紅景天苷調控AMPK/Drp1信號通路對急性腦出血大鼠的神經功能的保護機制

陳瑞娟,鄭永先,湯 旺,關小容

(1. 中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院,海南 海口 570208;2. 中南大學湘雅二醫院老年醫學科,湖南 長沙 410000)

腦出血(intracerebral hemorrhage, ICH)是一種常見的嚴重腦血管疾病,約占所有中風的15%～20%,ICH是一種死亡率和發病率很高的疾病[1]。當ICH患者腦血管突然破裂后,血腫的形成和鄰近組織的機械損傷會導致顱內壓急劇升高,該損傷被認為是腦原發性損傷[2]。臨床上針對ICH后原發性腦損傷進行手術切除血腫很少會影響患者神經功能恢復[3],但紅細胞碎片和血液成分會引發ICH后繼發性腦損傷,導致炎癥反應、氧化應激、神經元凋亡、線粒體功能障礙和血腦屏障(blood brain barrier,BBB)破壞,進而嚴重影響患者神經功能[4]。近幾十年來,大多數實驗研究都集中在ICH繼發性損傷的機制上,以尋找新的ICH治療靶點[5]。在許多研究中都觀察到了ICH發生過程中伴隨著神經細胞凋亡[6],同時研究也證實神經元細胞凋亡是ICH的細胞基礎,也可能是ICH治療或控制的新靶點。近年來研究認為氧化應激產生的大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)和炎癥反應產生的炎癥因子與ICH密切相關,可誘導神經細胞凋亡[7]。

AMP激活蛋白激酶(AMPK)信號是線粒體分裂的調節因子之一。在能量缺乏的狀態下,AMPK的激活導致動力蛋白相關蛋白1(Drp1)在線粒體的定位增加,并進一步誘導線粒體分裂[8],由于AMPK在調節生長和代謝重編程中起著關鍵作用,它是能量穩態的中樞調節器[9]。已有研究表明,AMPK與線粒體功能有著密切的聯系,并影響著細胞凋亡[10]。更重要的是,AMPK介導的信號通路在各種心血管疾病中都有參與,并且作為介導神經元凋亡的重要角色被人們廣泛關注[11]。

紅景天苷(salidroside,Sal)治療的神經系統疾病有很多,如神經系統障礙、短暫性大腦中動脈閉塞(MCAO)模型和全腦缺血/再灌注(I/R)損傷,Sal已被證實具有抑制細胞凋亡的保護作用[12-13]。然而Sal是否能改善ICH后的神經損傷,甚至保護ICH中某些病理因素引起的損傷,目前尚不清楚。醒腦靜具有醒腦開竅通絡的作用,其主要成分包括梔子、冰片、郁金、麝香,已有研究證實醒腦靜對急性ICH神經損傷有一定的治療作用,因此我們選其作為陽性治療藥物。本研究擬通過構建大鼠急性ICH神經損傷模型,觀察Sal對急性ICH大鼠的神經功能影響及可能的作用機制,以期為Sal在急性ICH神經損傷治療中提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物 成年雄性SD大鼠共60只購自湘雅醫學院動物實驗中心(動物許可證號:44007200065141)。飼養環境:室溫25 ℃左右,相對濕度50%～60%,飼料由海南醫學院實驗動物中心提供,動物可自由飲水攝食。本項目動物相關實驗均遵循動物實驗倫理要求。

1.1.2藥物與試劑 Sal購自南京道斯夫(批號:110818,規格:20 mg,HPLC≥99%);AICAR購自美國MCE公司(規格:0.5 mg·g-1)醒腦靜注射液購自無錫濟民可信山河藥業公司(批號151107,10 mL/支);IL-6、TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒均購自碧云天生物技術公司;BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自大連美侖生物科技有限公司;MitoSOX Red試劑盒購自南京建成生物技術有限公司;GAPDH一抗(CRISPRPL01)、HRP標記的山羊抗鼠IgG(M5774)、山羊抗兔IgG(HPA008791)購自美國Sigma公司;Bcl-2(15071S)、Bax(41162S)、cleaved caspase-3(9661S)、AMPK(9158S)、Drp1(8570S)抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.1.3實驗儀器 多功能酶標儀(德國Leica公司);凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司);電泳設備(美國Beckma公司);電子分析天平(上海勤翔科技有限公司);麻醉機(上海勤翔科技有限公司);SC-2546 低溫高速離心機(美國Thermo Fisher公司);倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯Olympus有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1急性ICH神經損傷大鼠模型構建和實驗分組 參考改良 Rosenberg 法構建大鼠急性ICH模型[14]。大鼠麻醉前禁食12 h,腹腔注射3%戊巴比妥鈉(30 mg·kg-1)進行麻醉,眼球取血40 μL以備后續實驗。將大鼠的頭部進行固定,使用手術刀沿大鼠頭部中線縱向切開皮膚,取前囟點右側中線旁開3 mm、后1 mm處,而后使用鉆頭開一個0.5 mm小孔,使用微量注射儀將自體血注入大鼠尾狀核部位,注射完畢后進行縫合。選取造模成功大鼠進行后續實驗。將大鼠按照隨機原則分為假手術組(Sham)、模型組(Model)、Sal低、中、高(50、100、200 mg·kg-1)、AMPK激動劑組(AICAR),陽性藥組(醒腦靜注射液),每組各10只。于造模結束1 h后腹腔注射各劑量Sal,連續1周,AMPK激動劑組腹腔注射AICAR(200 mg·kg-1),陽性藥組尾靜脈注射醒腦靜注射液(10 mg·kg-1)。

