中藥干預上皮間質轉化逆轉非小細胞肺癌EGFR-TKIs耐藥的研究進展

李青青,竇琦璐,薛維偉,王瑞平

(1.南京中醫藥大學附屬醫院,江蘇 南京 210029;2.江蘇省中醫院,江蘇 南京 320106)

肺癌是目前全球最常見的惡性腫瘤之一。據統計,在男性患者中,肺癌無論是發病率還是病死率均居于癌癥中的第一位,而在女性患者中,其發病率和病死率分別居于第三位和第二位,是目前全球癌癥死亡的主要原因[1]。其中非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌中最常見的組織學類型,約占肺癌總數的80%～90%[2]。由于NSCLC發病具有隱匿性,早期無明顯癥狀,大多數患者被確診時已為晚期肺癌,遠期預后欠佳,5年生存率僅為23%[3]。目前,晚期NSCLC的傳統一線化療方案是以鉑類為基石的雙藥方案化療,但是近10年來,隨著靶向治療研究的不斷深入,驅動基因陽性的NSCLC患者在使用靶向藥物后,不僅為晚期NSCLC患者帶來優于傳統化療的生存獲益,也極大改善了晚期NSCLC患者的生活質量。目前表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)已成為表皮生長因子受體(EGFR)基因突變陽性的晚期NSCLC患者的一線治療方案[4]。但是大多數患者仍面臨腫瘤治療中不可避免的一個問題——耐藥性。目前耐藥的機制尚未完全明確,近來研究發現EGFR-TKIs耐藥與腫瘤細胞發生上皮間質轉化(EMT)密切相關,而且中藥能夠通過干預腫瘤細胞EMT以增強EGFR-TKIs敏感性。現將中藥干預上逆轉EGFR-TKIs耐藥的研究進展綜述如下,旨在為今后研究提供相關參考。

1 非小細胞肺癌EGFR-TKIs耐藥的機制

EGFR基因突變是晚期NSCLC患者中最常見的驅動基因突變,在中國與歐洲,分別約有38.4%和14.1%的NSCLC 患者觀察到EGFR突變[5]。其中最常見的 EGFR 突變是外顯子 19 缺失和外顯子 21 中的 L858R 點突變,他們共同占有臨床上高達90% 的EGFR突變[6]。這些EGFR 突變增加了EGFR-TKIs與受體之間的親和力,從而賦予了EGFR-TKIs對肺癌患者治療的敏感性。盡管EGFR-TKIs在肺癌治療中具有良好的治療效果,能夠延長患者的生存周期,提高患者的生活質量,但是大多數患者不可避免地會在治療1年內發生獲得性耐藥。目前,EGFR-TKIs耐藥相關機制尚不完全明確,研究多集中于以下:靶基因突變、旁路信號通路激活和組織學或表型轉化。

1.1靶基因突變 T790M基因突變是第一代和二代EGFR-TKIs中最常見的獲得性耐藥機制,大約50%～60%接受第一代和第二代EGFR TKIs治療的患者在進展時攜帶EGFR T790M突變[7]。T790M基因突變是EGFR 激酶域外顯子20中第790位的點突變,這種突變導致“守門人” T790M中蘇氨酸的位置被甲硫氨酸取代,進而導致構象變化,引起空間位阻阻礙,降低第一代和第二代EGFR-TKIs的結合活性[8]。此外,這種突變還增加了EGFR對 ATP 的親和力,使其對ATP的親和力恢復到更接近野生型EGFR水平,從而降低了三磷酸腺苷(ATP)競爭性EGFR-TKIs的療效[9]。T790M基因突變是目前唯一被驗證的EGFR-TKIs獲得性耐藥相關基因突變。此外,也有其他二次基因突變(如:T854A、L747S和D761Y等非T790M突變)被報告稱會使NSCLC對EGFR-TKIs的治療敏感性下降,但多為偶發情況報告,并不常見。

