布魯氏菌病核酸檢測(cè)技術(shù)研究新進(jìn)展

黨 生，程大偉，劉長(zhǎng)民，張 俊，翟景波

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028043；2.通遼市科爾沁區(qū)第一人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；3.北大荒集團(tuán)總醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；4.人獸共患病防控自治區(qū)高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 通遼 028000；5.內(nèi)蒙古自治區(qū)布魯氏菌病防治工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

布魯氏菌病是通過(guò)直接或間接接觸受感染的動(dòng)物或食用其污染的食物傳播給人類，在全球范圍內(nèi)每年新增50萬(wàn)例人類布魯氏菌病病例，代表了世界上最普遍的細(xì)菌性人畜共患病［1］。由于布魯氏菌病可影響人體各個(gè)系統(tǒng)、器官，且癥狀不典型，易被誤診為其他系統(tǒng)疾病［1-2］。因此，及時(shí)準(zhǔn)確的診斷對(duì)于患者盡早采取有效的治療措施，防止患者錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)期而轉(zhuǎn)為慢性患者，減少疾病對(duì)患者造成的痛苦具有重要意義。

目前，臨床上布魯氏菌病的診斷主要依靠血清學(xué)檢查方法，而血清學(xué)診斷是通過(guò)檢測(cè)患者血液中的抗體來(lái)間接證明曾接觸過(guò)該病原體，患者的既往史和接觸史，在非自身抗原的識(shí)別、免疫處理以及抗體產(chǎn)生模式等方面，不同個(gè)體之間有著較大的差異，在感染的“窗口期”，抗體尚未產(chǎn)生，血清學(xué)無(wú)法達(dá)到診斷目的，且布魯氏菌與沙門(mén)氏菌之間存在著交叉抗原，因此，血清學(xué)診斷布魯氏菌病缺乏特異性。布魯氏菌培養(yǎng)是診斷布魯氏菌感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，然而，布魯氏菌生長(zhǎng)緩慢，通常需要5~7 d 甚至更長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)，且陽(yáng)性率低，因此，結(jié)果會(huì)造成布魯氏菌病的延遲診斷；同時(shí)，分離培養(yǎng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求高，操作不當(dāng)會(huì)造成工作人員的實(shí)驗(yàn)室感染。采用更安全、準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)方法對(duì)于布魯氏菌病的早期診斷和治療具有重要意義。

核酸擴(kuò)增試驗(yàn)（Nucleic Acid Amplification Test，NAAT）具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、安全性高、檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較短、可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，使其成為分子生物學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的檢測(cè)方法，在細(xì)菌感染診斷，特別是在那些不可培養(yǎng)和難以培養(yǎng)的微生物引起的感染中不斷應(yīng)用。與其他細(xì)菌一樣，NAAT用于布魯氏菌病的診斷勢(shì)必會(huì)取代傳統(tǒng)的血清學(xué)方法和細(xì)菌培養(yǎng)方法。筆者從布魯氏菌屬的基因組學(xué)、靶基因的選擇、常用引物序列、血液樣本在核酸擴(kuò)增試驗(yàn)中的應(yīng)用、核酸提取方法、核酸擴(kuò)增試驗(yàn)等方面對(duì)布魯氏菌病的核酸檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了綜述，以便讀者對(duì)布魯氏菌病的核酸檢測(cè)新技術(shù)進(jìn)行了解。

1 布魯氏菌屬的基因組學(xué)

要了解人類布魯氏菌病的核酸檢測(cè)技術(shù)，首先要知道布魯氏菌的基因組序列及不同種屬對(duì)人類的易感性。目前，布魯氏菌屬共計(jì)11 種包括6 個(gè)經(jīng)典種：B. melitensis、B. abortus、B. suis、B. canis、B. ovis和B. neotomae；從海洋哺乳動(dòng)物中分離出來(lái)2個(gè)種：B. ceti和B. pinnipedialis；3個(gè)新種：B. microti、B. inopinata和B. papionis［3］。截至2018年底，已有5株B. melitensis（16M、M28、M5-9、ATCC 23457和NI），4株B. suis（1330、ATCC 23445、VBI22和019），4株B. abortus（S19、9-941、A13334和2308），1株B. ovis（ATCC 25840），2株B. canis（ATCC 23365和HSK A52141），1株B. microtii（CCM 4915），1株B. pinnipedialis（B2/94），尚存在61個(gè)該屬不同成員的基因組。已經(jīng)測(cè)序的不同種和菌株之間的基因組比較，證實(shí)了布魯氏菌生物體之間染色體大小、核苷酸組成的相似性［4］。除豬種布魯氏菌生物變種3只有1條3.1 Mb的染色體外，其他種類的布魯氏菌都有2條約2.1 Mb和1.2 Mb的環(huán)形染色體，編碼區(qū)的比例相似，構(gòu)成基因的分布相等。相對(duì)較大的基因組表明，布魯氏菌包含了廣泛的基因庫(kù)，使其能夠在不同的生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)茁壯成長(zhǎng)，并感染各種動(dòng)物宿主。其中，B. melitensis、B. abortus和B. suis會(huì)導(dǎo)致人類感染［5］。了解基因組的組成特性，為布魯氏菌病核酸檢測(cè)靶基因的選擇提供了科學(xué)依據(jù)。