1.2.2大鼠神經功能評分 Garcia試驗用于評價造模和各組大鼠神經功能缺損。Garcia評分法分數區間為3-18分,動物的神經行為學狀況和分數呈正相關。由兩位研究者參與實驗,采用雙盲法對各組小鼠進行評分和記錄,評分標準見Tab 1。

1.2.3大鼠腦含水量檢測 造模結束后處死大鼠,迅速切除大腦,然后分離左右腦半球和小腦半球。將大腦的不同部分快速稱量(濕重),然后放入烤箱中,在100 ℃下烘烤24 h,再稱量(干重)。含水量的計算公式為:(濕重-干重)/濕重×100%。

Tab 1 Neurological function score scale

1.2.4MitoSOX Red檢測ROS水平 使用MitoSOX Red Kit (Invitrogen, USA)測量線粒體超氧化物的產生。按照試劑盒的步驟,首先將腦組織的線粒體分離出來,20 μg線粒體在50 μL呼吸緩沖液中裝入96孔板。100 μL冰冷呼吸緩沖液中加入2 μL MitoSOX、5 μL antiycin A和4 μL ADP。在裝入Microplate Reader之前,在指定的孔中加入50 μmol·L-1salermide或1 μmol·L-1FeTCCP。在355 nm和590 nm處測量熒光強度的基礎水平,每隔5 min測量熒光強度。

1.2.5腦組織中ATP含量檢測 使用ATP檢測試劑盒檢測腦組織中ATP含量的變化,首先向組織中加入約100～200 μL的裂解液,然后使用玻璃勻漿漏斗進行勻漿。裂解結束后使用低溫離心機 4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min,離心結束后棄沉淀取上清液,按ATP含量檢測試劑盒說明配制ATP檢測工作液,加100 μL的ATP檢測工作液到待測孔板中,再加上20 μL不同組的上清液,最后使用化學發光儀(Luminometer)測定RLU值。

1.2.6腦組織中IL-6、TNF-α、IL-1β檢測 造模結束后,將大鼠斷頭處死,無菌操作取出大鼠的腦組織,使用預冷的PBS沖洗除去殘余血液,在冰上使用濾紙拭去殘留的PBS,然后將腦組織放置于液氮罐中保存備用。實驗時取組織塊準確稱其質量,使用眼科手術剪快速剪碎組織塊,按比例加入預冷的PBS,隨后將剪碎的組織放置于組織勻漿器充分勻漿,12 000 r·min-1離心10 min,離心結束后取上清,按試劑盒說明步驟進行相關炎癥因子水平檢測。

1.2.7TUNEL染色檢測腦組織神經細胞凋亡 從液氮罐中取出大鼠腦組織,使用多聚甲醛固定液進行固定,冰凍切片,將切片依次浸泡于二甲苯、無水乙醇、不同濃度梯度的乙醇中各5 min,PBS洗滌3次。加入蛋白酶K 溶液50 μL,置于37 ℃孵育30 min,PBS沖洗3次;滴加檸檬酸三鈉50 μL,室溫孵育4 min,PBS沖洗3 次;按照TUNEL試劑盒染色步驟進行染色,滴加TUNEL反應液37 ℃避光孵育60 min,PBS沖洗3次;加入POD轉換液,置于37 ℃孵育30 min,PBS沖洗3次,DAB顯色試劑盒顯色,PBS沖洗3次;放入蘇木精溶液中復染60 s,流水沖洗掉多余染液;放入1%鹽酸酒精溶液中進行分化,分化結束后再次流水沖洗;封片。結束后使用倒置熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.8Western blot檢測Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、AMPK、Drp1蛋白表達水平 BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測總蛋白濃度。通過15%SDS-PAGE分離蛋白質,并在200 mA和1 h條件下,將蛋白質轉移至PVDF膜。將膜在含有5%脫脂奶粉的TBST溶液中于室溫封閉1 h左右。將膜與Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、AMPK、Drp1抗體在4 ℃孵育過夜。用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次,每次10 min,在室溫下與山羊抗兔IgG一起孵育1 h。β-actin用作內參。最后,用ChemiQ4600min化學發光成像系統成像,ImageJ測定蛋白條帶的灰度值。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能比較實驗結果顯示,與Sham組相比,Model組大鼠的神經系統評分明顯降低,出現明顯腦水腫,神經功能下降;與Model組相比,Sal各劑量組、陽性藥組和AICAR組大鼠的神經系統評分明顯升高,腦水腫情況減輕,神經功能得到保護(Tab 2)。

