m6a甲基轉移酶METTL3調控KAI1/CD82表達介導垂體神經內分泌腫瘤細胞生物學行為的機制研究

鄭鍇　羅秀玲　張瑋豪　劉宇利　李玉明　廖尚高

摘要：目的 研究m6a甲基轉移酶METTL3調控KAI1/CD82表達介導垂體神經內分泌腫瘤細胞增殖、遷移與侵襲的機制。方法 通過實時熒光聚合酶鏈反應（qPCR）和蛋白免疫印跡測定大鼠垂體細胞、大鼠垂體神經內分泌腫瘤細胞系GH3和MMQ中的METTL3與KAI1/CD82表達水平。體外培養GH3細胞，將其隨機分為對照組、METTL3過表達質粒組、METTL3空質粒組、METTL3 siRNA組、METTL3 siRNA陰性對照組，經分組轉染后，通過qPCR和蛋白免疫印跡檢測各組細胞METTL3與KAI1/CD82表達；通過CCK-8實驗檢測各組細胞活力；通過細胞劃痕、Transwell侵襲實驗檢測各組細胞遷移侵襲情況；通過甲基化RNA免疫共沉淀（MeRIP）實驗檢測各組細胞KAI1/CD82 m6A甲基化修飾情況。結果 相比大鼠垂體細胞，大鼠垂體神經內分泌腫瘤細胞系GH3及MMQ中的METTL3蛋白及mRNA表達水平明顯升高，KAI1/CD82蛋白及mRNA表達水平明顯降低（P＜0.05）。與對照組相比，METTL3空質粒組、METTL3 siRNA陰性對照組細胞各指標差異無統計學意義；與對照組、METTL3空質粒組相比，METTL3過表達質粒組細胞活力、遷移距離、侵襲細胞數、METTL3蛋白及mRNA表達水平、KAI1/CD82 m6A甲基化水平升高（P＜0.05），KAI1/CD82蛋白及mRNA表達水平降低（P＜0.05）；與對照組、METTL3 siRNA陰性對照組相比，METTL3 siRNA組細胞活力、遷移距離、侵襲細胞數、METTL3蛋白及mRNA表達水平、KAI1/CD82 m6A甲基化水平降低（P＜0.05），KAI1/CD82蛋白及mRNA表達水平升高（P＜0.05）。結論 下調METTL3表達可降低KAI1/CD82 m6A甲基化水平，促進KAI1/CD82 mRNA轉錄表達，抑制垂體神經內分泌腫瘤細胞增殖、侵襲及遷移。

關鍵詞：垂體腫瘤；神經內分泌瘤；甲基轉移酶類；Kangai-1蛋白質；甲基化；m6a甲基轉移酶；甲基轉移酶樣3

中圖分類號：R739.4 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20221753

Mechanism of m6a methyltransferase METTL3 mediating the biological behavior of pituitary neuroendocrine tumor cells by regulating the expression of KAI1/CD82

ZHENG Kai LUO Xiuling ZHANG Weihao LIU Yuli LI Yuming LIAO Shanggao

1 Department of Neurosurgery， 2 Department of Head and Neck Oncology， Affiliated Hospital of Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China; 3 School of Pharmacy， Guizhou Medical University