2 靶基因的選擇及常用引物序列

雖然已有較多的關(guān)于布魯氏菌病核酸檢測(cè)的研究報(bào)道，但可用的靶基因并不多見(jiàn)，根據(jù)靶基因序列和所選擇的核酸擴(kuò)增方法不同可設(shè)計(jì)多個(gè)不同的引物，見(jiàn)表1。最初被用作布魯氏菌病NAAT的靶基因是編碼外膜蛋白的omp2和omp31［6-7］，但有報(bào)道顯示，部分B. abortus中存在omp31的缺失使其作為擴(kuò)增靶基因受到質(zhì)疑［8］。omp28（bp26）也是布魯氏菌核酸檢測(cè)的常用靶基因，有研究將其與omp2和bcsp31進(jìn)行了比較，其在靈敏度上沒(méi)有明顯優(yōu)勢(shì)［9］。16S rRNA在細(xì)菌基因組中存在多個(gè)副本以及屬和物種特定的可變區(qū)域，常用作許多細(xì)菌感染分子診斷中的靶基因［10-12］，然而，與其他阿爾法變形菌門(mén)的交叉反應(yīng)限制了其在布魯氏菌病診斷中的應(yīng)用。插入序列IS711常用于布魯氏菌病分子診斷［13］，有研究報(bào)道IS711在核酸檢測(cè)時(shí)靈敏度更高［14］，這可能與該基因在布魯氏菌基因組中為多個(gè)拷貝相關(guān)，研究報(bào)道IS711在不同種基因組中的拷貝數(shù)在5~13拷貝之間［15］。編碼布魯氏菌屬特有的免疫原性膜蛋白31kDa的bcsp31基因［16］，是目前NAAT中檢測(cè)布魯氏菌感染最常用的靶基因［5］。

表1 布魯氏菌病分子診斷中常用的分子靶點(diǎn)和引物Tab. 1 Molecular targets and primers commonly used in molecular diagnosis of brucellosis

3 血液樣本在核酸擴(kuò)增試驗(yàn)中的應(yīng)用

與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法一樣，通過(guò)NAAT可以在任何臨床樣本中，如血液、體液、組織液和分泌物中發(fā)現(xiàn)布魯氏菌。因人類布魯氏菌病是一種系統(tǒng)性感染，因此，外周血是最好的臨床檢測(cè)樣本。

3.1 全血樣本

由于布魯氏菌病患者血液中的細(xì)菌濃度通常較低［17］，且布魯氏菌是細(xì)胞內(nèi)寄生菌，因此，最初的研究使用了外周血全血樣本以獲得最大量的DNA［18］。不幸的是，全血中高濃度的人類基因組DNA以及血紅蛋白對(duì)Taq聚合酶的強(qiáng)烈抑制作用嚴(yán)重影響了NAAT的性能［19］。

3.2 血清樣本

血清樣本被認(rèn)為是核酸擴(kuò)增試驗(yàn)最理想的樣本。然而，從理論上講，血清中布魯氏菌DNA濃度少于全血。有研究使用患者血清進(jìn)行PCR檢測(cè)，其陽(yáng)性率高于全血樣本，從而打消了這種疑慮［20］，這可能是因?yàn)樵诰Y期間DNA作為細(xì)菌分解產(chǎn)物釋放到了血液當(dāng)中。到20世紀(jì)90年代末，許多研究者已經(jīng)證明，在系統(tǒng)性和局灶性感染的患者血清中都存在可檢測(cè)到的布魯氏菌DNA［21-22］。DNA提取程序和擴(kuò)增過(guò)程所用技術(shù)的不斷改進(jìn)，表明血清是人類布魯氏菌病核酸檢測(cè)的首選樣本［23］。

