血清及胎盤中Siglec-6、Glycodelin-A水平與子癇前期發病和妊娠結局的相關性

王晶 王培萍 張婕 尚麗新

作者單位：100700 北京,解放軍總醫院第七醫學中心婦產醫學部(王晶,張婕,尚麗新);解放軍63600部隊醫院婦兒科(王培萍)

子癇前期是一種妊娠特異性綜合征,國內發病率為5%～12%,主要表現為高血壓、蛋白尿及水腫。按疾病的嚴重程度分為輕度子癇前期及重度子癇前期。按發病時間分為早發型子癇前期和晚發型子癇前期[1-2]。子癇前期是全世界孕產婦和圍產兒死亡的主要原因之一。由于其發病背景復雜,發病機制至今尚不明確[3],亦缺乏有效的預測及治療方法。研究認為,母胎界面免疫耐受失衡與子癇前期的發病有關[4]。唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素6(sialic acid blinding immunoglobulin-like lectin 6,Siglec-6)豐富表達于母胎界面,在調節免疫耐受、滋養細胞分化及浸潤等功能中具有重要的作用[5-6]。子宮糖基化蛋白(glycodelin-A)主要表達于蛻膜細胞,是Siglec-6的配體,通過免疫抑制參與胚泡的植入及妊娠維持等[7-8]。目前,Siglec-6及glycodelin-A與子癇前期的發病及妊娠結局的相關性研究報道較少。因此,本研究檢測了子癇前期患者血清及胎盤中Siglec-6、Glycodelin-A水平,并分析其與妊娠結局的相關性,期望為該病的預測及臨床診治提供新的思路和方法。

資料與方法

1.一般資料:選取2018年1月到2020年6月于解放軍總醫院第七醫學中心產科收治的子癇前期患者55例作為子癇前期組,其中早發型子癇前期組21例,晚發型子癇前期34例;輕度子癇前期31例,重度子癇前期24例。另外選取同期產科分娩的正常孕婦55例作為對照組。(1)納入及分組標準。子癇前期診斷依據《妊娠期高血壓疾病診治指南(2020)》[9],輕度子癇前期是指妊娠20周后出現血壓≥140/90 mmHg,伴有24 h尿蛋白≥0.3 g,或尿蛋白/肌酐≥0.3,或隨機尿蛋白(+);重度子癇前期是指血壓≥160/110 mmHg,伴有24 h尿蛋白>2 g,或孕婦其他器官功能受累或出現胎盤胎兒并發癥。早發型子癇前期是指妊娠<34周發病者;晚發型子癇前期是指妊娠≥34周發病者。(2)排除標準。伴有其他妊娠合并癥或并發癥者。兩組間年齡、孕次、孕周、體重指數比較,差異均無統計學意義,均為單胎、初產婦,見表1。所有研究對象對本研究知曉,并簽署知情同意書。

表1 兩組間一般資料比較

二、方法

1.標本采集及處理:所有研究對象(子癇前期組于治療前采血)均于清晨空腹抽取靜脈血5 mL,以3 000 r/min的速度離心15 min,吸取上清液放入凍存管中,-70℃儲存備用。另外,所有研究對象在胎盤娩出后,立即在母體面的中央區域取大小約 1.5 cm3的組織,放入4%的甲醛溶液中固定 24 h后制作蠟塊,連續切片,厚度為5 um,制成貼片備用。

2.測定方法:采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法測定血清中Siglec-6、Glycodelin-A水平,試劑盒分別購自北京諾為生物技術有限公司和武漢華美生物科技有限公司,檢測靈敏度分別為0.05 ng/mL、0.1 ng/mL。胎盤Siglec-6、Glycodelin-A檢測采用免疫組織化學SABC 法。特異性兔抗人Siglec-6抗體及特異性兔抗人Glycodelin-A抗體均由上海圻明生物科技有限公司提供,工作濃度為 1:100。

3.免疫組化的結果判定:由兩名專業人員盲法判讀。以細胞漿或細胞膜中出現棕黃色或淺黃色染色為陽性,以與背景顏色相同或無著色為陰性。隨機選取5個高倍視野對每例切片進行分析,將陽性細胞數的百分比與染色強度結合起來進行綜合計分。陽性細胞數百分比得分分別為,0分為<5%,1分為5 %～25 %,2分為26 %～50 %,3分為>50 %;染色強度得分分為,0分為無色或與背景色一致,1分為淡黃色,2分為棕黃色,3分為棕褐色;將兩項得分相乘后為最終結果,即(-)為0～1分,(+)為 2～3分,(++)為4～5分,(+++)為≥6分。