Abstract： Objective To study the mechanism of m6a methyltransferase METL3 mediated proliferation， migration and invasion of pituitary neuroendocrine tumor cells by regulating the expression of KAI1/CD82. Methods The expression levels of METTL3 and KAI1/CD82 in rat pituitary cells， rat pituitary tumor cell lines GH3， and MMQ were determined by qPCR and Western blot assay. GH3 cells were cultured in vitro and randomly divided into the control group， the METL3 overexpression plasmid group， the METL3 empty plasmid group， the METL3 siRNA group and the METL3 siRNA negative control group. After grouping and transfection， the expression levels of METL3 and KAI1/CD82 of each cell group were detected by qPCR and Western blot assay. The cell viability of each group was detected by CCK-8 experiment. The cell migration and invasion in each group were detected by cell scratch and Transwell invasion experiment. The methylation modification of KAI1/CD82 m6A in each group was detected by methylated RNA immunoprecipitation （MeRIP） experiment. Results Compared with rat pituitary cells， the METL3 protein and mRNA expression level in rat pituitary tumor cell lines GH3 and MMQ were significantly increased （P＜0.05）. KAI1/CD82 protein and mRNA expression levels were significantly reduced （P＜0.05）. There were no significant differences in cell indicators between the control group， the METTL3 empty plasmid group and the METTL3 siRNA negative control group （P＞0.05）. Compared with the control group and the METTL3 empty plasmid group， the cell viability， migration distance， number of invaded cells， METL3 protein and mRNA expression level， KAI1/CD82 m6A methylation level increased in the METL3 overexpression plasmid group （P＜0.05）， and the KAI1/CD82 protein and mRNA expression levels decreased （P＜0.05）. Compared with the control group and the METTL3 siRNA negative control group， the cell viability， migration distance， number of invaded cells， METTL3 protein and mRNA expression level and KAI1/CD82 m6A methylation level decreased in the METTL3 siRNA group （P＜0.05）， and KAI1/CD82 protein and mRNA expression levels increased （P＜0.05）. Conclusion Down-regulating the expression of METTL3 can reduce the level of KAI1/CD82 m6A methylation， promote the transcriptional expression of KAI1/CD82 mRNA， reduce the proliferation， invasion and migration of pituitary tumor cells， and inhibit the occurrence and development of pituitary tumors.

Key words： pituitary neoplasms; neuroendocrine tumors; methyltransferases; Kangai-1 protein; methylation; m6a methyltransferase; methyltransferase-like 3

垂體神經內分泌腫瘤是一種常見的神經系統腫瘤，發生于腦垂體，多數是良性腫瘤；過度生長的垂體細胞可導致內分泌紊亂，且隨著瘤體增大，會造成顱內壓升高，壓迫視神經，特別是難治性垂體神經內分泌腫瘤，不僅預后差，還可能發展成惡性腫瘤，轉移至其他器官［1-2］。甲基轉移酶樣3（METTL3）是一種介導RNA N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修飾的甲基轉移酶，在mRNA的生成、翻譯和降解過程中發揮著關鍵的調控作用，參與介導大腸癌［3］、卵巢癌［4］等多種惡性腫瘤的發生發展，過表達METTL3可加速腫瘤的形成、轉移及惡性進展［5］。有研究表明，METTL3在垂體神經內分泌腫瘤組織中高表達，在GH3細胞系中敲除METTL3基因，可明顯抑制垂體神經內分泌腫瘤細胞的增殖，減少生長激素的分泌，揭示METTL3可作為一個有前景的垂體神經內分泌腫瘤治療靶點［6］。轉移侵襲是腫瘤的特征之一，也是造成其惡性進展的重要因素。KAI1/CD82是一種腫瘤轉移抑制基因，其基因產物CD82屬于糖蛋白四跨膜蛋白超家族成員，KAI1/CD82在多種類型癌癥中呈低表達，導致預后不良［7］，KAI1/CD82可通過調節多種信號介導細胞凋亡、運動、侵襲和細胞間黏附過程，抑制乳腺癌、結腸腺癌、非小細胞肺癌、喉癌等多種腫瘤轉移［8-9］。研究顯示，METTL3可增加與上皮-間充質轉化相關基因的RNA的m6A修飾，增強癌細胞的遷移潛能［10］。筆者通過查閱SRAMP數據庫，預測KAI1/CD82基因存在多個m6A甲基化修飾位點，因而推測m6A甲基轉移酶METTL3可能通過調控KAI1/CD82表達參與垂體神經內分泌腫瘤的發生發展。本研究通過體外培養大鼠垂體神經內分泌腫瘤細胞系GH3，并進行初步探究。