4 核酸提取方法

眾所周知，不同的核酸提取方法顯著影響著獲得DNA 的數(shù)量、純度和完整性，從而影響NAAT 的靈敏度。比較研究表明，不同提取方法所獲取的DNA量的差異可達(dá)2個(gè)數(shù)量級(jí)。當(dāng)臨床樣本中只有少量的目標(biāo)DNA存在時(shí)，核酸提取方法對(duì)疾病的診斷尤為重要［24］。NAAT的廣泛使用，保證了試劑的標(biāo)準(zhǔn)化和準(zhǔn)確性。現(xiàn)已有布魯氏菌病核酸檢測(cè)技術(shù)試劑盒用于提取DNA，根據(jù)所檢測(cè)樣本類型的不同，使用不同的試劑盒。

近年來(lái)，已有關(guān)于使用布魯氏菌核酸提取試劑盒檢測(cè)布魯氏菌感染的效率的比較研究報(bào)道。其中一篇報(bào)告研究比較了從已知布魯氏菌Rev 1 細(xì)胞濃度的血清樣本中提取DNA 的7 種（UltraClean DNA BloodSpin kit、Puregene DNA purification system、High Pure PCR template preparation kit、Wizard Genomic DNA purification kit、GFX GenomicBlood DNA purification kit、NucleoSpin Tissue kit 和QIAamp DNA Blood minikit）商業(yè)核酸提取試劑盒的效率報(bào)道［25］。筆者發(fā)現(xiàn)，盡管所有測(cè)試方案都簡(jiǎn)單易行，但在DNA回收率、方法的可重復(fù)性和污染風(fēng)險(xiǎn)方面存在著很大差異。雖然所有的方案都能提取至少102fg的布魯氏菌DNA，但使用蛋白水解酶的提取方法是最有效的。除UltraClean 試劑盒外，所有其他試劑盒均表現(xiàn)出一定程度的污染。筆者認(rèn)為，UltraClean DNA BloodSpin 試劑盒是從血清中提取布魯氏菌DNA的最有效的方法［25］。

另一項(xiàng)研究評(píng)估了5 種（MagNA Pure Compact and MagNA Pure LC instruments、IT 1-2-3 DNA sample purification kit、MasterPure Complete DNA and RNA purification kit、QIAamp DNA blood minikit 和UltraClean microbial DNA isolation kit）商業(yè)自動(dòng)化和手動(dòng)核酸提取試劑盒的效率，從懸浮在PBS 中或采樣拭子中的B. melitensis、B. abortus、B. suis核酸提取方法得出結(jié)論，盡管所有評(píng)估的方法都能高效地滅活這3種高毒性的布魯氏菌，DNA的回收率和純度因樣本類型的不同而有所不同［26］。例如，當(dāng)應(yīng)用于細(xì)菌懸浮液時(shí)，MasterPure 試劑盒最為敏感，而MasterPure and MagNA Pure Compact 方法在從拭子樣本中提取DNA方面優(yōu)于前者［26］。

布魯氏菌血清血細(xì)胞同步核酸提取方法［27］與現(xiàn)有的核酸提取方法相比表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。目前，大部分試劑盒采用先裂解后純化的方法，即先通過(guò)對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行研磨來(lái)裂解細(xì)胞，然后再運(yùn)用酚處理進(jìn)行純化。然而在研磨的過(guò)程中不免會(huì)造成紅細(xì)胞的破壞，真核基因組DNA、血紅蛋白及純化時(shí)使用的酚等溶劑均對(duì)后續(xù)的PCR檢測(cè)造成干擾，且這些方法并不能確定布魯氏菌是在血清中還是血細(xì)胞中，對(duì)于布魯氏菌病的精準(zhǔn)診斷和治療不能提供有效指導(dǎo)。布魯氏菌血清血細(xì)胞同步核酸提取方法，將血清和血細(xì)胞分開(kāi)提取，考慮到布魯氏菌寄生在單核細(xì)胞內(nèi)且單核細(xì)胞具有黏附性，利用這一特點(diǎn)開(kāi)發(fā)的對(duì)血細(xì)胞先純化后裂解的提取技術(shù)，對(duì)病原菌DNA 提取純化得更徹底，并且該提取方法能明確布魯氏菌存在部位，即單純血清中含有、單純血細(xì)胞中含有或血清血細(xì)胞中同時(shí)含有，明確布魯氏菌存在部位在臨床診斷以及治療過(guò)程中意義重大。不足之處是血細(xì)胞提取所需時(shí)間較長(zhǎng)，在沖洗過(guò)程中會(huì)造成部分單核細(xì)胞的損失。