1.2旁路信號通路激活 通過激活旁路信號通路使腫瘤細胞生長和存活,其中最常見的旁路途徑是MET原癌基因擴增,約占EGFR TKIs獲得性耐藥的病例的5%[10]。間質上皮轉化因子(MET/c-Met)原癌基因擴增會激活ErbB3(EGFR 家族的成員)的磷酸化及下游磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路異常活化,在 EGFR-TKIs存在的前提下,“繞開” EGFR-TKIs提供旁路通路,從而導致 EGFR-TKIs耐藥[6]。此外BRAF突變、PIK3CA突變、KRAS突變、HER2擴增,PTEN丟失、NF-1丟失和CRKL擴增等也可造成EGFR-TKIS的獲得性耐藥。

1.3組織學或表型轉化 小部分患者在對EGFR-TKIs耐藥后,發生了EGFR突變型腺癌轉化為小細胞肺癌(SCLC)的組織學轉化[11],這些轉化的腫瘤顯示出類似于經典小細胞肺癌的分子特征,例如視網膜母細胞瘤蛋白(RB)活性和腫瘤抑制蛋白(TP53)活性的喪失。雖然腫瘤在完成轉化后仍保留了最初的EGFR突變,但EGFR表達急劇降低,表明這些腫瘤不再受EGFR信號驅動[12]。腫瘤細胞EMT的不當誘導導致腫瘤侵襲、轉移、耐藥性和干細胞特性。研究表明,細胞EMT中上皮細胞通過失去細胞極性和細胞間黏附,獲得侵襲和遷移特性而轉化為間充質干細胞,伴隨著抗凋亡信號的上調和分子標記蛋白表達的變化,即下調E-鈣黏蛋白的表達,上調波形蛋白、纖連蛋白和N-鈣黏蛋白的表達,導致對EGFR TKIs的獲得性耐藥[13]。同時也有相關報道稱,包括AXL、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TGF)-β、PDGFR、MED12、Notch-1和ZEB1內的幾種途徑和分子的激活與具有EMT特征的細胞中EGFR-TKIs耐藥性有關[14]。此外,也有研究發現細胞在微小RNA-200c(miR-200c)調控下能夠激活EMT通路,進而導致EGFR-TKIs的耐藥性[15]。

2 EMT在非小細胞肺癌EGFR-TKIs耐藥中的作用

EMT是上皮細胞轉化為間質細胞的一個復雜的細胞過程,在上皮間質轉化過程中,細胞失去其上皮特征、頂基極性、細胞間黏附復合物和上皮組織特異性的細胞骨架結構。同時,細胞獲得間質類型的細胞極性、單獨遷移的能力和侵襲能力[16]。EMT過程中隨著細胞間黏附蛋白和緊密連接喪失,導致上皮細胞之間彼此分離。同時,EMT過程中增強間質細胞標記物(如波形蛋白)的表達,并促進與細胞外基質(ECM)的附著和獲得間質細胞特征,如紡錘形細胞形態和肌動蛋白應激纖維的重組,從而獲得單獨遷移和侵入基底膜、血液和淋巴管壁的能力[17-18]。在大部分惡性上皮腫瘤如乳腺癌、肺癌中均可發現EMT的現象,且EMT的發生與腫瘤的浸潤、轉移及耐藥性密切相關。

Sequist等[19]對37例EGF-TKIs耐藥后NSCLC患者的腫瘤活檢進行了系統組織學分析后發現,其中有2例患者的活檢標本發現了EMT,且未發現其他耐藥機制。無獨有偶,Poh等[13]在臨床中對1例阿法替尼耐藥后患者的腫瘤標本進行檢測,未發現除了EMT以外的其他已知的獲得性耐藥機制。這表明EMT在EGF-TKIs耐藥過程中發揮著獨特的重要作用。Lee等[20]發現吉非替尼耐藥細胞株中E-鈣黏蛋白表達水平顯著下調,N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達水平上調,表明吉非替尼耐藥細胞株發生EMT。同時通過分析更多上皮標志物(包括 CLDN4、CLDN7、MUC1和TJP3)以及間質標志(Snail、Slug、Twist1、Twist2、ZEB1、ZEB2和纖連蛋白的mRNA)水平后,進一步證實了吉非替尼耐藥細胞株中EMT的發生。同時在后續的實驗中發現,長期停用吉非替尼后,隨著EMT的逆轉,肺癌細胞對吉非替尼的敏感性也在不斷恢復。此外,Weng等[21]報道,具有吉非替尼或奧希替尼獲得性耐藥的NSCLC細胞表現出E-鈣粘蛋白減少,波形蛋白和干細胞特性增加的EMT特征,且沒有任何EGFR二次突變,并能夠通過逆轉EMT恢復吉非替尼和奧希替尼的敏感性。這些都說明EMT在肺癌EGFR-TKIs耐藥中擔任了重要的角色,同時逆轉EMT可以恢復TKIs的敏感性。