1 材料與方法

1.1 主要材料

大鼠垂體細胞購自上海圻明生物科技有限公司；大鼠垂體神經內分泌腫瘤細胞GH3、MMQ，以及Ham's F-12K、馬血清、特級胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶溶液（含EDTA）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；β-actin、METTL3及KAI1/CD82基因引物，METTL3過表達質粒、METTL3空載質粒、METTL3 siRNA、METTL3 siRNA陰性對照購自上海吉瑪基因有限公司；PolyATtract? mRNA Isolation System試劑盒購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；LipofectamineTM2000、RNA fragmentation Reagents購自美國invitrogen公司；CCK-8試劑盒、Opti-MEM培養基、伊紅染色液、總RNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；一步法反轉錄熒光定量試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；Magna甲基化RNA免疫共沉淀（methylated RNA Immunoprecipitation，MeRIP）m6A試劑盒購自艾德科技（北京）有限公司；兔源抗大鼠METTL3一抗、兔源抗大鼠KAI1/CD82一抗、HRP偶聯山羊抗兔二抗購自英國Abcam公司。CKX41光學顯微鏡購自日本Olympus公司；Multiskan SkyHigh全波長酶標儀、NanoDrop 2000超微量分光光度計購自美國Thermo Fisher Scientific公司；C1000實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養、實時熒光聚合酶鏈反應（qPCR）實驗

培養液配制：向Ham's F-12K培養基中加入15%的馬血清、2.5%特級胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液，混勻。復蘇大鼠垂體細胞及垂體神經內分泌腫瘤細胞系GH3、MMQ，以上述培養液分別重懸后，接種于T25培養瓶中無菌培養。傳代后收集細胞，以試劑盒提取上述3種細胞總RNA，經超微量分光光度計測量出濃度，使用一步法反轉錄熒光定量試劑盒將其逆轉錄后進行qPCR反應，反應體系（20 μL）：1 μL cDNA（50 mg/L）、10 μL 2×SYBR qPCR Mix，各0.5 μL上下游引物（均為10 μmol/L），8 μL dd H₂O；反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，40個循環。所得到的各個基因Ct值采用2-ΔΔCt法進行分析，以β-actin為內參基因，各基因引物序列見表1。

1.2.2 蛋白免疫印跡實驗

收集傳代后的大鼠垂體細胞及GH3、MMQ，分別加入RIPA裂解液混勻、裂解、離心后提出其中總蛋白，測量各自濃度后每種細胞取20 ?g總蛋白，100 ℃煮沸變性后混勻上樣，120 V恒壓電泳后40 mA恒流濕轉，以3%牛血清白蛋白封閉非特異性抗原后裁剪下蛋白條帶，孵育兔源抗大鼠METTL3、KAI1/CD82、β-actin一抗和HRP偶聯山羊抗兔二抗后洗膜、顯色、攝片，采用Image J軟件定量圖片中各蛋白灰度值；以目的蛋白和β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1.2.3 GH3細胞分組處理

將傳代的GH3細胞接種于24孔板中，無菌培養24 h后棄去細胞培養液，加入Opti-MEM培養基。按照隨機數字表法分為對照組、METTL3過表達質粒組、METTL3空質粒組、METTL3 siRNA組、METTL3 siRNA陰性對照組，后4組以LipofectamineTM2000分別轉染METTL3過表達質粒、METTL3空載質粒、METTL3 siRNA及METTL3 siRNA陰性對照，具體濃度和轉染步驟參照文獻［11］，6 h后將Opti-MEM培養基更換為正常的細胞培養液，繼續無菌培養。

1.2.4 GH3細胞METTL3與KAI1/CD82蛋白及mRNA表達

將按照1.2.3分組轉染的GH3細胞接種于12孔板中，每組設6個復孔，無菌培養24 h后分別收集各組細胞，按照1.2.1和1.2.2方法通過qPCR和免疫印跡實驗檢測各組細胞中METTL3與KAI1/CD82 mRNA及蛋白表達水平。

