黃連素調節PI3K/AKT/NF-κB信號通路對慢性濕疹大鼠皮膚損傷的影響

秦宗碧　徐愛琴　蔡翔　邱百怡　王首帆　李伶華　朱立宏

摘要：目的 探討黃連素對慢性濕疹大鼠皮膚損傷及磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/核因子-κB（NF-κB）信號通路的影響。方法 60只SD大鼠分為對照組，慢性濕疹組，黃連素低、中、高劑量組和潑尼松組，每組10只。除對照組外，其余組大鼠背部涂抹2，4-二硝基氯苯（DNCB）構建慢性濕疹模型。進行濕疹面積及嚴重度指數（EASI）評分；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清組胺、胃泌素釋放肽（GRP）、免疫球蛋白E（IgE）、白細胞介素（IL）-4、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、γ干擾素（IFN-γ）水平；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察皮損組織病理學改變；Western blot法檢測皮損組織PI3K/AKT/NF-κB信號通路相關蛋白表達。結果 與對照組比較，慢性濕疹組大鼠皮損組織受損嚴重，血清組胺、GRP、IgE、IL-4、IL-6、TNF-α水平以及皮損組織IL-4、IL-6、TNF-α蛋白表達和p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-NF-κB抑制蛋白α（IκBα）/IκBα比值升高，血清和皮損組織IFN-γ降低（P＜0.05）。與慢性濕疹組比較，黃連素各劑量組和潑尼松組大鼠皮損組織病理損傷有所改善，EASI評分下降，血清組胺、GRP、IL-4、IL-6、TNF-α水平以及皮損組織IL-6、TNF-α蛋白表達和p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα比值降低，血清和皮損組織IFN-γ升高（P＜0.05），同時黃連素中、高組和潑尼松組大鼠血清IgE和皮損組織IL-4降低（P＜0.05），且黃連素高劑量組效果更好；黃連素高劑量組和潑尼松組上述指標比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 黃連素尤其是高劑量黃連素可抑制PI3K/AKT/NF-κB信號通路激活，減輕免疫失衡和炎癥反應，改善慢性濕疹大鼠皮膚損傷。

關鍵詞：小檗堿；皮膚疾病，濕疹性；免疫，細胞；炎癥；疾病模型，動物；PI3K/AKT/NF-κB信號通路

中圖分類號：R758.23文獻標志碼：ADOI：10.11958/20221627

Effects of berberine on skin damage in rats with chronic eczema by regulating

PI3K/AKT/NF-κB signaling pathway

QIN Zongbi， XU Aiqin， CAI Xiang， QIU Baiyi， WANG Shoufan， LI Linghua， ZHU Lihong

Department of Dermatology， Wuhan Hospital of Traditional Chinese Medicine， Wuhan 430014， China

Abstract： Objective To investigate the effect of berberine on skin damage and phosphatidylinositol-3-kinase （PI3K）/protein kinase B （AKT）/nuclear factor-κB （NF-κB） signaling pathway in rats with chronic eczema. Methods Sixty SD rats were divided into the control group， the chronic eczema group， the berberine （low， medium and high dose） groups and the prednisone group （n=10 for each group）. Except for the control group， the other groups of rats were treated with 2，4-dinitrochlorobenzene （DNCB） on back to establish chronic eczema model. Eczema area and severity index （EASI） scores were measured in groups. Serum levels of histamine， gastrin-releasing peptide （GRP）， immunoglobulin E （IgE）， interleukin （IL）-4， IL-6， tumor necrosis factor α （TNF-α） and γ interferon （IFN-γ） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Histopathological changes of skin lesions were observed by hematoxylin-eosin （HE） staining. Expression levels of PI3K/AKT/NF-κB signaling pathway-related proteins in skin lesions were detected by Western blot assay. Results Compared with the control group， skin lesions were seriously damaged in the chronic eczema group. Serum levels of histamine， GRP， IgE， IL-4， IL-6 and TNF-α， and protein expression levels of IL-4， IL-6 and TNF-α and p-PI3K/PI3K， p-AKT/AKT， p-NF-κB p65/NF-κB p65 and p-NF-κB inhibitor protein α （IκBα）/IκBα ratio in skin lesions were increased， serum and skin lesion IFN-γ decreased （P＜0.05）. Compared with the chronic eczema group， the pathological damage of skin lesions of rats was improved in the berberine groups and the prednisone group. EASI score， serum levels of histamine， GRP， IgE， IL-4， IL-6 and TNF-α levels， and protein expression levels of IL-4， IL-6 and TNF-α and p-PI3K/PI3K， p-AKT/AKT， p-NF-κB p65/NF-κB p65， p-IκBα/ IκBα ratio in skin lesions decreased， serum and skin lesion tissue IFN-γ increased （P＜0.05）. Serum IgE and IL-4 in skin lesions of rats decreased in the berberine groups （medium and high dose groups） and the prednisone group （P＜0.05）. The effect was better in the high dose berberine group. There were no significant differences in the above indexes between the high dose berberine group and the prednisone group （P＞0.05）. Conclusion Berberine， especially high dose berberine， can inhibit the activation of PI3K/AKT/NF-κB signaling pathway， reduce immune imbalance and inflammatory response， and improve skin damage in rats with chronic eczema.

