的不同甲基化位點及其水平變化分析其在眼病發(fā)生發(fā)展過程中的作用,對深刻闡釋眼病發(fā)生發(fā)展的病理機制具有重要意義,同時,DNA甲基化修飾的相關生物學指標檢測或將優(yōu)于病理學診斷,為眼病的早期發(fā)現(xiàn)和精準治療提供了新的思路。