母鼠孕前肥胖和孕期過度增重對子鼠鐵相關指標的影響研究

谷雨 周玉博 李宏田 劉建蒙

著名的“胎源假說”提出,兒童及成人期多種疾病與生命早期不良暴露有關[1]。近年來,育齡女性肥胖率和孕期過度增重率逐年上升至較高水平[2-3],孕前肥胖和孕期過度增重不僅增加母體妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓和產后出血等風險[4-5],而且對子代健康產生不良影響[6]。研究表明,孕產婦肥胖可影響臍帶血中鐵相關指標水平,如降低臍帶血血清鐵、鐵蛋白等的水平,肥胖與鐵相關指標的關聯可能通過炎癥途徑介導[7-9]。然而,上述研究僅檢測了臍帶血中相關指標水平,未繼續探究孕前肥胖和孕期過度增重對子代出生后炎性指標和鐵相關指標的影響,且相關結果是否受到混雜因素影響尚未可知。本動物實驗研究擬采用高脂飲食誘導母鼠孕前肥胖和孕期過度增重,探究母鼠孕前肥胖和孕期過度增重對子鼠鐵相關指標的影響以及炎癥反應的可能機制,為母體肥胖對子代健康影響提供依據。

對象與方法

一、實驗動物與飼料

6周齡健康的SPF級Wistar雌性大鼠18只,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[實驗動物生產許可證:SCXK(京)2016-0006],飼養于北京大學醫學部實驗動物科學部[實驗動物使用許可證號:SYXK(京)2016-0041],飼養環境安靜,溫度(22±2)℃,相對濕度50%～60%。交配用的SPF級Wistar雄性大鼠訂購來源和飼養環境同上,共18只,13周齡,體重(380±20)g。

實驗飼料分為標準飼料和高脂飼料。標準飼料為大小鼠生長繁殖飼料,購自北京科澳協力飼料有限公司,平均每克飼料供能3.44 kcal,63%能量由碳水化合物提供;高脂飼料為Research Diets D12492,即60%脂供能高脂飼料,購自北京凱國科技有限公司,平均每克飼料供能5.24 kcal,60%能量由脂質提供。所有實驗動物均自由采食飼料和飲水。

二、方法

1.實驗設計:18只SPF級Wistar雌性大鼠適應性飼喂1周后,采用隨機數字表法以1∶1∶1的比例隨機分為對照組(Con,n=6)、孕前肥胖組(Pre-obese,n=6)和孕期過度增重組(GWG,n=6),對照組全程飼喂標準飼料,孕前肥胖組于孕前6周起飼喂高脂飼料,孕期過度增重組僅于孕前10 d起飼喂高脂飼料、其余時期飼喂標準飼料(考慮大鼠孕期較短,故將孕期過度增重組的高脂飲食干預時間適當提前至受孕前10 d,以確保其孕前體重與對照組相當而孕期增重較之明顯增加)。為控制哺乳期子鼠數量及性別比,在子鼠出生后第5天,將每窩別子鼠數量調整為6只,雌雄各半(性別根據子鼠肛門與生殖突的間距判斷)。哺乳3周后母鼠乙醚麻醉處死,從每窩別子鼠中隨機抽取2～3只子鼠納入離乳后研究,每組12只(雌雄各半),共計36只。離乳后,所有子鼠均自由采食標準飼料和飲水,離乳21 d后子鼠乙醚麻醉處死(圖1)。本實驗方案通過了北京大學生物醫學倫理委員會實驗動物福利倫理分委會的審查。

圖1 實驗設計(■高脂飼料;□標準飼料)Figure 1 Experiment Design (■high-fat diet, □standard chow diet)

2.體重測量與血液采集:實驗期間記錄母鼠體重,母鼠孕前體重定義為與雄鼠第一次交配前的體重,孕期增重定義為孕期第19天與孕期第1天體重之差。子鼠出生后每周測量體重,離乳后第7天、14天和21天對子鼠進行眼眶內眥靜脈血采集,每次采血量約1.0～1.2 mL,全血標本室溫放置30 min后,1 500 g離心20 min,取上層血清,置于-80℃保存。

3.主要儀器與試劑:實驗儀器主要包括電子天平(上海越平科學儀器有限公司)、高速離心機(Eppendorf Centrifuge 5424R)、酶標儀(Rayto RT-6100,450nm)和全自動血細胞分析儀(Nihon MEK-6400);全自動血細胞分析儀配套試劑主要包括稀釋液MEK-640、溶血劑MEK-680、清洗液MEK-520和強力清洗液MEK-620;酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒包括大鼠白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、鐵調素(hepcidin)和鐵蛋白(ferritin)試劑盒,均購自北京冬歌博業有限公司。

4.實驗室檢測:采用ELISA試劑盒檢測子鼠離乳后第7天、14天和21天血清中IL-6、鐵調素和鐵蛋白的水平,所有樣本均重復測量。采用全自動血細胞分析儀檢測子鼠離乳后第7天、14天和21天全血中血紅蛋白(hemoglobin,Hgb)、平均血紅蛋白量(mean corpuscular hemoglobin,Mch)和平均紅細胞體積(mean corpuscular volume,Mcv)。

