低溫反硝化聚磷菌脫氮除磷性能研究

林錦美，武之杰，陳錦芳，段金明，巫晶晶

（1.集美大學(xué)港口與海岸工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021）

傳統(tǒng)的脫氮除磷工藝由于聚磷菌（Phosphate accumulating organisms，PAOs）與反硝化細(xì)菌對(duì)碳源存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，導(dǎo)致氮磷不能高效去除［1］。而利用反硝化聚磷菌（Denitrifying phosphate accumulating organisms，DPAOs）進(jìn)行的脫氮除磷工藝成為研究重點(diǎn)。反硝化除磷在缺氧條件下，可利用硝酸鹽或亞硝酸鹽作為最終電子受體分解胞內(nèi)PHA，產(chǎn)生的能量可用于過(guò)量吸磷［2］。通過(guò)菌群代謝作用完成吸磷與反硝化的過(guò)程，提高脫氮除磷的效率，減少曝氣量與污泥剩余量，實(shí)現(xiàn)能源節(jié)約與資源節(jié)約。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種和培養(yǎng)基

菌種：從蘭州市安寧污水處理廠冬季曝氣池的活性污泥分離而得。

富磷富氮培養(yǎng)基：三水乙酸鈉3.23 g·L-1、磷酸氫二鉀25 mg·L-1、氯化銨305.52 mg·L-1、七水硫酸鎂91.26 mg·L-1、二水氯化鈣25.68 mg·L-1、硝酸鉀300 mg·L-1、氯化鈉15 mg·L-1、緩沖液8.5 mg·L-1、pH為7.2。

1.1.2 模擬廢水

實(shí)驗(yàn)采用人工模擬生活污水，以葡萄糖為有機(jī)碳源，KH2PO4以及K2HPO4為磷源，NH4Cl為氮源，微量元素來(lái)源：CaCl2、FeSO4·7H2O和蛋白胨等。原水水質(zhì)：TN為80 mg·L-1、TP為10 mg·L-1、pH為7。

1.1.3 儀器和試劑

主要儀器：紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV751 GD）、搖床、智能生化培養(yǎng)箱、pH 計(jì)（Model PHS-2C）、生物顯微鏡（B1-220）、PCR儀器（Real-time）、恒壓恒流電泳儀（EPS301）、高速冷凍離心機(jī)（5417R）、凝膠成像儀（JS-080C）。

主要試劑：細(xì)菌基因組快速提取試劑盒（盛生物技術(shù)有限公司），磷酸氫二鉀、草酸銨結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、番紅復(fù)染夜、香柏油、二甲苯等。

新型絲杠螺母由高性能工程塑料 iglidur J200 制成。在 igus 測(cè)試實(shí)驗(yàn)室中，這款新材料制成的螺母在硬質(zhì)陽(yáng)極氧化鋁絲杠上運(yùn)行的使用壽命比同樣工況下由標(biāo)準(zhǔn)螺母材料制成的螺母長(zhǎng)三倍。配合鋁制絲杠使用時(shí)，這款新型工程塑料制成的螺母可以降低噪音、減少震動(dòng)，而且重量更輕。它在火車和飛機(jī)的門系統(tǒng)以及物流搬運(yùn)和自動(dòng)化領(lǐng)域的應(yīng)用中非常常見(jiàn)。圓柱形和法蘭式絲杠螺母常備庫(kù)存，適用于大螺距螺紋絲杠和自鎖梯形螺紋絲杠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生化鑒定

根據(jù)文獻(xiàn)［5-6］，結(jié)合培養(yǎng)性狀并參考假單胞菌菌種群分類系統(tǒng)對(duì)菌種進(jìn)行生理生化特征鑒定。挑取的單菌落經(jīng)劃線純化后進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)，取純化后的菌種接種于各種生化鑒定管（乙醇、丙酸鹽、硝酸鹽、葡萄糖、蔗糖、山梨醇等），28 ℃恒溫培養(yǎng)24~48 h，觀察并判定結(jié)果。

