人眼表微生物群與眼表疾病研究進展

王 丹,楊瑞波

0 引言

近年來,干眼、過敏性結膜炎等非感染性眼表疾病的發病率越來越高,而疾病的確切病因及病理生理機制尚有待闡明。2014年,隨著人類微生物組計劃的實施,對包括皮膚、胃腸道和泌尿生殖道等身體許多部位進行微生物特征分析,并評估其在人類健康和疾病中的作用,眼表微生物群在眼表疾病中作用的探索也逐漸進入研究者們的視野[1]。眼表黏膜暴露于外部環境,有特定的微生物群定植于眼表,與眼表組織、細胞及細胞因子共同構成穩定的眼部微環境[2]。正常情況下,眼表中各種微生物處于相對平衡狀態,組成正常微生物群的細菌種類可通過競爭機制抑制致病菌生長[3],但當眼表屏障的防御功能損傷時會引起微生物失調,使致病菌過度繁殖,加重眼表損害。因此,了解眼表微生物群的組成、疾病中微生物的變化將有助于更好地了解眼表疾病的致病機制。

1 正常眼表核心微生物群

回顧國內外基于傳統細菌培養技術對眼表微生物群的研究[4-8],發現正常眼表分離出來的細菌主要是凝固酶陰性葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌、棒狀桿菌等。隨著人類微生物組學研究的進展,對于眼表是否與人體其他部分一樣存在核心微生物群的疑問被研究者們提出[1]。但是細菌培養的結果并不能包含眼表所有的微生物群,高通量測序技術的應用逐漸解決了該問題(表1[4,7-15])。

表1 正常眼表核心微生物

2011年,Dong等[9]第一次采用16S rDNA高通量測序技術對4位受試者的結膜囊細菌進行測序分析,發現了變形菌門、放線菌門、厚壁菌門3個主要菌門和假單胞菌屬、慢生根瘤菌屬、丙酸桿菌屬、不動桿菌屬、棒狀桿菌屬5個主要菌屬,但由于樣本量太小,未表明其穩定性就直接定義“核心”微生物群還為時尚早。為了更好地確定眼表核心微生物群及眼表微生物的穩定性,Ozkan等[8]對45位健康受試者在3mo內的3個時間點進行結膜采樣,發現每個時間節點的主要菌屬是棒狀桿菌屬、不動桿菌屬、假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、鏈球菌屬,并且由于存在1位或多位受試者受檢的所有時間點均出現的菌屬,分析認為可能存在針對個體的微小核心微生物群。與上述研究一致,2021年,Kang等[12]采用宏基因組測序技術對健康人眼表微生物組分析,發現屬水平主要有鏈球菌屬、葡萄球菌屬、丙酸桿菌屬、棒狀桿菌屬,而個體在物種水平上存在菌株異質性,這進一步驗證了個體微小核心微生物群的存在。

同年Delbeke等[13]對已發表的11篇文獻中的可用原始數據進行分析,將至少在5個已發表隊列研究中存在且相對豐度大于1%的菌屬定義為健康成年人的核心微生物群——棒狀桿菌屬、不動桿菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬、丙酸桿菌屬、鏈球菌屬。

目前對于眼表核心微生物群的研究主要集中在細菌方面,但眼表微生物群并不是只有細菌,還包括真菌、病毒[12]。Wang等[15]使用內源轉錄間隔區(internal transcribed spacer,ITS)測序的方法對健康人眼表的真菌進行分析,發現擔子菌門和子囊菌門2個主要門類及馬拉色菌屬、紅酵母菌屬、Davidiella、曲霉菌屬和鏈格孢屬5個主要屬類,并且這些微生物在80%以上的樣本中發現,與Shivaji等[14]研究發現的馬拉色菌屬和曲霉菌屬在所有檢測到真菌的樣本中均存在的結果一致。真菌微生物的確定將有助于更全面地定義正常眼表核心微生物群,但相關研究還較少,未來應加強對眼表真菌、病毒等的鑒定以更好地了解疾病的發病機制。

2 眼部及全身性疾病與眼表微生物群的變化

2.1干眼與眼表微生物群的變化干眼為多因素引起的慢性眼表疾病,是由淚液的質、量及動力學異常導致的淚膜不穩定或眼表微環境失衡,可伴有眼表炎性反應、組織損傷及神經異常,造成眼部多種不適癥狀和(或)視功能障礙[16],主要分為水液缺乏型、脂質異常型、黏蛋白異常型、淚液動力學異常型及混合型干眼。

