林則徐戒煙方對地西泮自然戒斷小鼠的治療作用及初步機制研究

焦 玥 李 鵬 劉艷驕 趙小亮 劉 洋 李 濤 王志國 王丹巧

(1 中國中醫科學院醫學實驗中心,北京市中醫藥防治重大疾病基礎研究重點實驗室,北京,100700; 2 北京市海淀區玉淵潭社區衛生服務中心,北京,100363; 3 中國中醫科學院廣安門醫院心理睡眠科,北京,100032)

林則徐戒煙方(以下簡稱戒煙方),也稱為林文忠公戒煙方,來源于福州林則徐紀念館,是林則徐和名醫何其偉合作研制,以解清末鴉片泛濫之毒。道光十八年林則徐任湖廣總督時,即將該方上奏朝廷[3]。該方主方名“忌酸丸”,輔佐方名“補正丸”?！逗V奏稿》卷四中記載該方在湖廣地區“凡省城、漢鎮藥店,所配戒煙之藥,無家不有,無日不售”,并“有耆民婦女在路旁叩頭稱謝,據云其夫男久患煙癮,今幸服藥斷絕,身體漸強”。中國中醫科學院廣安門醫院劉艷驕教授[4]借鑒林則徐戒除鴉片的思路,采用戒煙方作為安眠藥物中藥替代治療的主要方劑,并提出安眠藥物依賴性失眠的中醫病因是“毒邪滯留,內生燥火”,病機為“毒邪上腦”,全方以西洋參、當歸、黃芪等扶正,黃連、天麻、柴胡、沉香等解毒,共奏“溫補脾腎,益氣升陽,滋陰平肝,治藥毒癮”之效,在臨床上收到良好的治療效果,形成規范化診療流程[5],但戒煙方的作用機制尚無研究。由于長期濫用藥物會使大腦產生適應性改變,主要表現為腦內多巴胺(DA)、γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(Glu)等與獎賞系統有關的神經遞質改變,神經營養因子釋放,突觸可塑性改變等。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路與藥物成癮引起的神經適應性和獎賞效應直接相關[6]。因此,本研究模擬臨床停藥過程,采用小鼠規律灌胃地西泮28 d后停止給藥的自然戒斷方法,觀察戒煙方對小鼠在戒斷3 d后發生的行為學變化、紋狀體內多種神經遞質的改變以及對腦源性神經營養因子(BDNF)、mTOR活性的影響,探討戒煙方治療地西泮自然戒斷的治療作用及其相關機制?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性KM小鼠40只,體質量20 g左右。購于北京華阜康生物科技股份有限公司,許可證編號:SCXK(京)2019-0008。所有動物飼養于獨立通氣籠具(461 mm×274 mm×229 mm),實驗室環境溫度為22 ℃左右,濕度為50%左右,提前喂養1周適應飼養環境,自由飲水和食用商業飼料。動物實驗倫理審批號:ERCCACMS21-2303-05。

1.1.2 藥物 地西泮片(山東信誼有限公司,國藥準字H37023039),戒煙方藥物組成:西洋參15 g、麩炒白術10 g、生黃芪10 g、柴胡15 g、當歸6 g、關黃柏12 g、木香6 g、陳皮6 g、升麻5 g、天麻6 g、甘草6 g、沉香6 g。中藥購自北京同仁堂有限公司。

1.1.3 試劑與儀器 DA(批號:BCBC7614V)、3,4二羥基苯乙酸(DOPAC,批號:0001364209)、5-羥色胺(5-HT,批號:091M1128V)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA,批號:046K1520)、氯化鉀(批號:080M0091V)、乙二胺四乙酸二鈉(批號:080M0013V)均為Sigma公司(美國)產品。辛烷磺酸鈉(批號:7876976)、磷酸二氫鈉(批號:2461229)、磷酸(批號:4103512)、四氫呋喃(批號:R141892)、甲醇(批號:R142188)、乙腈(批號:R142091)均為Dikma公司產品(北京迪科馬科技有限公司)。Glu(批號:060M01711V)、甘氨酸(Gly,批號:1394031V)、?；撬?Tau,批號:71K0130)、GABA(批號:124H0364)、鄰苯二甲醛(批號:BCBL2514V)、乙酸鈉(批號:5043R28V)均購于Alfa Aesar(China)Chemicals公司(美國)。BDNF抗體(批號:GR3319825-22)、mTOR抗體(批號:GR3356299-18)購自Abcom公司(英國),p-mTOR抗體(批號:28273-1-AP)購自Proteintech公司。電動組織研磨器(GINGKO公司,型號:G12402031),多管渦旋震蕩儀(TARGAIN,北京錦踏科技有限公司),Rotanta 460R離心機(Andreas Hettich GmbH&Co.KG,德國)。高效液相-電化學檢測系統:Sykam高效液相色譜儀,包括S2100溶劑輸送系統,S5200自動進樣器和Clarity色譜工作站[Sykam(賽卡姆)公司,德國]。Antec Decade Ⅱ SDC電化學檢測器,VT-03玻璃碳工作電極(直徑3 mm),原位銀/氯化銀參比電極,25 μm電極墊片,柱前連有ADF濾波器(0.05 Hz)和脈沖阻尼器(Antec Leyden BV公司,荷蘭)。Waters X Select@HSS T3色譜柱(2.5 μm,2.1 mm×50 mm)(Waters公司,美國)。高效液相-熒光檢測系統包括:Aglient 1260 InfinityⅡ高效液相色譜系統,包括自動進樣器、四元泵、柱溫箱、熒光檢測器和Openlab軟件。Aglient Eclipse AAA色譜柱(5 μm,4.6 mm×150 mm),以上均為Agilent科技有限公司產品(美國)。穩壓穩流電泳儀(型號:Powerpac HQ),垂直電泳槽(型號:MP3)、半干轉電轉印儀(型號:Trans-Blot SD)均為Bio-Rad公司產品(美國)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將40只小鼠稱量體質量后按照隨機數字表法分為5組:正常對照組、模型組、戒煙方低劑量組、戒煙方中劑量組、戒煙方高劑量組。正常對照組小鼠灌胃蒸餾水28 d。其余各組小鼠連續灌胃地西泮(2 mg/kg)28 d。