1.2.2 16S rDNA的提取、PCR擴(kuò)增、序列比對(duì)、進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用盛生物技術(shù)有限公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，對(duì)所獲得培養(yǎng)物進(jìn)行離心收集沉淀，用漂洗液PE 洗滌離心后，并以此為模板設(shè)計(jì)16S rDNA 基因的通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGCTA CCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表1 PCR反應(yīng)體系Tab. 1 PCR reaction system

表2 PCR擴(kuò)增程序Tab. 2 PCR amplification program

PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將擴(kuò)增出來(lái)的目的核酸片段送往上海立菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，并通過(guò)Blast工具和MEGA5.03軟件進(jìn)行比對(duì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 脫氮除磷實(shí)驗(yàn)

挑取純化后的抗性菌株接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，16 ℃，120 r·min-1，過(guò)夜培養(yǎng)12 h。取1 mL菌液接種于150 mL滅菌的模擬廢水中，按照實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行脫氮除磷實(shí)驗(yàn)取樣，經(jīng)0.45 μm的濾膜過(guò)濾，測(cè)定樣品中TN、TP、pH值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 分析方法

總氮的測(cè)定采用過(guò)硫酸鉀氧化紫外分光光度法（GB-11849-89），總磷采用鉬酸銨分光光度法測(cè)定，pH采用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

對(duì)活性污泥進(jìn)行分離純化，將菌接種至生化管，28 ℃恒溫培養(yǎng)24~48 h，進(jìn)行細(xì)菌生化鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌革蘭氏染色呈陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)反應(yīng)陰性，可產(chǎn)生熒光；可分解蔗糖和木糖，能還原山梨醇、丙酸鹽，能使蔗糖產(chǎn)生果聚糖，在4 ℃生長(zhǎng)，41 ℃不可生長(zhǎng)，符合熒光假單胞菌生理生化特征（表3）。

表3 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果Tab. 3 Results of bacterial biochemical identification

2.2 基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)NCBI 網(wǎng)站的Blast 程序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行在線比對(duì)，從中選取具有較高同源性的序列。在CLUSTALW2官網(wǎng)進(jìn)行序列多重比對(duì)，同時(shí)，使用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖1。Blsat結(jié)果顯示，該序列與Pseudomonas sp.F330-7 16S ribosomal RNA gene（JQ995152）的進(jìn)化關(guān)系最近。因而該菌株被初步鑒定為Pseudomonas sp屬熒光假單胞菌屬。

2.3 探究反硝化除磷菌生長(zhǎng)過(guò)程中脫氮除磷性能

在TN 濃度為80 mg·L-1、TP 濃度為10 mg·L-1、pH 為7.0 的模擬廢水中，反應(yīng)溫度為15 ℃、轉(zhuǎn)速為120 r·min-1的條件下，探究不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)脫氮除磷效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，TN及TP值不斷下降，細(xì)菌量不斷增加，其去除率不斷上升，10 h后菌株生長(zhǎng)進(jìn)入靜止期，脫氮除磷性能趨于穩(wěn)定，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間均取10 h。

圖2 時(shí)間對(duì)脫氮除磷效果的影響Fig. 2 Effect of time on denitrification and phosphorus removal

2.4 探究pH對(duì)脫氮除磷效果的影響

在TN為79 mg·L-1、TP為10 mg·L-1、溫度15 ℃、轉(zhuǎn)速120 r·min-1、反應(yīng)時(shí)間為10 h條件下，探究在不同pH條件下脫氮除磷效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。進(jìn)水的pH對(duì)TP的去除率影響不大，當(dāng)pH處于酸性條件時(shí)，TN的含量隨著pH的增加而下降，去除率不斷上升，可能是pH過(guò)低時(shí)易破壞菌種的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，降低菌種代謝能力，從而影響正常的反硝化過(guò)程。當(dāng)pH處于中性或弱堿性條件時(shí)，菌種生長(zhǎng)繁殖較好，且脫氮除磷效果穩(wěn)定。當(dāng)pH處于堿性時(shí)，TP的去除率隨pH增加而趨于平衡，說(shuō)明可能是由于磷酸鹽析出而造成TP的去除率變高的假象［7］。由此得出菌種的最適生長(zhǎng)pH為8。