1.2.5 GH3細胞增殖、遷移及侵襲檢測

（1）增殖。將按照1.2.3方法分組轉染的GH3細胞接種于96孔板中，另選出6個孔作為空白對照組，只加入培養液，不接種細胞。無菌培養24 h，然后每孔加適量CCK-8試劑，2 h后用全自動酶標儀測量每孔于450 nm波長下的吸光度（A），計算各組細胞活力（%）=（A實驗組-A空白對照組）/（A對照組-A空白對照組）×100%。（2）遷移。將按照1.2.3方法分組轉染的GH3細胞以5×105個/mL接種于12孔板中，無菌培養24 h。使用200 μL槍頭在每孔中心位置劃一條直線，將劃痕中細胞以PBS緩沖液漂洗干凈，于光鏡下觀察拍照后，運用Image Pro Plus軟件測量劃痕距離（測量各孔多個位點之間距離，取平均值），24 h后再次測量劃痕距離，計算細胞遷移距離（?m）=轉染前劃痕距離-轉染后劃痕距離。（3）侵襲。將按照1.2.3方法分組轉染的GH3細胞接種于12孔板中，無菌培養24 h后分別收集各組細胞，通過細胞計數板對各組細胞計數后，將其濃度調至5×105個/mL，加入被基質膠包被過的Transwell上室中培養（此時培養基為不含胎牛血清的Ham's F-12K），同時在Transwell下室中加入細胞培養液（含有10%胎牛血清），24 h后對下室細胞進行漂洗、固定、伊紅染色處理，于光鏡下觀察拍照并計數細胞數目。

1.2.6 GH3細胞KAI1/CD82 m6A甲基化修飾情況檢測

通過SRAMP數據庫預測KAI1/CD82基因的m6A甲基化修飾位點。將按照1.2.3分組轉染的GH3細胞接種于12孔板中，無菌培養24 h后分別收集各組細胞，以試劑盒提取其中的總RNA，參考文獻［12］的方法，以PolyATtract? mRNA Isolation System試劑盒富集多聚腺苷酸陽性的RNA，然后使用RNA fragmentation Reagents對其片段化，各組預留一部分做Input對照，剩余RNA通過Magna MeRIP m6A試劑盒中的m6A抗體進行免疫共沉淀，具體步驟參照各自說明指導書進行，沉淀后的RNA按照1.2.1中的方法進行qPCR實驗，檢測各組細胞KAI1/CD82 m6A甲基化水平。

1.3 統計學方法

采用SPSS 24.0軟件進行數據分析，計量資料符合正態分布，以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 垂體神經內分泌腫瘤與正常垂體組織細胞中METTL3、KAI1/CD82表達比較

相比大鼠垂體細胞，大鼠垂體神經內分泌腫瘤細胞系GH3、MMQ中METTL3蛋白及mRNA表達水平升高，KAI1/CD82蛋白及mRNA表達水平降低（P＜0.05），見圖1、表2。由于GH3細胞中METTL3蛋白及mRNA表達水平高于MMQ細胞，因此選擇GH3細胞用于后續實驗。

2.2 各組GH3細胞METTL3與KAI1/CD82表達水平比較

與對照組相比，METTL3空質粒組、METTL3 siRNA陰性對照組METTL3、KAI1/CD82蛋白及mRNA表達水平差異無統計學意義；與對照組、METTL3空質粒組相比，METTL3過表達質粒組METTL3蛋白及mRNA表達水平升高（P＜0.05），KAI1/CD82蛋白及mRNA表達水平降低（P＜0.05）；與對照組、METTL3 siRNA陰性對照組相比，METTL3 siRNA組METTL3蛋白及mRNA表達水平降低（P＜0.05），KAI1/CD82蛋白及mRNA表達水平升高（P＜0.05）。見圖2、表3。

2.3 各組GH3細胞增殖情況比較

與對照組相比，METTL3空質粒組、METTL3 siRNA陰性對照組細胞活力差異無統計學意義；與對照組、METTL3空質粒組相比，METTL3過表達質粒組細胞活力升高（P＜0.05）；與對照組、METTL3 siRNA陰性對照組相比，METTL3 siRNA組細胞活力降低（P＜0.05），見表4。

2.4 各組GH3細胞遷移情況比較

與對照組相比，METTL3空質粒組、METTL3 siRNA陰性對照組遷移距離差異無統計學意義；與對照組、METTL3空質粒組相比，METTL3過表達質粒組遷移距離增大（P＜0.05）；與對照組、METTL3 siRNA陰性對照組相比，METTL3 siRNA組遷移距離減小（P＜0.05）；見表4、圖3。

2.5 各組GH3細胞侵襲情況比較

與對照組相比，METTL3空質粒組、METTL3 siRNA陰性對照組侵襲細胞數差異無統計學意義；與對照組、METTL3空質粒組相比，METTL3過表達質粒組侵襲細胞數增多（P＜0.05）；與對照組、METTL3 siRNA陰性對照組相比，METTL3 siRNA組侵襲細胞數減少（P＜0.05）；見表4、圖4。