3 中藥從EMT途徑逆轉EGFR-TKIs耐藥的研究進展

中醫藥治療腫瘤具有多途徑、多靶點的特點,基于腫瘤微環境多信號通路研究中醫藥復方干預EMT逆轉肺癌靶向治療耐藥,符合傳統醫學的整體觀念。

3.1中藥單體 Cheng等[22]研究發現,欖香烯與吉非替尼聯合作用于耐TKI肺腺癌A549和H1299細胞時,可顯著提高上皮標志物 E-鈣粘蛋白的表達水平,同時抑制間質標志物ZEB1、Snail 和 Twist及波形蛋白的表達,抑制癌細胞增殖、存活、侵襲和遷移,與吉非替尼單藥治療相比,兩者聯合治療能夠有效地干預EMT逆轉肺癌TKI治療耐藥。沈云飛等[23]通過觀察耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD細胞凋亡、增殖及侵襲能力和EMT相關蛋白表達情況,來探討苦參對PC9/ZD細胞EMT及吉非替尼藥物敏感性的影響,研究發現與對照組(不加藥物)及吉非替尼組相比,苦參聯合吉非替尼實驗組細胞中N-鈣黏蛋白及波形蛋白的表達被不同程度抑制,E-鈣黏蛋白的表達被上調,同時在苦參聯合吉非替尼組中PC9/ZD細胞侵襲率遠低于對照組及吉非替尼組,凋亡率與腺癌細胞增殖抑制率遠高于對照組及吉非替尼組。提示中藥苦參可能通過調控EMT這一過程實現逆轉吉非替尼的耐藥性。魏佳等[24]探究黃芪多糖逆轉吉非替尼獲得性耐藥肺腺癌細胞的作用,實驗中將吉非替尼單藥作用于對PC9/EMT細胞48 h后,通過CCK8實驗檢測其對腫瘤細胞增殖抑制率為40.4%,而黃芪多糖與吉非替尼兩藥共同作用于細胞48 h后,檢測其對腫瘤細胞增殖抑制率為51.0%。且兩藥聯用與單藥相比較后,發現兩藥聯用中的細胞上皮標志E-鈣黏附分子的蛋白和mRNA表達量明顯上升,作為細胞間質標志物波形蛋白的蛋白和mRNA表達量明顯下降。說明,黃芪多糖可通過抑制EMT來提高吉非替尼耐藥的敏感性。陳灝等[25]通過Western blot實驗探討姜黃素干預耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD細胞EMT過程的作用機制,實驗研究發現與親代耐藥細胞相比,經姜黃素處理后,耐吉非替尼肺腺癌細胞株的中P-AKT和P-MTOR呈現低表達狀態,波形蛋白表達下調、E-鈣黏附分子表達上調,由此可見,姜黃素通過阻斷P13K/AKT/mTOR信號通路及增強上皮標志蛋白表達,抑制間質標志蛋白表達,以改變耐吉非替尼肺腺癌細胞上皮間質化過程。呂昕等[26]以轉化生長因子-β(TGF-β1)誘導發生EMT肺腺癌H358細胞為研究對象,分別給予花蛇舌草乙醇提取物(EEHD)、吉非替尼及兩藥聯用后觀察48 h,觀察各組細胞株中細胞生長抑制率、凋亡率,E-鈣黏蛋白、EGFR、波形蛋白蛋白表達率,實驗發現各組均可不同程度上抑制H358細胞增殖,上調E-鈣黏蛋白表達水平,下調波形蛋白、EGFR蛋白表達水平,且兩藥聯合使用組的細胞生長抑制率、凋亡率及E-cadherin蛋白表達率顯著高于吉非替尼單藥組,而波形蛋白、EGFR蛋白表達率顯著低于吉非替尼單藥組。研究表明[26],EEHD可部分干預肺腺癌H358細胞EMT和腫瘤細胞的增殖,EEHD與吉非替尼兩者聯用具有協同增效作用,進而減少肺腺癌EMT所致吉非替尼耐藥的發生。