圖3 pH對(duì)脫氮除磷效果的影響Fig. 3 Effect of pH on denitrification and phosphorus removal

2.5 探究溫度對(duì)脫氮除磷效果的影響

在TN為79 mg·L-1、TP為10 mg·L-1、pH為7的模擬廢水中，轉(zhuǎn)速為120 r·min-1，反應(yīng)時(shí)間10 h條件下，探究不同的反應(yīng)溫度對(duì)脫氮除磷實(shí)驗(yàn)影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。反應(yīng)溫度對(duì)TN去除率和TN去除量都有很大的影響，在4、8 ℃時(shí)，菌株的生長(zhǎng)和脫氮均受到明顯抑制，可能與低溫抑制反硝化酶的活性［8］有關(guān)；溫度對(duì)反硝化除磷系統(tǒng)中污泥的TN和TP去除負(fù)荷具有顯著的影響，當(dāng)系統(tǒng)水溫為16 ℃時(shí)，系統(tǒng)污泥的TN和TP去除負(fù)荷較高，系統(tǒng)水溫低于16 ℃時(shí)，系統(tǒng)污泥的脫氮除磷效率顯著降低。因此，后續(xù)反應(yīng)溫度取16 ℃。

圖4 溫度對(duì)脫氮除磷效果的影響Fig. 4 Effect of temperature on denitrification and phosphorus removal

2.6 探究搖床轉(zhuǎn)速對(duì)脫氮除磷效果的影響

在TN為79 mg·L-1、TP為10 mg·L-1、pH為7的模擬廢水中，溫度為16 ℃，反應(yīng)時(shí)間為10 h條件下，探究不同的搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌種的脫氮除磷效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速小于140 r·min-1時(shí)，反應(yīng)體系中溶解氧的含量較少；隨著轉(zhuǎn)速的增加，反應(yīng)體系中溶解氧量不斷增加，菌種與底物接觸更充分，脫氮除磷效率提高［9］。當(dāng)轉(zhuǎn)速超過(guò)140 r·min-1時(shí)脫氮除磷效果下降，其原因可能是菌種間碰撞頻率增加，影響菌種的正常生長(zhǎng)，也可能是菌種的機(jī)械承受力水平不強(qiáng)，過(guò)高轉(zhuǎn)速引起菌種自溶破裂，進(jìn)而影響反硝化除磷效果［10］。后續(xù)反應(yīng)搖床轉(zhuǎn)速取140 r·min-1。

圖5 轉(zhuǎn)速對(duì)脫氮除磷效果的影響Fig. 5 Effect of rotational speed on denitrification and phosphorus removal

2.7 探究不同的C/N質(zhì)量濃度比對(duì)脫氮除磷效果的影響

在TN為79 mg·L-1、TP為10 mg·L-1、pH為7的模擬廢水中，搖床轉(zhuǎn)速為140 r·min-1，反應(yīng)時(shí)間為10 h，反應(yīng)溫度為16 ℃，探究不同的C/N質(zhì)量濃度比對(duì)脫氮除磷效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。菌株在低溫環(huán)境下，不同的C/N質(zhì)量濃度比條件都對(duì)脫氮除磷效果表現(xiàn)出較高程度處理能力，表明低溫環(huán)境下仍具有著較大的應(yīng)用潛能與開(kāi)發(fā)條件。菌株在C/N 質(zhì)量濃度比為12時(shí)達(dá)到最佳脫氮效率，這一結(jié)果與已有的研究結(jié)果類似［11-12］。