Key words： berberine; skin diseases， eczematous; immunity， cellular; inflammation; disease models， animal; PI3K/AKT/NF-κB signal path

慢性濕疹是皮膚科常見的一種過敏性、炎癥性疾病，由內外多種因素引起，以紅斑、瘙癢、水腫、苔蘚化等為特征，病程較長，易反復發作，治愈困難，嚴重影響患者工作與生活［1］。目前，慢性濕疹的臨床治療方式主要包括以糖皮質激素等為主的局部治療和以免疫抑制劑、抗組胺藥等為主的系統治療，但治療效果尚不理想，且存在一定的不良反應［2］。研究表明，中醫藥治療慢性濕疹具有療效顯著、不良反應小、患者接受度高等優勢［3-4］。黃連素（亦稱小檗堿）是從黃連中分離的一種季銨生物堿，具有抗菌、抗炎等生物活性［5］。研究證實，黃連素可通過抑制嗜酸性粒細胞趨化因子活化和白細胞介素（IL）-4、IL-5等Th2型細胞因子的表達以及相關的炎性細胞募集來改善特應性皮炎小鼠皮膚癥狀和瘙癢［6］；外用小檗堿乳膏可顯著改善耳廓復合痤瘡模型大鼠的皮損［7］。此外，以黃連為君藥，配伍當歸、姜黃等藥材制成的加味黃連膏可通過抑制炎癥反應有效治療濕疹［8］。黃連素對濕疹、帶狀皰疹等多種皮膚疾病均具有治療作用［9］。然而，黃連素在慢性濕疹中的作用機制尚不明確。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路在炎癥性疾病中發揮重要調控作用，例如：抑制PI3K/AKT/NF-κB通路可減輕膠原誘導型類風濕關節炎大鼠炎癥反應［10］；上調PI3K/AKT/NF-κB信號通路表達可導致人腎小管上皮細胞炎癥損傷加重，而抑制PI3K/AKT/NF-κB信號通路則可有效減輕人腎小管上皮細胞炎癥損傷［11］。基于以上研究結果，筆者推測黃連素可能通過調節PI3K/AKT/NF-κB信號通路減輕炎癥反應，改善慢性濕疹皮膚損傷。因此，本研究通過構建慢性濕疹模型大鼠，探究黃連素對慢性濕疹大鼠皮膚損傷的影響以及PI3K/AKT/NF-κB信號通路在此過程中的作用，以期為黃連素治療慢性濕疹的臨床推廣應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

SPF級雄性SD大鼠60只，6周齡，平均體質量（200±15）g，購自中國科學院上海藥物研究所，生產許可證號：SCXK（滬）2020-0005。在SPF級實驗動物中心統一飼養標準下喂養，符合3R原則。2，4-二硝基氯苯（2，4-dinitrochlorobenzene，DNCB；美國sigma公司）；醋酸潑尼松片（浙江仙琚制藥股份有限公司，國藥準字H33021207）；黃連素片（鹽酸小檗堿片；杭州賽諾菲民生健康藥業有限公司，國藥準字H33021708）；大鼠組胺、胃泌素釋放肽（gastrin-releasing peptide，GRP）、免疫球蛋白E（IgE）、IL-4、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、γ干擾素（IFN-γ）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（上海富雨生物科技有限公司）；兔抗IL-4、IL-6、TNF-α、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、GAPDH多/單克隆抗體和HRP標記山羊抗兔/鼠IgG（英國Abcam公司）；兔抗IFN-γ多克隆抗體（上海恒斐生物科技有限公司）；鼠抗p-NF-κB p65 （Ser536）、NF-κB p65單克隆抗體（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒以及兔抗NF-κB抑制蛋白α（NF-κB inhibitor protein α，IκBα）、p-IκBα多克隆抗體（北京百奧萊博科技有限公司）。