1.2.2 干預方法

1.2.2.1 林則徐戒煙方的制備方法 按照臨床每人每日用量折算小鼠每日使用的等效劑量。戒煙方藥材(西洋參另煎兌入)浸泡2 h后大火燒開,小火煎煮后提取2次。所有藥汁混合后濃縮,移入旋蒸儀旋轉蒸發至所需31.0 g/kg。分裝,-80 ℃保存。

1.2.2.2 給藥方法 造模后停藥3 d。在此期間,模型組和正常對照組灌胃蒸餾水;戒煙方低劑量組(7.8 g/kg)、戒煙方中劑量組(15.5 g/kg)、戒煙方高劑量組(31.0 g/kg)灌胃相應劑量的中藥。

1.2.3 檢測指標與方法

記錄每組小鼠每天總的飲食、飲水量。3 d后記錄每只小鼠體質量,進行行為學檢測。小鼠脫頸處死后剝離腦組織取紋狀體,精密稱取紋狀體質量,-80 ℃保存。

1.2.3.1 行為學分析 應用曠場實驗分析小鼠的行為學變化。將小鼠放入50 cm×50 cm的曠場中。底部平均分為25個正方形格子。將與曠場箱壁相連的方格或者區域稱為周圍格,不與反應箱壁連接的區域稱為中央格。每次將小鼠放正中格子中,觀察記錄5 min內小鼠穿過中央格和外周格的數量。穿過格子以小鼠半身以上進入格子記為1個。記錄小鼠直立和梳理的次數。直立以小鼠前肢全部離開地面記為1次。梳理以小鼠完成整套梳理毛發過程記為1次。每只小鼠記錄完畢后噴灑乙醇揮干以減少對隨后記錄動物的干擾。

1.2.3.2 高效液相-電化學方法檢測小鼠紋狀體中單胺類神經遞質的含量 將紋狀體加入適量冷生理鹽水用手持式勻漿器在冰上進行勻漿,取定量勻漿液加入3倍體積的1%甲酸-乙腈,震蕩3 min后離心(離心半徑97 mm),20 000×g,4 ℃,離心5 min。取上清液加入等體積1%高氯酸后重復上述步驟,以同樣條件再次離心取上清液。樣本適量稀釋后即進行檢測,避免反復凍融。流動相為水∶甲醇=90∶10(含0.74 mmol/L辛烷磺酸鈉、80 mmol/L二水合磷酸二氫鈉、0.027 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉和2 mmol/L氯化鉀),磷酸調pH=3.0,0.2 mL/min等度洗脫,柱溫35 ℃。所得數據根據稀釋倍數和組織質量進行濃度校正。檢測DA、DOPAC、HVA、5-HT、5-HIAA的含量。

1.2.3.3 高效液相-熒光法檢測小鼠紋狀體中氨基酸類神經遞質的含量 將紋狀體加入適量冷生理鹽水用手持式勻漿器在冰上進行勻漿。取定量勻漿液加入3倍乙腈,震蕩3 min后離心(離心半徑97 mm),20 000 g,4 ℃,離心5 min。取上清液以同樣條件再次離心。樣本適量稀釋后即進行檢測,避免反復凍融。流動相、衍生液配制等參見文獻[7]。二元梯度洗脫,流速0.8 mL/min;激發波長340 nm,發射波長455 nm。所得數據根據稀釋倍數和組織質量進行校正。檢測Glu、GABA、Tau、Gly含量。