2.6 GH3細胞中METTL3對KAI1/CD82 m6A甲基化修飾的影響

通過SRAMP數據庫預測顯示，KAI1/CD82基因存在多個m6A甲基化修飾位點，見圖5。與對照組相比，METTL3空質粒組、METTL3 siRNA陰性對照組KAI1/CD82 m6A甲基化水平差異無統計學意義；與對照組、METTL3空質粒組相比，METTL3過表達質粒組KAI1/CD82 m6A甲基化水平升高（P＜0.05）；與對照組、METTL3 siRNA陰性對照組相比，METTL3 siRNA組KAI1/CD82 m6A甲基化水平降低（P＜0.05），見表4。

3 討論

目前，臨床治療垂體神經內分泌腫瘤，特別是難治性垂體神經內分泌腫瘤，主要以手術、放射治療、服藥為主，不僅易損傷大腦其他重要組織，還可能引起一系列后遺癥，治療效果并不理想，因而探討垂體神經內分泌腫瘤發生發展的分子機制，尋找更有效的治療手段具有重要意義［13-14］。

m6A修飾在癌癥的發病及進展過程中起到重要的調控作用。甲基轉移酶METTL3可介導多種致癌、抑癌基因的mRNA m6A修飾，調控大腸癌、肝細胞癌等多種腫瘤的發生發展［15-16］。研究表明，降低METTL3表達可抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，同時促進其凋亡［17］，還能抑制垂體神經內分泌腫瘤細胞體外增殖生長［6］。本研究結果顯示，相比正常垂體細胞，METTL3在垂體神經內分泌腫瘤細胞中高表達，以METTL3 siRNA下調GH3細胞中METTL3表達，可降低細胞活力、遷移距離、侵襲細胞數，而過表達METTL3起相反作用，提示METTL3參與介導垂體神經內分泌腫瘤細胞的增殖、遷移與侵襲過程，與以前研究結果一致，提示METTL3可作為治療垂體神經內分泌腫瘤的重要作用靶點。

KAI1/CD82是一種抑癌基因，主要通過抑制腫瘤細胞生長、侵襲等生理過程而發揮抗癌作用，KAI1/CD82低表達時，其腫瘤抑制功能減弱，有利于腫瘤的進展和轉移，是造成腫瘤患者預后不良的重要因素［18-20］。筆者查詢SRAMP數據庫顯示，KAI1/CD82基因存在多個m6A甲基化修飾位點，因而推測METTL3介導垂體神經內分泌腫瘤發生發展的分子機制可能與調控KAI1/CD82的表達有關。本研究結果顯示，相比正常垂體細胞，KAI1/CD82在垂體神經內分泌腫瘤細胞中低表達，下調GH3細胞中METTL3表達可降低KAI1/CD82 m6A甲基化水平，升高其mRNA表達水平，抑制細胞的增殖、遷移、侵襲，過表達METTL3時作用相反；提示METTL3可能通過對KAI1/CD82基因進行m6A mRNA甲基化修飾，下調KAI1/CD82表達，促進垂體神經內分泌腫瘤的發生及進展；而下調METTL3表達可降低KAI1/CD82 m6A甲基化水平，促進KAI1/CD82表達，抑制垂體神經內分泌腫瘤細胞遷移及侵襲，發揮抑癌作用。

總之，METTL3基因可能通過調控甲基化修飾介導KAI1/CD82基因表達，在垂體神經內分泌腫瘤的發生發展中發揮重要作用。本研究表明，敲低METTL3表達可促進KAI1/CD82基因表達并抑制KAI1/CD82 m6A甲基化，進而抑制垂體神經內分泌腫瘤細胞遷移及侵襲，提示敲低METTL3可能是一種有前景的垂體神經內分泌腫瘤治療策略，后續會通過敲低KAI1/CD82表達進行驗證，深入探究METTL3作為垂體神經內分泌腫瘤治療靶點的潛力。

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（2022-10-27收稿 2022-12-02修回）

（本文編輯 李國琪）