1.2 慢性濕疹模型構建與分組

造模前1 d，所有大鼠背部脫毛（面積為3 cm×3 cm），并隨機抽取10只大鼠作為對照組。脫毛次日在脫毛區域涂抹5% DNCB（50 μL）進行第1次致敏，1周后在脫毛區域進行二次脫毛，二次脫毛次日在脫毛區域涂抹1% DNCB（100 μL）進行第2次致敏，持續致敏3周，每周1% DNCB（100 μL）致敏1次。待最后一次致敏完成后3 d，觀察大鼠的行為狀態，若大鼠出現皮膚干燥粗糙、角化、片狀紅斑、結痂、棘層肥厚、輕度海綿水腫等癥狀以及回頭舔舐頻繁、煩躁不安，提示慢性濕疹模型構建成功［12-13］。對照組在同一時間進行脫毛處理，但不涂抹DNCB。

將造模成功的50只大鼠按照隨機數字表法隨機分為慢性濕疹組，黃連素低、中、高劑量組和潑尼松組，每組10只。黃連素低、中、高劑量組大鼠灌胃黃連素片分別為0.04、0.08、0.12 g/kg，藥物用量參考人和大鼠間等效劑量系數折算法進行計算，人和大鼠體質量分別按70 kg和200 g；潑尼松組大鼠灌胃醋酸潑尼松片25 mg/kg［14］；慢性濕疹組和對照組灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續給藥2周。

1.3 濕疹面積及嚴重度指數（EASI）評分

分別在給藥0周、1周、2周參照EASI評分標準［15］評估各組大鼠皮膚臨床癥狀，包括紅斑、鱗屑、苔蘚樣變、水腫/浸潤/丘疹4項，每項以0-3分進行計分：無癥狀為0分；輕度為1分；中度為2分；重度為3分，各項得分相加為總分。每只大鼠EASI評分由2位實驗人員獨立進行，取平均值。

1.4 ELISA檢測大鼠血清中組胺、GRP、IgE、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平

給藥結束后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉各組大鼠，腹主動脈取血5 mL，3 000 r/min離心15 min，分離上層血清，置于-20 ℃冰箱保存。按照ELISA試劑盒說明書，梯度稀釋標準品和血清，使用酶標儀檢測各孔450 nm波長處光密度（OD）值。先根據標準品濃度和OD值繪制標準曲線，再根據血清濃度和OD值計算血清中組胺、GRP、IgE、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平。

1.5 HE染色觀察大鼠皮損組織病理學改變

取血完成后頸椎脫臼處死各組大鼠，剪取背部皮損處組織（對照組剪取脫毛區域皮膚組織），將一部分皮損組織置于10%中性甲醛中固定，制備常規石蠟組織切片（厚度4 ?m），將切片脫蠟、水合后依次添加蘇木素、伊紅染色液進行染色，封片后在光鏡下觀察皮損組織病理學改變。剩余皮損組織置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.6 Western blot法檢測大鼠皮損組織中PI3K/AKT/NF-κB信號通路相關蛋白表達

取出-80 ℃超低溫冰箱保存的皮損組織，裂解液充分裂解，獲取總蛋白，采用二喹啉甲酸法對蛋白濃度進行定量，隨后將蛋白煮沸變性，每泳道上樣20 ?g蛋白（20 ?L）進行凝膠電泳（5%濃縮膠、12%分離膠），接著通過電轉移將蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜，使用5%牛血清白蛋白封閉膜2 h，添加一抗稀釋液（IL-4、IL-6、TNF-α、PI3K、p-AKT、p-NF-B p65，1∶1 000；IFN-γ、p-PI3K、AKT、IκBα、p-IκBα，1∶500；NF-κB p65，1∶2 000；GAPDH，1∶10 000）4 ℃孵育過夜，洗滌后添加對應種屬的二抗工作液（HRP標記山羊抗兔/鼠IgG，1∶5 000），再次洗滌后添加化學發光（emission chemoluminescence，ECL）試劑顯色、曝光。GAPDH為內參蛋白，使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.7 統計學方法