1.2.3.4 Western blotting方法檢測紋狀體中BDNF及mTOR和p-mTOR蛋白表達 將紋狀體組織放入預冷的研缽中加入液氮進行快速研磨提取蛋白,BCA法測定蛋白濃度。Western blotting操作流程包括電泳、蛋白質的電轉移和膜封閉、抗原抗體反應及顯影,用IPP軟件對掃描圖像的目的條帶進行灰度分析?？贵w稀釋倍數1∶1 000。

2 結果

2.1 地西泮停藥3 d小鼠體質量、飲食、飲水量變化 小鼠灌胃28 d后,正常對照組與其余各組灌胃地西泮小鼠的平均體質量沒有差異。戒斷3 d后,每只小鼠的體質量按每日體質量減去戒斷前體質量得到的差值進行統計。與正常對照組比較,3 d后各組小鼠與戒斷前體質量增值明顯下降,差異有統計學意義(P<0.05),戒煙方低、中、高劑量組體質量增值與模型組比較有升高趨勢。連續觀察各組小鼠在這3 d內的平均飲食量和飲水量可以看到,模型組小鼠在第1天出現飲食量下降、飲水量增多的表現,在隨后2 d內逐漸恢復。戒煙方低、中、高劑量組對于飲食量降低有一定的改善作用。見圖1,表1。

圖1 戒斷3 d后各組小鼠的體質量增值(n=8)

2.2 各組小鼠行為學結果 戒斷3 d后進行曠場實驗,記錄小鼠穿過周圍格次數以及穿過中央格次數。與正常對照組比較,模型組小鼠穿過中央格(P<0.05)和周圍格數量均減少,小鼠表現出探索欲望下降,運動減少。戒斷3 d中給予戒煙方治療,對于周圍格運動的降低沒有明顯改善,但戒煙方高劑量組小鼠穿過中央格的數量顯著增加(P<0.05),說明戒煙方對于小鼠探索興趣和運動有一定的提升作用。戒煙方低、中、高劑量組對于小鼠直立次數的減少有增高趨勢,對于小鼠自我梳理次數減少沒有影響。見圖2。

圖2 戒煙方對地西泮自然戒斷小鼠行為學影響(n=8)

2.3 戒煙方各組對于地西泮自然戒斷后小鼠紋狀體內單胺類神經遞質的影響 與正常對照組比較,模型組中DA及其代謝產物DOPAC、HVA顯著降低(P<0.05或P<0.01),戒煙方對于DA的降低具有升高作用,戒煙方高劑量組顯著提高DA水平(P<0.05)。模型組5-HT也明顯降低(P<0.05),戒煙方高劑量組顯著提高了5-HT的含量(P<0.05),5-HT的代謝產物5-HIAA含量略有降低。以上結果說明,地西泮自然戒斷狀態下模型小鼠腦紋狀體中DA、5-HT及其部分代謝產物發生明顯變化,戒煙方對于DA、5-HT的下降有升高作用,而且沒有增加代謝產物含量,說明對腦內起到直接作用的DA和5-HT沒有快速降解,可以維持較高的腦內濃度。見表2。

2.4 戒煙方對于地西泮自然戒斷后小鼠紋狀體內氨基酸類神經遞質的影響 與正常對照組比較,模型組紋狀體中興奮性Glu水平降低,抑制性GABA水平升高趨勢,導致Glu/GABA比值明顯下降(P<0.05),戒煙方高劑量組可以明顯抑制Glu/GABA的下降(P<0.01)。模型組Tau水平明顯下降(P<0.05),戒煙方有升高Tau趨勢,但差異無統計學意義(P>0.05)。戒煙方對于紋狀體中Gly水平沒有明顯影響。以上結果說明,地西泮自然戒斷狀態下模型小鼠腦內已經出現興奮性和抑制性神經遞質失衡,戒煙方對于Glu/GABA失衡具有明顯的調節作用。見表3。

表3 戒煙方對于地西泮自然戒斷小鼠腦內氨基酸類神經遞質的影響

2.5 戒煙方對地西泮自然戒斷小鼠紋狀體p-mTOR、mTOR和BDNF蛋白表達的影響 與正常對照組比較,模型組p-mTOR/mTOR和BDNF表達明顯降低(P<0.05或P<0.01),戒煙方有提高p-mTOR/mTOR的作用(P<0.05)和增加BDNF表達的趨勢。見圖3。

3 討論

BZDs藥物主要通過作用于γ-氨基丁酸A型(GABAA)受體復合物的苯二氮類(BZD)受體起到鎮靜、安眠作用,但由于受體的非選擇性,長期使用容易造成藥物依賴,撤藥癥狀明顯。長期服用產生耐受性后,可在同品種之間存在交叉耐受和交叉依賴。目前,尚沒有藥物被推薦或批準用于治療BZDs藥物依賴或促進長期使用后的戒斷,主要以逐漸減量及對癥給藥為主,但藥物使用的結果差異很大,這使BZDs依賴已經成為困擾健康狀況的公共衛生問題和社會問題[8]。