4.妊娠結局隨訪:隨訪所有研究對象的妊娠結局,時間截點為妊娠終止。包括母體不良妊娠結局,包括胎盤早剝、胎兒生長受限、產后出血、胎兒窘迫;胎兒或新生兒不良妊娠結局,包括低出生體重兒、新生兒窒息、新生兒死亡。

結果

1.兩組孕婦血清中Siglec-6、Glycodelin-A水平比較:子癇前期組血清中Siglec-6水平明顯高于對照組,Glycodelin-A水平明顯低于對照組,組間差異均有統計學意義。見表2。

表2 兩組孕婦血清中Siglec-6、Glycodelin-A水平比較

2.輕度與重度子癇前期患者血清中Siglec-6、Glycodelin-A水平比較:重度子癇前期患者血清中Siglec-6水平顯著高于輕度子癇前期組,而Glycodelin-A水平顯著低于輕度子癇前期組,組間差異均有統計學意義。見表3。

表3 輕度與重度子癇前期患者血清中Siglec-6、Glycodelin-A水平比較

3.早發型與晚發型子癇前期患者血清中Siglec-6、Glycodelin-A水平比較:早發型子癇前期組血清中Siglec-6水平明顯高于晚發型子癇前期組,Glycodelin-A水平明顯低于晚發型子癇前期組,組間差異均有統計學意義。見表4。

表4 早發型與晚發型子癇前期患者血清中Siglec-6、Glycodelin-A水平比較

4.各組孕婦胎盤中Siglec-6、Glycodelin-A水平比較:胎盤中Siglec-6主要表達于滋養細胞中,部分表達于蛻膜細胞;Glycodelin-A主要表達于蛻膜細胞,少部分表達于滋養細胞。兩者均表達于細胞漿與細胞膜。見圖1。

A:滋養細胞中Siglec-6表達陽性;B:蛻膜細胞中Siglec-6表達陽性;C:蛻膜細胞中Glycodelin-A表達陽性;D:滋養細胞中Glycodelin-A表達陽性圖1 各組孕婦胎盤中Siglec-6、Glycodelin-A的表達(免疫組織化學SABC 法,×100)

子癇前期組胎盤組織中Siglec-6表達強度明顯高于正常對照組(P<0.01),且重度子癇前期明顯高于輕度子癇前期組(P<0.05),早發型子癇前期組明顯高于晚發型子癇前期組(P<0.05)。子癇前期組胎盤組織中Glycodelin-A表達強度明顯低于正常對照組(P<0.05),且重度子癇前期明顯低于輕度子癇前期組(P<0.05),早發型子癇前期組明顯低于晚發型子癇前期組(P<0.05)。見表5。

表5 各組間胎盤組織中Siglec-6、Glycodelin-A表達強度的比較

5.相關性研究:子癇前期組血清及胎盤中Siglec-6與Glycodelin-A水平均呈負相關(r=-0.503,P<0.05;r=-0.512,P<0.05)。采用Spearman相關分析(根據妊娠結局給予賦值,不良妊娠結局=1,妊娠結局良好=0),結果顯示子癇前期組血清中Siglec-6水平與不良妊娠結局呈正相關(r=0.496,P<0.05),而Glycodelin-A水平與不良妊娠結局呈負相關(r=-0.487,P<0.05)。

討論

Siglec-6是唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素家族的成員之一,又稱CD327。Siglec-6特異性的表達于人類胎盤,妊娠早期主要高表達于細胞滋養細胞和合體滋養細胞中,隨著妊娠周數的增加,其表達量逐漸下降[6]。Siglec-6通過與其配體瘦蛋白和Glycodelin-A結合,以自分泌或旁分泌的方式發揮功能。研究發現,Siglec-6在母胎界面免疫耐受和妊娠的維持方面有重要的作用,并參與調控滋養細胞的侵襲、凋亡過程,可能與流產、子癇前期等妊娠并發癥有關[10]。