在干眼的發病及病理損傷機制研究中,眼表微生物失調近年來備受關注。基于傳統細菌培養方式在干眼中檢測出的細菌主要為凝固酶陰性葡萄球菌[17]。2007年,Graham等[18]通過PCR技術檢測出了相當數量的非典型的紅平紅球菌、產酸克雷伯氏菌、歐文氏菌屬,這些細菌菌群的檢出表明干眼患者眼表微生物群構成的變化。2019年,Li等[19]使用16S rDNA測序技術對35例干眼患者和瞼板腺功能障礙(meibomian gland dysfunction, MGD)是脂質異常型干眼的主要類型。通過傳統細菌培養方式在MGD患者眼表中檢測到的主要細菌與健康人眼表一致,均是凝固酶陰性葡萄球菌,但MGD患者的細菌分離率及檢測出的細菌種類卻顯著高于健康人[21],提示MGD患者存在微生物的失調主要反映在細菌的量及種類的變化。隨后研究者基于更精確的16S rDNA測序技術對MGD患者眼表微生物的變化進行分析,試圖尋找出對疾病的發生發展具有重要意義的微生物群。2019年,Dong等[22]利用16S rDNA測序技術分析發現葡萄球菌屬和鞘氨醇單胞菌屬為MGD中的標志性微生物,且瞼板腺的萎縮程度隨葡萄球菌屬的相對豐度增加而加重,這表明葡萄球菌屬在MGD的發病過程中有著重要作用:(1)瞼板腺分泌過多的膽固醇酯和游離脂肪酸酯,刺激金黃色葡萄球菌生長,導致眼表菌群紊亂;(2)葡萄球菌屬產生的酯酶可顯著改變眼表及瞼板腺周圍游離脂肪酸的分布,使淚膜不穩定,加重眼表不適癥狀[23]。 2020年,Zhao等[24]采用宏基因測序技術對代謝途徑進行分析,發現在MGD樣本中微生物參與碳水化合物和脂質代謝的酶豐度增加,這種改變似乎降低了微生物對環境中能量的要求,使其在低能量的環境中也可以更好地生存。

54例非干眼患者結膜囊拭子進行分析,發現干眼患者的α、β多樣性與非干眼患者存在顯著差異,并且非干眼患者微生物群落聚集性更好且優勢物種更多。與此研究一致,Andersson等[20]對于水液缺乏型干眼的研究表明干眼患者的α多樣性顯著降低,β多樣性與健康人之間存在顯著差異。

上述研究表明,干眼患者存在眼表微生物群的失衡,并且在不同類型干眼中對疾病有影響的微生物群可能存在差異,但具體微生物的改變及具體的作用機制還需要更多的樣本及更加精準的研究方法來確定。

2.2過敏性結膜炎與眼表微生物群的變化過敏性結膜炎(allergic conjunctivitis,AC)是最常見的眼表疾病之一,包括以抗原特異性免疫球蛋白E(IgE)和輔助型T細胞2(Th2)介導的超敏反應為特征的一系列疾病。

越來越多的證據表明,皮膚、腸道和呼吸道的微生物群在過敏性疾病(如特應性皮炎、食物過敏和哮喘)中起著重要作用[25]。近年來對AC中結膜微生物群變化的研究逐漸增多。2015年,Al-Hakami等[26]通過常規細菌培養的方法發現在春季角結膜炎患者眼表可分離出更多的金黃色葡萄球菌,而性別、年齡匹配的健康對照組眼表可分離出更多的表皮葡萄球菌,認為金黃色葡萄球菌定植在春季角結膜炎發生中具有潛在加重作用。2021年,Vishwakarma等[27]發現,雖然春季角結膜炎患者和健康對照組眼表細菌組成上相似,但春季角結膜炎患者的細菌負荷增加且金黃色葡萄球菌的分離率較高。既往認為金黃色葡萄球菌來源的外毒素對于特應性皮炎具有促進作用,其是否在AC的發生發展中也有類似的作用還需要未來更多的研究探索。通過16S rDNA測序發現,AC患者存在結膜囊微生物失調,其中卡他莫拉氏菌在AC中富集,并且對于不同類型的AC患者,其眼表微生物群組成存在顯著差異[28],提示與研究不同類型干眼的發病機制一樣,對AC的不同類型也要進行細分,或許能從微生物群組成的角度進一步挖掘其發病機制。多項關于AC的研究采用了ITS測序技術對真菌的組成變化進行分析,幾乎均發現馬拉色菌的相對豐度顯著增高[27-28]。這種真菌還可以產生多種免疫球蛋白引起特異性IgE抗體的產生,并可以誘導促炎因子釋放及T細胞反應,從而促進特應性皮炎的發生[29]。值得注意的是,季節和常年AC主要是由IgE介導的反應,因此這種真菌在其中的作用機制值得進一步研究。