采用Graphpad Prism 8.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠EASI評分比較

各組大鼠給藥0周時的EASI評分比較差異無統計學意義（P＞0.05）。給藥1周、2周，與慢性濕疹組比較，黃連素低、中、高劑量組和潑尼松組大鼠EASI評分降低（P＜0.05），且黃連素高劑量組效果更好；黃連素高劑量組和潑尼松組大鼠EASI評分比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠血清中組胺、GRP、IgE水平比較

與對照組比較，慢性濕疹組大鼠血清中組胺、GRP、IgE水平升高（P＜0.05）；與慢性濕疹組比較，黃連素低劑量組大鼠血清中組胺、GRP水平降低，黃連素中、高劑量組和潑尼松組大鼠血清中組胺、GRP、IgE水平降低（P＜0.05），且黃連素高劑量組效果更好；黃連素高劑量組和潑尼松組大鼠血清中組胺、GRP、IgE水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 大鼠血清中IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平比較

與對照組比較，慢性濕疹組大鼠血清中IL-4、IL-6、TNF-α水平升高，IFN-γ水平降低（P＜0.05）；與慢性濕疹組比較，黃連素低、中、高劑量組和潑尼松組大鼠血清中IL-4、IL-6、TNF-α水平降低，IFN-γ水平升高（P＜0.05），且黃連素高劑量組效果更好；黃連素高劑量組和潑尼松組大鼠血清中IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

2.4 各組大鼠皮損組織病理學改變

對照組皮膚組織無明顯異常；慢性濕疹組表皮層和棘皮層增厚，存在角化過度和大量炎性細胞浸潤；黃連素低、中、高劑量組和潑尼松組大鼠上述病理損傷均有所改善，表皮層和棘皮層輕度增厚，角化過度減輕，少量炎性細胞浸潤，且黃連素高劑量組和潑尼松組改善更為明顯，見圖1。

2.5 各組大鼠皮損組織中IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ蛋白表達水平比較

與對照組比較，慢性濕疹組大鼠皮損組織中IL-4、IL-6、TNF-α蛋白表達水平升高，IFN-γ蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與慢性濕疹組比較，黃連素低劑量組大鼠皮損組織中IL-6、TNF-α蛋白表達水平降低，IFN-γ蛋白表達水平升高（P＜0.05），黃連素中、高劑量組和潑尼松組大鼠皮損組織中IL-4、IL-6、TNF-α蛋白表達水平降低，IFN-γ蛋白表達水平升高（P＜0.05），且黃連素高劑量組效果更好；黃連素高劑量組和潑尼松組大鼠皮損組織中IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ蛋白表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2、表4。

2.6 各組大鼠皮損組織中PI3K/AKT/NF-κB信號通路相關蛋白表達水平比較

與對照組比較，慢性濕疹組大鼠皮損組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα比值均升高（P＜0.05）；與慢性濕疹組比較，黃連素低、中、高劑量組和潑尼松組大鼠皮損組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα比值均降低（P＜0.05），且黃連素高劑量組效果更好；黃連素高劑量組和潑尼松組大鼠皮損組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα比值比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3、表5。

3 討論

慢性濕疹病因復雜，發病機制尚不明確。研究認為，免疫功能異常以及炎癥反應均參與了慢性濕疹的發病過程［16］。因此，一些調節免疫失衡和抗炎的中藥或其單體可能對于改善慢性濕疹皮膚損傷具有一定療效。黃連素為一種天然存在的異喹啉類生物堿，對腸道疾病、呼吸系統疾病等多種疾病具有治療作用，并通過NF-κB、ERK1/2和p38 MAPK通路等多種途徑發揮抗炎和免疫調節特性［17-18］。本研究通過涂抹DNCB成功制備了慢性濕疹大鼠模型，并以潑尼松為陽性藥物［14］，結果顯示經不同劑量黃連素和潑尼松治療1周、2周后慢性濕疹大鼠EASI評分均明顯降低，治療結束后皮損組織病理損傷均有所改善，且黃連素高劑量組效果更好，提示黃連素尤其是高劑量黃連素能夠改善慢性濕疹大鼠皮膚損傷，與潑尼松作用效果相似。