5.統計學處理:連續型變量以均值±標準差表示,采用單因素方差分析/Kruskal-Wallis H 檢驗探究大鼠體重與鐵相關指標的組間差異,事后兩兩比較采用Bonferroni或LSD法;進一步采用最小二乘均值分析,探究在調整炎性指標后,子鼠離乳后鐵相關指標的組間差異情況。數據分析采用R 4.0.0統計分析軟件完成,檢驗水平為雙側α=0.05。

結 果

一、母鼠體重

孕前肥胖組母鼠孕前體重顯著高于對照組[(327.7±27.0) g vs. (279.3±14.2)g,P<0.01](表1),提示高脂飲食誘導母鼠孕前肥胖效果良好。孕期過度增重組與對照組母鼠孕前體重差異無統計學意義,孕期過度增重組母鼠孕中后期體重增速快于對照組母鼠(圖2),其孕期增重均值高于對照組的24.4%[(108.2±17.9 )g vs. (87.0±12.0) g]。

表1 母鼠孕前體重和孕期增重(Mean±SD,g)Table 1 Maternal prepregnancy weight and gestational weight gain (Mean±SD, g)

圖2 母鼠孕前、孕期與哺乳期體重(Mean,g)Figure 2 Maternal body weight during prepregnancy, pregnancy and lactation (Mean, g)

二、子鼠體重

孕前肥胖組和孕期過度增重組子鼠出生體重低于對照組子鼠,但組間差異無統計學意義;孕前肥胖組和孕期過度增重組子鼠哺乳期體重增長顯著快于對照組(P<0.001),三組子鼠離乳后體重變化未見顯著差異(表2)。

表2 子鼠出生后42 d內體重(Mean±SD,g)Table 2 Body weight within 42 days after birth in offspring (Mean±SD, g)

三、子鼠離乳后炎性指標及鐵相關指標

對于子鼠離乳后炎性指標,孕前肥胖組和孕期過度增重組子鼠離乳后第7天、14天和21天血清IL-6和鐵調素水平較對照組均升高,且孕前肥胖組子鼠IL-6水平高于孕期過度增重組子鼠(圖3和圖4)。

abcSignificantly different by one-way ANOVA followed by Bonferroni or LSD post-hoc test (P<0.05).圖3 雄性子鼠離乳后21 d內鐵相關指標水平(Mean±SD,n=6/組)Figure 3 Iron-related indicators of male offspring within 21 days after weaning (Mean±SD, n=6/group)

abSignificantly different by one-way ANOVA followed by Bonferroni or LSD post-hoc test (P<0.05)圖4 雌性子鼠離乳后21 d內鐵相關指標水平(Mean±SD,n=6/組)Figure 4 Iron-related indicators of female offspring within 21 days after weaning (Mean±SD, n=6/group)

與對照組子鼠相比,孕前肥胖組和孕期過度增重組子鼠離乳后第7天、14天和21天血清鐵蛋白水平均顯著升高(P<0.05,圖3和圖4)。孕前肥胖組和孕期過度增重組雌性子鼠離乳后第7天全血鐵相關指標有下降趨勢,表現為孕前肥胖組雌性子鼠Mch水平偏低于對照組[(21.2±0.7) pg vs. (22.5±0.7)pg,P<0.05],孕期過度增重組雌性子鼠Hgb[(96.3±3.9 )g/L vs. (103.3±2.7)g/L]和Mch水平[(21.2±1.1) pg vs. (22.5±0.7)pg]偏低于對照組(P<0.05),兩組雌性子鼠的Mcv水平略低于對照組,但差異不具有統計學意義(圖4)。孕前肥胖組和孕期過度增重組雄性子鼠離乳后第7天、14天和21天全血Mch和Mcv水平略低于對照組,但差異均不具有統計學意義(圖3)。

調整炎性指標IL-6和鐵調素后,孕前肥胖組和孕期過度增重組雌性子鼠離乳后第7天鐵蛋白和Hgb水平較對照組差異不再具有顯著性,其他結果較調整前未見顯著改變(表3)。

表3 雌性子鼠離乳后第7天鐵相關指標最小二乘均值分析Table 3 Least square mean analysis of iron-related indicators in female offspring on the 7th day after weaning

討 論

動物模型已被廣泛運用于飲食誘導肥胖的實驗研究中,研究者常運用30%～60%脂供能高脂飼料誘導肥胖[10]。本研究采用60%脂供能高脂飼料誘導Wistar雌性大鼠孕前肥胖和孕期過度增重,孕前肥胖組孕前體重顯著高于對照組,高脂飲食誘導母鼠孕前肥胖的效果良好;孕期過度增重組孕前體重與對照組相當而孕期增重較之明顯增加,孕期增重均值超過對照組的24.4%。