中醫學認為藥物依賴多為“毒邪入腦”。所用中藥多為多靶點無成癮性藥物,在治療藥物依賴方面具有較大優勢。林則徐戒煙方由西洋參、生黃芪、當歸、柴胡、麩炒白術、關黃柏、木香、陳皮、升麻、天麻、沉香和甘草組成。方中西洋參、黃芪、當歸、甘草是歷代戒煙方中的常用藥物?，F代藥理研究認為中藥主要以靶標腦部DA能和Glu能系統,通過調節神經遞質的合成與釋放、影響突觸可塑性等功能調節腦內微環境穩態,起到“解毒”作用[9]。在我們的前期研究中,觀察地西泮給藥戒斷后紋狀體、下丘腦、皮層、中腦和海馬中的多種神經遞質發生改變。已知紋狀體是基底神經節環路信號的傳入及整合中心,接受來自皮層、下丘腦、中腦的信號傳入,經過局部環路再傳出到蒼白球或者黑質網狀部,參與藥物成癮的從初始暴露到復吸的所有階段[10]。

本研究中,小鼠在長期給予地西泮后戒斷3 d,發現明顯影響小鼠飲食飲水,造成其體質量增長低于正常小鼠;行為學檢測發現穿過中央格數量減少,直立探索次數降低,說明小鼠的探索及運動的欲望降低,出現類似焦慮、抑郁樣情緒變化,而戒煙方明顯改善了小鼠的一般狀態及運動和探索興趣,從整體上說明藥物的有效性。

本研究中,慢性給藥戒斷小鼠紋狀體DA、5-HT及其代謝產物DOPAC、HVA等模型組明顯降低。已知腦內多巴胺能神經系統的改變是藥物依賴的標志性特征,而5-HT與情緒改變密切相關。有研究表明,BZDs藥物引起的焦慮患者血液中DA、5-HT明顯降低。不同劑量的地西泮,短期和長期處理斑馬魚后可以引起5-HT、DA等多種神經遞質濃度隨時間發生改變,早期明顯升高,長期則引起部分神經遞質顯著下降,說明神經遞質在不同病理階段處于動態變化的過程[11]。戒煙方對于地西泮長期給藥引起的DA、5-HT降低有明顯的升高,而對于代謝產物的影響不明顯,說明戒煙方可能對于腦內DA、5-HT的生成有促進,或是對于其降解可能有抑制作用,從而使腦內神經遞質恢復且維持在較高水平,進而緩解藥物戒斷引起的不良反應。

BZDs通過結合和增強GABA受體發揮作用,本研究中,雖然沒有觀察長期給藥后GABA的改變,但是在戒斷3 d后,GABA含量仍然高于正常對照組,同時抑制性氨基酸Gly具有同樣趨勢變化,興奮性神經遞質Glu則相對正常對照組降低,Glu/GABA降低顯著,說明戒斷3 d后小鼠紋狀體中仍然以抑制性變化占據優勢,尤其是戒煙方高劑量組改善了紋狀體的抑制狀態,與行為學表現相符。已知Tau有明確的抗焦慮和抗抑郁作用,可以明顯提升急性或者慢性不可預知溫和應激(CUMS)致抑郁小鼠腦組織中DA、5-HT含量,降低單胺氧化酶活性,升高腦內BDNF含量[12]。Tau在模型小鼠腦中明顯降低。戒煙方則升高紋狀體中Tau含量,有益于改善小鼠的抑郁狀態。以上結果表明,戒煙方改善小鼠的運動和探索能力與調節紋狀體內多種神經遞質失衡有關。

長期灌胃地西泮的小鼠紋狀體出現BDNF表達降低、p-mTOR/mTOR降低的現象。甲基苯丙胺成癮者戒斷階段外周血中BDNF隨戒斷時間而逐漸降低,如果伴有抑郁癥狀則BDNF下降更多,而抑郁會明顯增加甲基苯丙胺復吸的概率[13]。

戒煙方在清末戒煙運動中發揮了重要作用,如今古方新用,在臨床治療安眠藥物依賴也取得了良好的治療效果。本研究中,我們以小鼠地西泮長期給藥后戒斷模擬安眠藥依賴,發現其改善小鼠行為的作用機制與調節腦內多種神經遞質穩態密切相關,由于受組織樣本量所限未進行神經遞質代謝酶等相關檢測,此部分工作進行將會繼續開展,以期更好地揭示戒煙方對于藥物依賴治療作用機制,為戒煙方臨床治療和藥理機制提供新的依據。

利益沖突聲明:無。