3.2中藥復方 羅楊等[27]從EMT角度出發,通過檢測肺腺癌H1975荷瘤小鼠移植瘤twist、fibronectin表達情況,探討除痰解毒方(廣木香、砂仁、黨參、白術、茯苓、姜半夏、厚樸、陳皮、浙貝母、薏苡仁、紅豆杉、三棱、莪術、威靈仙、仙鶴草、魚腥草和金蕎麥)逆轉肺癌吉非替尼耐藥機制,實驗中將建好的裸鼠模型隨機分為模型組,吉非替尼組,除痰解毒方高、中、低劑量組,吉非替尼聯合除痰解毒方中劑量組,治療并觀察2周后發現,除痰解毒方及聯合用藥組可不同程度地下調EMT相關蛋白twist和fibronectin及mRNA的表達,因此可以分析得出,除痰解毒方逆轉肺癌靶向藥物耐藥的機制可能與調控EMT相關蛋白twist和fibronectin的表達水平有關。李龍妹[28]使用扶正抗癌方(黃芪、太子參、白術、甘草、炒薏苡仁、山慈姑、白花蛇舌草、龍葵、石見穿、八月札、莪術)分別予以吉非替尼原發性耐A549細胞株和繼發性耐藥H1650細胞濃度為0,1,1.5,2 mg/mL的扶正抗癌方中藥煎劑處理,實驗研究發現隨著中藥濃度的增大,MET相關性蛋白N-鈣黏蛋白及波形蛋白表達水平隨之下調,從而提高H1650、A549 細胞對吉非替尼的敏感度,抑制其耐藥性。曾建昌等[29]觀察復方苦參注射液(苦參、白土苓)聯合奧希替尼干預后細胞活力、細胞侵襲能力、細胞凋亡狀況、P13K/AKT/mToR信號通路相關因子及EMT相關因子的表達,發現復方苦參注射液能夠抑制腫瘤細胞侵襲、增殖和EMT,促進腫瘤細胞凋亡,而且這一作用機制可能與P13K/AKT/mTOR激活具有相關性。

4 問題與展望

近些年來,肺癌EGFR-TKIs治療以其優于化療的療效性,低于化療的毒副反應,而越來越被人們所關注,廣泛的應用于臨床治療中。但是,EGFR-TKIs的獲得性耐藥是人們不得不面對的一個問題,而目前耐藥機制的研究主要集中在T790M突變、KRAS突變、c-Met原癌基因擴增等方面。但隨著近些年對耐藥機制研究的不斷深入,人們發現腫瘤細胞的EMT與EGFR-TKIs獲得性耐藥之間有著千絲萬縷的關系,而EMT的可逆轉性也讓我們看到了逆轉EGFR-TKIs耐藥的可能性。但是EMT介導EGFR-TKIs耐藥的作用機制呈現復雜且多樣性,目前尚未完全明確,仍有待進一步深入研究和探索。

多項研究表明,中藥與肺癌EGFR-TKIs聯合使用能夠抑制腫瘤細胞侵襲、增殖及EMT的發生,加快腫瘤細胞的凋亡,同時中藥與EGFR-TKIs聯合使用還具有協同增效的作用。但是也不可避免地存在一些問題,目前研究多為體外實驗研究,缺乏體內實驗研究及前瞻性、多中心、大樣本的臨床研究數據,且中藥研究多為中藥單體研究,其具體作用機制及作用靶點現在尚不得而知,中藥復方研究較少,且無統一治療標準,無法形成規范化治療標準。這些問題有待今后進一步研究探索。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。