總之，目前可用的所有商業(yè)試劑盒都能夠有效滅活布魯氏菌，大多數(shù)能夠有效地從樣本中提取布魯氏菌DNA。考慮到人類布魯氏菌病臨床表現(xiàn)多樣，可為局部感染或全身感染，要根據(jù)患者的實(shí)際情況和樣本類型來(lái)進(jìn)一步確定不同樣本的最佳提取方案。

5 核酸擴(kuò)增試驗(yàn)

5.1 普通PCR

使用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行觀察，比傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法檢測(cè)布魯氏菌感染更快捷、更敏感，比血清學(xué)方法更特異［28］。然而，使用瓊脂糖凝膠電泳需要用溴化乙錠等染料對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行染色以方便在紫外燈下觀察條帶，這不僅增加了檢測(cè)所需時(shí)間，且溴化乙錠對(duì)人體有致癌作用，這種方法一次所能檢測(cè)的樣本量有限，并且對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行開(kāi)蓋處理，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物泄漏，形成氣溶膠造成實(shí)驗(yàn)室污染。

5.2 PCR-酶免疫分析法（PCR-EIA）

為避免普通PCR的上述缺陷，研究人員開(kāi)發(fā)了一種微孔板格式的PCR-酶免疫分析法（PCR-EIA）［29-30］，這種NAAT方法可避免使用溴化乙錠等有毒化合物對(duì)人體造成損害，通過(guò)將地高辛標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與擴(kuò)增子內(nèi)部互補(bǔ)的生物素化捕獲探針進(jìn)行雜交，在鏈霉親和素包被的微量滴度板上捕獲，并使用抗地高辛Fab-過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物進(jìn)行檢測(cè)［31］，其靈敏度約為10 fg，高于普通PCR。此外，對(duì)PCR-EIA結(jié)果的解釋遠(yuǎn)比普通PCR更客觀，該方法可以同時(shí)處理多個(gè)樣品，不需要使用紫外線或在暗室工作［32-33］。

5.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）方法

盡管引入了普通PCR對(duì)人類布魯氏菌病的檢測(cè)，隨后出現(xiàn)了PCR-EIA，但實(shí)時(shí)PCR為布魯氏菌病的核酸檢測(cè)技術(shù)帶來(lái)了真正的進(jìn)步，不僅提高了分子檢測(cè)的靈敏度，而且提高了可重復(fù)性，操作簡(jiǎn)化，能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本，檢測(cè)所需時(shí)間相對(duì)較短，不需要開(kāi)蓋處理，從而減少了產(chǎn)物泄漏污染實(shí)驗(yàn)室的可能性，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣本中細(xì)菌載量進(jìn)行相對(duì)定量分析［34-35］，這對(duì)繁忙的臨床實(shí)驗(yàn)室是一個(gè)重大的利好。

近年來(lái)，開(kāi)發(fā)出許多qPCR 的檢測(cè)方法，一些人使用DNA 結(jié)合染料，如SYBR green I 或EvaGreen，相對(duì)簡(jiǎn)單便宜，但會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，一些人則使用附著在寡核苷酸上的熒光團(tuán)，如：引物探針、水解探針或雜交探針，這些更昂貴，但特異性較強(qiáng)［36］，目前，qPCR技術(shù)已在很多國(guó)家和地區(qū)的臨床實(shí)驗(yàn)室中得到推廣使用。