2.3全身性疾病與眼表微生物群的變化近年研究發現,眼表微生物群的變化不僅與眼表疾病有關,全身性疾病也可通過一定的機制途徑影響眼表微生態,進而導致眼表微生物失調。

Sj?gren綜合征(Sj?gren’s syndrome,SS)是一種自身免疫性疾病,腸道微生物失調在該病中的作用已被證實。2020年,Moon等[30]發現原發性Sj?gren綜合征(primary Sj?gren’s syndrome,pSS)患者腸道微生物中厚壁菌門/擬桿菌門比值下降,這一比例的偏移被認為是微生態失調,厚壁菌門/擬桿菌門比值降低與腸道的炎癥狀態有關,而該比值增加與肥胖癥有關[31]。2022年,Yang等[32]比較了30例pSS患者和20例健康人的腸道微生物群,發現pSS患者腸道中促炎微生物豐度升高,而抗炎微生物豐度降低。SS除了腸道微生物群的失調,在局部如口腔[33]、陰道[34]微生物群也有變化,因該病在眼部也有相應干眼表現,研究者對眼表微生物群的失調也進行了研究,發現SS患者眼表微生物的多樣性下降,門屬層面上也存在細菌的顯著性差異,其中厚壁菌門/擬桿菌門的比值升高,這與在腸道中的比值相反,而兩個方向的比值變化均是微生物失調的標志,因此推測被擾亂的微生物組成可能會激活不同的免疫調節和炎癥途徑,從而導致或加重淚膜不穩定和眼部損傷[31,35]。

3 微生物失調引起疾病的可能機制

眼表微生物防御屏障主要由生理防御、生化防御、免疫防御三部分組成,能夠將眼內組織與一些有害微生物、炎癥因子等分隔開[36]。生理防御主要包括睫毛機械性遮擋和瞬目動作,防止異物進入眼內并使淚液中的微生物通過淚道排入鼻腔,此外還包括眼表上皮細胞的屏障作用[36]。生化防御主要是淚液中的抗菌物質[37]——溶菌酶(水解革蘭氏陽性菌的細胞壁)、乳鐵蛋白(結合Fe2+,剝奪細菌營養物質)、淚液脂聯素(保護眼睛不受細菌半胱氨酸蛋白酶影響)等。免疫防御主要包括免疫細胞[38],如中性粒細胞、淋巴細胞及分泌型IgA、補體C3等,可以防御微生物侵入眼表。但在感染、配戴隱形眼鏡等一系列風險因素的作用下,微生物防御系統被破壞,這可能進一步導致微生物在眼表的增殖,造成眼表微生物群構成改變,破壞原有正常微生物群的保護作用[39]。

基于16S rDNA技術,研究者對細菌性角膜炎患者的結膜拭子和角膜刮片進行分析,發現眼表微生物群發生顯著變化,α多樣性與健康人存在顯著差異,且一些致病菌屬如鏈球菌屬、葡萄球菌屬、棒狀桿菌屬、甲基桿菌屬相對豐度顯著升高[40]。配戴隱形眼鏡已被認為是干眼、巨乳頭型結膜炎等眼部疾病的危險因素。Shin等[41]通過對隱形眼鏡配戴者的眼部微生物群檢測,發現甲基桿菌屬、乳酸桿菌屬、不動桿菌屬、假單胞菌屬豐度較高,而這些菌屬往往是感染性角結膜炎的致病菌。

雖然眼表微生物失調引起疾病的具體機制目前尚不明了,但腸道微生物失調引起炎性腸病[42]等疾病的機制已有可喜發現。在腸道微生物失調時,導致某些細菌相對豐度的增加或減少,隨之這些細菌的代謝產物也會發生相應變化。一些重要的代謝產物在維持免疫系統的平衡方面具有重要作用,如短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFA)[43],其作為一類菌群的代謝產物,可與Ffar2編碼的GPR43受體結合,通過組蛋白去乙酰化酶抑制劑的作用,影響結腸Treg細胞(調節性T細胞)。Treg細胞是抑制腸道炎癥的關鍵細胞,其可抑制異常激活的免疫反應并維持腸道免疫耐受,但在炎性腸病患者中,Treg細胞水平明顯下降[44]。同樣的細菌代謝物也在肥胖癥的發生發展中具有重要作用[40]。此外,腸道微生物可以影響B細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞而參與疾病進程[38]。

雖然眼表疾病中發生失調的微生物類型與上述研究不同,但對于微生物失調如何導致疾病的機制或許在兩者中存在類似之處。因此未來對于眼表微生物失調的機制研究或許可以借鑒對腸道微生物的研究思路。

4 結語

健康眼表的微生物群有助于預防感染,具有刺激和調節先天和適應性免疫的能力,并為免疫系統提供了一種指示,使免疫屏障不斷得到加強,為維持自身新陳代謝和阻止病原體的入侵提供了必要環境。雖然目前已有相當多的研究對正常及各種眼表疾病中眼表微生物群的變化進行描述,但仍有很多問題需要繼續探索。目前多數研究仍主要集中在細菌菌群的變化,對于眼表真菌菌群的研究只在AC中有部分體現;同時,對微生物失調與疾病發生發展之間關系的機制研究還遠遠不夠。為了揭示這些科學問題,今后仍需進行包括更大樣本受試者、相對標準化的實驗技術與評價體系的多中心研究,從而推動該領域研究以獲得更有價值的發現。