Awoyemi等[6]研究發現,Siglec-6可表達于胎盤細胞裂解物及合體滋養細胞外囊泡中,且子癇前期組Siglec-6的表達水平明顯高于正常妊娠組。本研究結果顯示,Siglec-6主要表達胎盤滋養細胞,部分表達于蛻膜細胞,且子癇前期組明顯高于正常對照組,重度子癇前期組明顯高于輕度子癇前期組,早發型子癇前期組明顯高于晚發型子癇前期組(P均<0.05),提示胎盤中Siglec-6水平的升高可能與子癇前期的發生及病情發展有關。有研究報道[11],Siglec-6可抑制人臍靜脈內皮細胞的增殖及遷移,促進其凋亡,同時促進炎性因子TNF-α、IL-6的釋放,抑制VEGF的分泌,導致人臍靜脈內皮細胞的損傷,誘發子癇前期。另外,Siglec-6可能通過抑制PI3K-AKT通路,發揮抑制滋養細胞侵蝕、浸潤能力,導致胎盤淺浸潤,從而導致子癇前期的發生。本研究還發現,子癇前期患者及正常妊娠孕婦血清中均有Siglec-6的低水平表達,但子癇前期組明顯高于正常妊娠組,且隨病情加重,表達水平逐漸升高,另外早發型子癇前期組高于晚發型子癇前期組,這與Tarca等[12]的研究結果相一致。值得注意的是,有學者采用Western blotting方法檢測了子癇前期患者血清中Siglec-6的表達情況,結果并未檢測到其表達[9],推測原因可能為選擇的Siglec-6抗體不同,進而識別的蛋白亞型不同所致。本研究還發現,子癇前期組血清中Siglec-6水平與不良妊娠結局呈正相關,提示血清中Siglec-6水平可作為評估子癇前期病情輕重及不良妊娠結局的臨床參考指標。

Glycodelin-A是由一種由子宮內膜合成的糖蛋白,最早在羊水中發現,分子量約為28KD,其蛋白質部分由180個氨基酸組成,具有4個糖鏈[13]。Glycodelin-A的合成和分泌受孕激素、人絨毛膜促性腺激素、松弛素等調節,具有免疫抑制、胚泡植入和妊娠維持、調節滋養細胞浸潤、介導細胞黏附、參與胎盤血管形成等功能[14],可能與子癇前期的發生有一定的關系。

本研究結果表明,Glycodelin-A主要表達于胎盤蛻膜細胞,部分表達于滋養細胞,子癇前期組表達量明顯低于正常妊娠組,且重度子癇前期組低于輕度子癇前期組,早發型子癇前期組低于晚發型子癇前期組(P均<0.05),提示Glycodelin-A參與了子癇前期的發病,并與病情嚴重程度有關。其可能機制如下:(1)Glycodelin-A可降低母胎界面的Th1/Th2值,從而抑制免疫排斥反應,保障囊胚的發育,促進滋養細胞侵襲及子宮螺旋動脈的重鑄,而Glycodelin-A的低表達導致局部炎癥反應加重,滋養細胞侵襲功能受抑制,進而造成胎盤淺著床,引發子癇前期[15]。(2)Glycodelin-A能促進血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受體的表達,誘導胎盤血管的生成,Glycodelin-A低表達導致VEGF表達降低,胎盤血管生成障礙,血管內皮細胞受損,通透性增加,血管痙攣,出現高血壓及蛋白尿[16]。本研究結果還發現,子癇前期患者血清中Glycodelin-A水平明顯低于正常妊娠組,且隨病情加重,血清中水平逐漸降低,早發型子癇前期低于晚發型子癇前期組(P均<0.05);另外,血清中Glycodelin-A水平與不良妊娠結局呈負相關(P<0.05),提示血清中Glycodelin-A水平可以反映子癇前期病情的輕重,可能作為一個預測及監測病情變化、評估妊娠結局的指標應用于臨床。

本研究顯示,子癇前期組血清及胎盤中Siglec-6與Glycodelin-A水平均呈負相關,提示兩者在子癇前期的發病中起著拮抗作用。Lam等[17]研究發現Siglec-6與其配體Glycodelin-A結合,通過沉默ERK/c-Jun通路,抑制滋養細胞的侵蝕能力,導致胎盤淺浸潤,從而引發子癇前期,其具體機制仍待深入探討。

總之,Siglec-6、Glycodelin-A與子癇前期的發生、發展密切相關,兩因子能否成為該病及不良妊娠結局的預測指標、人為地干預兩因子的表達能否成為干預治療該病的方法,尚需進一步研究。