5.4 多重實(shí)時(shí)PCR（Multiplex real-time PCR，M-RT-PCR）

M-RT-PCR是1988年由Chamberlain提出，通過(guò)在一個(gè)反應(yīng)體系中加入多個(gè)引物和探針同時(shí)完成對(duì)多個(gè)目的片段的檢測(cè)，可在基因突變、分型、疾病的鑒別診斷等多方面得到應(yīng)用。由于布魯氏菌病的臨床表現(xiàn)是非特異的，與肺外結(jié)核病、社區(qū)獲得性發(fā)熱綜合征、腦膜炎、肉芽腫性肝炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎和椎體骨髓炎等臨床表現(xiàn)相似［37］，此時(shí)M-RT-PCR是一種很好的選擇，因?yàn)樗軌蛟谝粋€(gè)反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增許多相關(guān)的物種特異性序列，在疾病的鑒別診斷中具有重要意義，特別是腦膜炎、椎體骨髓炎等病，若診斷延遲，貽誤治療，將導(dǎo)致患者預(yù)后不良。M-RT-PCR已被用于快速鑒別診斷布魯氏菌病和肺外結(jié)核病［37-38］，也可在物種水平上鑒定布魯氏菌病。

5.5 恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

近年來(lái)，恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)展現(xiàn)了巨大優(yōu)勢(shì)，與PCR 相比不需要昂貴的熱循環(huán)儀，整個(gè)反應(yīng)在恒溫條件下進(jìn)行，且所需時(shí)間相對(duì)較短。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP），是2000 年由日本學(xué)者NOTOMI 等［39］發(fā)明，使人們擺脫了對(duì)PCR 的依賴，但LAMP 的效率取決于靶DNA的大小，在30~200 bp的DNA效果最好，超過(guò)500 bp擴(kuò)增效果較差，有些疾病的基因可能不適合使用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法［40］。重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），是2006年由PIEPENBURG等［41］發(fā)明的一種新型恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)包含3種酶：與引物結(jié)合的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）和鏈置換DNA酶，在25~42 °C下均有生物活性，可以在短時(shí)間恒溫條件下對(duì)模板DNA進(jìn)行指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，在一項(xiàng)研究中報(bào)道RPA用于布魯氏菌病檢測(cè)中Real-time RPA和側(cè)流層析試紙條（LFD）RPA 的靈敏度和檢測(cè)限分別為4 個(gè)拷貝和6 個(gè)拷貝［42］，但RPA 檢測(cè)的探針設(shè)計(jì)復(fù)雜、費(fèi)用昂貴。

5.6 數(shù)字PCR

數(shù)字PCR是第三代PCR技術(shù)，是一種全新的絕對(duì)定量方法，檢測(cè)過(guò)程由PCR擴(kuò)增和熒光信號(hào)分析兩步組成，將反應(yīng)液稀釋到單分子水平后平均分配到數(shù)萬(wàn)個(gè)單元中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行采集，有熒光信號(hào)記為1，無(wú)熒光信號(hào)記為0，對(duì)樣本進(jìn)行絕對(duì)定量，不需要像qPCR做標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)對(duì)樣本進(jìn)行相對(duì)定量。現(xiàn)有研究報(bào)道了數(shù)字PCR用于布魯氏菌病檢測(cè)，靈敏度可達(dá)到單個(gè)拷貝，而平行的qPCR檢測(cè)靈敏度為3.68 fg/反應(yīng)［43］。但數(shù)字PCR也存在一定的缺陷，要對(duì)數(shù)萬(wàn)個(gè)反應(yīng)單元進(jìn)行檢測(cè)，故檢測(cè)所需時(shí)間較長(zhǎng)、不適合大量樣本的檢測(cè)，同時(shí)價(jià)格昂貴，檢測(cè)成本較高，目前還未應(yīng)用到臨床實(shí)驗(yàn)室。