本研究發現,孕前肥胖組和孕期過度增重組子鼠離乳后第7天、14天和21天IL-6水平高于對照組,提示肥胖子代血清炎癥因子水平升高。謝潤祥[11]、陳雪[12]等的研究提示,生命早期母體高脂飲食可誘導子代小鼠腸道低度炎癥,血清炎癥因子TNF-α和IL-12的水平升高,與本研究的結論一致。肥胖是一種慢性炎癥狀態,表現為脂肪細胞被巨噬細胞浸潤,后者釋放TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎因子,而妊娠也被認為是一種低度慢性炎癥狀態,表現為母體白細胞活化、急性期反應物和細胞因子水平升高[13]。研究表明,孕期肥胖會增加妊娠的基礎炎癥狀態,可能造成子代生命早期炎癥環境[14]。

本研究發現,孕前肥胖與孕前過度增重組子鼠離乳后第7天、14天和21天血清鐵調素水平升高。鐵調素是近年來發現的一種主要由肝細胞分泌、含有25個氨基酸的抗菌多肽,可抑制鐵釋放到血液循環,在鐵平衡中發揮負性調節作用[15]。有研究報道,JAK/STAT是人體炎癥狀態刺激鐵調素表達升高的重要信號通路,IL-6通過JAK/STAT信號通路介導,升高人體鐵調素水平[16]。鐵調素升高不僅阻礙了十二指腸對膳食鐵的吸收,而且阻礙巨噬細胞對鐵的釋放,使得體內循環鐵的水平降低,進而降低了鐵相關指標水平[17]。

然而,本研究中孕前肥胖組和孕期過度增重組子鼠離乳后血清鐵蛋白水平不降反升。血清鐵蛋白被視為評估人體內鐵儲存的常用指標,高血清鐵蛋白水平代表人體鐵儲存水平高[18],但血清鐵蛋白也是一種急性期反應物,受炎癥等因素的影響,其高水平也在一定程度上反映慢性炎癥和氧化應激的水平[19]。本研究發現,在調整炎性指標IL-6和鐵調素后,子鼠血清鐵蛋白水平組間差異未有統計學差異,提示孕前肥胖和孕期過度增重組子鼠血清鐵蛋白水平的升高受炎癥因子和鐵調素影響,因此,在以血清鐵蛋白評價機體鐵儲存時要考慮炎性指標。此外,Graf等[20]研究同樣發現,母鼠高脂飲食可誘導子鼠急性神經炎癥反應,子鼠出生時全腦組織IL-1β和TNF-α水平升高、鐵調素和鐵蛋白的水平也升高,與本研究結果相似,但Graf等[20]研究并未進一步評估子鼠出生后一段時期鐵相關指標水平的變化。人群研究也顯示,罹患Ⅱ型糖尿病等代謝綜合征的肥胖人群鐵蛋白水平升高[19]。

本研究還發現,孕前肥胖組雌性子鼠離乳后第7天Mch水平低于對照組,孕期過度增重組雌性子鼠離乳后第7天Hgb水平和Mch水平低于對照組。目前少數幾項關于孕期肥胖與子代貧血的研究均為人群隊列研究且結果不盡一致,尹韶華等[21-22]的研究表明,肥胖/孕期過度增重孕婦的子代6/12月齡Hgb水平下降、貧血風險增加;而Cao等[23]的研究顯示,孕前BMI和孕期增重不影響子代Hgb水平;也有研究發現[8, 24],肥胖孕婦分娩新生兒臍帶血Hgb水平升高、而組織鐵貯存下降。上述人群隊列研究的結果差異很可能是因為人群不同及混雜因素的影響,本動物實驗結果為孕期肥胖可能增加子代貧血風險提供了因果關聯證據。本研究還發現,調整炎癥相關指標后,母鼠肥胖對子代鐵蛋白和Hgb的影響不再顯著,提示炎癥反應可能是孕期肥胖增加子代貧血風險的機制之一。

本研究提示,母鼠孕期肥胖對子鼠鐵相關指標的影響具有性別差異,鐵相關指標水平降低在雌性子鼠中尤為明顯。既往研究表明,雌性子代可能更易受飲食因素的影響而出現肥胖[25],且母鼠哺乳期肥胖對雌性子鼠性腺肥胖產生不良影響[26]。胎盤對孕期營養的反應、性激素與代謝激素的作用、表觀基因組均可能對性別特異性編程產生影響[27]。

綜上所述,母鼠孕前肥胖和孕期過度增重影響雌性子鼠離乳后鐵相關指標,炎癥反應是可能機制之一。本動物實驗也存在一定局限性,本研究中孕期過度增重組孕期增重均值超過對照組的24.4%,但組間差異無統計學意義,可能原因為樣本量不充足(n=6/組)導致檢驗效能下降,進而可能低估母鼠孕期過度增重對子代鐵相關指標的影響效應;此外,本研究也未能評估母鼠飼料攝入量與鐵元素攝入量對研究結果的影響。