圖6 不同的C/N質(zhì)量濃度比對(duì)脫氮除磷效果的影響Fig. 6 Effect of C/N on denitrification and phosphorus removal

2.8 響應(yīng)面曲面法對(duì)反硝化除磷培養(yǎng)條件的優(yōu)化

為了尋找到反應(yīng)的最優(yōu)條件，選取與菌株反硝化除磷作用較為相關(guān)的3個(gè)因素：pH（A）、溫度（B）、轉(zhuǎn)速（C），進(jìn)行三因素三水平實(shí)驗(yàn)，方案見(jiàn)表4。

使用軟件design-expert8.0.6.1將數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理并進(jìn)行模擬，最后分別得到了TN與TP的去除率與以上3個(gè)因素的編碼值的函數(shù)關(guān)系，結(jié)果如下：

其中，R1代表TN去除率，R2代表TP去除率，A、B、C分別代表了pH、溫度、轉(zhuǎn)速的編碼值。TN去除率、TP去除率的方差分析見(jiàn)表5、表6。從表5、表6可以看出，Model 顯著性檢測(cè)P＜0.05，該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且適用于本研究。其中，變量A顯著，變量A2極其顯著，其余變量不顯著。

表5 以TN去除率為響應(yīng)值的方差分析Tab. 5 Variance analysis with TN removal rate as response value

表6 以TP去除率為響應(yīng)值的方差分析Tab. 6 Variance analysis with TP removal rate as response value

使用軟件design-expert8.0.6.1 將數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得二次響應(yīng)面回歸模型，各因素與TN 去除率、TP去除率的交互作用見(jiàn)圖7、圖8。由圖7、圖8可知，TN去除率、TP去除率會(huì)隨著pH（A）、溫度（B）、轉(zhuǎn)速（C）先增加后減少的趨勢(shì)，A、B，A、C 交互作用響應(yīng)面較為陡峭，等高線橢圓程度較為明顯，表明pH 與溫度間、pH 與轉(zhuǎn)速間的交互作用對(duì)于TN 與TP 的去除率影響顯著。將R1、R2 的目標(biāo)值設(shè)為maximize，R1 的lower 設(shè)為30.1，upper改為88.4；R2的lower 設(shè)為35.6，upper設(shè)為89.6，最后得出最優(yōu)處理?xiàng)l件見(jiàn)表7。由表7獲得反硝化除磷的最佳處理?xiàng)l件是pH為8，溫度為16 ℃，轉(zhuǎn)速為140 r·min-1。

圖7 pH與溫度間交互作用對(duì)污染物去除率的響應(yīng)面和等高線Fig. 7 Response surface and contour line of interaction between pH and temperature on removal rate

圖8 pH與轉(zhuǎn)速間交互作用對(duì)污染物去除率的響應(yīng)面和等高線Fig. 8 Response surface and contour line of interaction between pH and revolving speed on removal rate

表7 處理最優(yōu)條件組合以及其預(yù)測(cè)降解率Tab. 7 Optimum culture condition combination and its predicted degradation rate

3 結(jié)論

（1）污水處理廠冬季曝氣池的活性污泥中篩選出的低溫異氧反硝化菌，經(jīng)16S rDNA基因序列同源性分析，該菌株為熒光假單胞。

（2）通過(guò)響應(yīng)面分析可得，pH與溫度、pH與轉(zhuǎn)速的交互作用對(duì)于TN與TP的去除率影響顯著。實(shí)驗(yàn)所篩選出的培養(yǎng)優(yōu)化組合在反應(yīng)溫度為16 ℃，反應(yīng)時(shí)間為10 h，轉(zhuǎn)速為140 r·min-1，原水pH為8，C/N質(zhì)量濃度比為12時(shí)，反硝化除磷菌TP與TN的去除率分別為82.7%與88.1%，具有較好的脫氮除磷效果。