組胺作為一種有機含氮化合物，存在于皮膚、腸等多種組織中，當組織受損或發生炎癥和過敏反應時可大量釋放并入血，且抗組胺藥物可治療濕疹［19］。GRP是一種在中樞神經系統廣泛存在的神經肽，其水平異常升高與皮膚瘙癢有關，且已被證明其參與慢性濕疹的發病［20］。此外，血清IgE水平升高也是慢性濕疹的一個常見表現［21］。本研究結果顯示，黃連素低劑量組能夠降低慢性濕疹大鼠血清中組胺、GRP水平，黃連素中、高劑量組和潑尼松組均可降低血清中組胺、GRP和IgE水平，且黃連素高劑量組和潑尼松組對血清中組胺、GRP和IgE的作用效果相近，進一步證實了黃連素對慢性濕疹的治療作用。

IL-6、TNF-α是由炎性細胞釋放的多效促炎細胞因子，在濕疹模型小鼠血清中呈高水平表達［8］。IL-4、IL-10等Th2型細胞因子和IL-2、IFN-γ等Th1型細胞因子失衡所引起的細胞因子分泌紊亂亦在濕疹的免疫炎癥反應中起重要調控作用。朱雨晴等［12］研究發現，柏蛇濕疹膏可降低血清中IL-4、IL-10水平并提升IFN-γ水平，有效改善慢性、急性濕疹模型大鼠皮損。本研究發現，與對照組比較，慢性濕疹模型大鼠血清中IL-4、IL-6、TNF-α水平以及皮損組織中IL-4、IL-6、TNF-α蛋白表達水平均升高，而血清中IFN-γ水平和皮損組織中IFN-γ蛋白表達水平降低，提示慢性濕疹模型大鼠體內存在免疫失衡和炎癥反應，這與皮損組織中可見大量炎性細胞浸潤相一致。此外，本研究中，黃連素中、高劑量組和潑尼松組血清和皮損組織中IL-4、IL-6、TNF-α水平降低，而IFN-γ水平升高；且除皮損組織中IL-4外，黃連素低劑量組上述指標差異也有統計學意義；而黃連素高劑量組和潑尼松組大鼠血清和皮損組織中IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平差異無統計學意義，表明黃連素能夠減輕慢性濕疹中免疫失衡和炎癥反應，與既往文獻［17-18］報道結果相似。然而，陶文婷等［22］研究發現，小檗堿通過抑制Th1反應，恢復IFN-γ/IL-4平衡發揮對遲發型超敏反應的抑制作用，這與本研究結果相矛盾，推測可能是由于所構建疾病模型的發病機制不同導致。

PI3K/AKT/NF-κB信號通路是與炎癥反應密切相關的信號轉導途徑，PI3K、AKT發生磷酸化激活后促使轉錄因子NF-κB發生磷酸化，同時誘導IκBα磷酸化，導致NF-κB通路激活，從而促進TNF-α、IL-6等促炎細胞因子的分泌，誘發炎癥［23-24］。本研究中，慢性濕疹組較對照組大鼠皮損組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα比值均升高，而慢性濕疹大鼠經不同劑量黃連素和潑尼松治療后PI3K、AKT、NF-κB p65、IκBα蛋白磷酸化水平均降低，且黃連素高劑量組效果更好，黃連素高劑量組和潑尼松組以上指標差異無統計學意義，表明黃連素減輕慢性濕疹大鼠中免疫失衡和炎癥反應可能與抑制皮損組織中PI3K/AKT/NF-κB信號通路激活有關。Wang等［25］研究表明，黃連素通過調節PI3K/AKT/NF-κB信號通路抑制炎癥反應和心肌細胞凋亡，可能是治療缺血再灌注損傷的潛在藥物。Wu等［26］研究也證實，黃連素改善糖尿病大鼠胰島素抵抗和炎癥的作用機制與調節NF-κB p65、PI3K p85和AKT Ser473等途徑有關。

綜上所述，黃連素尤其是高劑量黃連素能夠抑制PI3K/AKT/NF-κB信號通路激活，減輕免疫失衡和炎癥反應，改善慢性濕疹大鼠皮膚損傷，這為臨床慢性濕疹的治療提供了一定科學依據，但仍有待進一步通過其他干預通路等進行驗證。

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（2022-10-09收稿 2023-01-12修回）

（本文編輯 陸榮展）