5.7 CRISPR技術(shù)

CRISPR技術(shù)是根據(jù)細(xì)菌和古細(xì)菌的自然防御機(jī)制改編而成，這些生物體利用CRISPR衍生的RNA和各種Cas蛋白來(lái)切割和破壞外部侵略者的DNA以達(dá)到抵御病毒和其他異物的攻擊。近年來(lái)，研究者們發(fā)現(xiàn)部分Cas蛋白具有附屬切割單鏈核酸（ssDNA）活性，如Cas12a（Cpf1）、Cas12b、Cas13a、Cas13b等將其應(yīng)用于核酸檢測(cè)領(lǐng)域［44］。通常檢測(cè)反應(yīng)分為兩部分，第一部分是通過(guò)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，如：RPA、LAMP、RAA等對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增，第二部分為CRISPR-Cas檢測(cè)反應(yīng)，反應(yīng)體系中主要成分包含Cas蛋白、Cas蛋白對(duì)應(yīng)的crRNA、熒光報(bào)告探針，除此之外，需要檢測(cè)的目的片段需含有Cas蛋白相對(duì)應(yīng)的PAM序列，crRNA 引導(dǎo)Cas蛋白通過(guò)識(shí)別PAM序列與目標(biāo)DNA結(jié)合，形成crRNA、Cas蛋白、目標(biāo)DNA三元復(fù)合物，該復(fù)合物可對(duì)體系內(nèi)熒光標(biāo)記的單鏈核酸產(chǎn)生任意切割，通過(guò)收集熒光信號(hào)即可達(dá)到檢測(cè)的目的。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，2018年Doudna團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種基于Cas12a的檢測(cè)系統(tǒng)，即DETECTR（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter），可對(duì)樣本中的微量DNA進(jìn)行快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)，利用該系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了人乳頭瘤病毒（HPV）檢測(cè)［44］。可視化檢測(cè)對(duì)于核酸檢測(cè)的廣泛應(yīng)用至關(guān)重要，同年張鋒團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了基于Cas13a的“SHERLOCKv2”（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter un-LOCKing Version 2），使用側(cè)流層吸試紙條可裸眼觀察顏色變化來(lái)判讀結(jié)果［45］。迄今為止，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一些基于CRISPR-Cas的方法來(lái)檢測(cè)和診斷傳染性和非傳染性疾病（如癌癥）［46-50］。筆者所在實(shí)驗(yàn)室將CRISPR-Cas12a結(jié)合RPA技術(shù)和核酸檢測(cè)試紙條用于布魯氏菌感染的檢測(cè)，該檢測(cè)方法的靈敏度高、特異性強(qiáng)，使布魯氏菌感染的現(xiàn)場(chǎng)核酸檢測(cè)成為可能。基于CRISPR的檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是不需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員，恒溫條件下即可完成感染病原體的核酸檢測(cè)，擺脫P(yáng)CR對(duì)變溫儀的依賴，將該方法與核酸檢測(cè)試紙條相結(jié)合，可用于患者的床旁檢測(cè)。

6 小結(jié)與展望

布魯氏菌培養(yǎng)方法雖然費(fèi)時(shí)費(fèi)力且陽(yáng)性率低，但對(duì)于那些已經(jīng)確診的患者進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，可以更好地指導(dǎo)臨床采取個(gè)性化治療手段，避免抗生素的亂用。血清學(xué)方法雖然缺乏特異性，但價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)單，在一些資源貧乏的偏遠(yuǎn)地區(qū)對(duì)于布魯氏菌病的診斷和篩查仍然是最佳的方法學(xué)選擇。任何形式的NAAT都比傳統(tǒng)培養(yǎng)更敏感，比血清學(xué)檢測(cè)更具特異性。鑒于實(shí)時(shí)熒光定量PCR、數(shù)字PCR和CRISPR等檢測(cè)技術(shù)的高靈敏性，陽(yáng)性檢測(cè)并不一定意味著活動(dòng)性感染，可能是在經(jīng)常暴露的健康人中檢測(cè)到微小的細(xì)菌分解物、非活性生物體DNA 或患者在治療成功后循環(huán)血液中存在的DNA 殘留物。因此，應(yīng)對(duì)NAAT所取得的結(jié)果進(jìn)行綜合分析，并考慮到所處的臨床和流行病學(xué)環(huán)境。M-RT-PCR檢測(cè)對(duì)布魯氏菌種類的鑒定和分型，取代了傳統(tǒng)的、費(fèi)力的和危險(xiǎn)的表型鑒定方法。通過(guò)qPCR和數(shù)字PCR對(duì)細(xì)菌載量進(jìn)行定量分析，有望在未來(lái)用于確定人類布魯氏菌病治愈的標(biāo)準(zhǔn)。

近年來(lái)，基于CRISPR 的核酸檢測(cè)技術(shù)在病原體的核酸檢測(cè)中展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用前景，通過(guò)與恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，已在多種病原體核酸檢測(cè)領(lǐng)域有研究報(bào)道，該方法效率高、操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，不需要昂貴的儀器和專業(yè)技術(shù)人員。CRISPR-Cas系統(tǒng)正在引領(lǐng)一場(chǎng)新的技術(shù)革命，尤其為衛(wèi)生條件相對(duì)較差、感染性疾病高發(fā)的發(fā)展中國(guó)家在診斷上帶來(lái)巨大的技術(shù)革命，為人類衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展、人民的生命健康作出了積極貢獻(xiàn)。