2.2 各組大鼠腦組織ROS水平檢測情況與Sham組相比,Model組大鼠的腦組織ROS水平明顯升高(P<0.05);與Model組相比,Sal各劑量組、陽性藥組和AICAR組大鼠的腦組織ROS水平明顯降低(P<0.05)(Fig 1)。

Tab 2 Neurological function scores of rats

Fig 1 Brain water content of rats in each

2.3 各組大鼠腦組織中ATP含量檢測情況與Sham組相比,Model組大鼠的腦組織ATP含量明顯降低(P<0.05);與Model組相比,Sal各劑量組、陽性藥組和AICAR組大鼠的腦組織ATP含量明顯升高(P<0.05)(Fig 2)。

Fig 2 Comparison of ROS levels in brain tissue of rats

2.4 ELISA實驗檢測IL-6、TNF-α、IL-1β水平與Sham組相比,Model組大鼠的腦組織IL-6、TNF-α、IL-1β水平明顯升高;與Model組相比,Sal各劑量組、陽性藥組和AICAR組大鼠的腦組織IL-6、TNF-α、IL-1β水平明顯降低(Fig 3)。

Fig 3 Comparison of ATP levels in brain tissue of rats

2.5 TUNEL染色檢測各組神經細胞凋亡結果與Sham組相比,Model組大鼠的腦組織神經細胞凋亡明顯增多(P<0.01);與Model組相比,Sal各劑量組和AICAR組大鼠的腦組織神經細胞凋亡明顯減少(Fig 4)。

Fig 4 Comparison of IL-6, TNF-α and IL-1β levels

2.6 各組大鼠腦組織內相關蛋白表達變化與Sham組相比,Model組Bcl-2、p-AMPK/AMPK表達明顯下調,Bax、cleaved caspase-3、p-Drp1/Drp1蛋白表達明顯上調;與Model組相比,Sal各劑量治療組、陽性藥組和AICAR組Bcl-2、p-AMPK/AMPK蛋白表達明顯上調,Bax、cleaved caspase-3、p-Drp1/Drp1蛋白表達明顯下調(Fig 5)。

Fig 5 Comparison of neural cell apoptosis in brain tissue

3 討論

繼發性腦損傷主要是由于炎癥引起,可加重血腫附近的腦水腫。ICH后的腦水腫可導致不良后果,如嚴重的神經功能缺損、疝出,甚至死亡[15]。機體在清除血腫過程中會激活小膠質細胞,然而過度激活也會釋放炎癥因子、趨化因子、蛋白酶、ROS、血紅素加氧酶等多種毒性因子,對腦組織產生神經毒性[16]。已有研究表明,在ICH發生過程中有過量的ROS產生[17],過量的ROS會破壞細胞內氧化還原平衡進而造成神經細胞損傷,同時ROS的過量產生會導致NLRP3炎癥小體大量激活,特別是mtROS的產生,反過來大量的NLRP3激活又會增加mtROS水平,進而導致細胞凋亡。

Fig 6 Comparison of related protein expression in brain

Drp1通過調控多種下游蛋白改變線粒體膜極化從而調節mtROS水平,進而對線粒體內穩態和NLRP3炎癥小體激活產生顯著影響[17]。同時也有研究證實,AMPK活化有抑制Drp1的作用。在ICH期間,皮質神經元中p-AMPK的表達以時間依賴性的方式減少,結合AMPK與Drp1的相互作用,表明Drp1可能是ICH后的關鍵抗氧化因子。作為調控細胞凋亡的經典信號通路,Bcl-2/Bax/cleaved caspase-3凋亡信號通路也與包括神經系統疾病在內的許多疾病有關,同時研究表明Bcl-2/Bax蛋白在線粒體功能障礙介導的凋亡通路中均起到了重要作用。

在本次研究中,我們選用了Sal作為治療藥物,Sal提取于紅景天,紅景天是景天科植物,具有廣泛的藥理作用。首先我們通過神經系統評分和腦水腫檢測實驗證實了Sal具有明顯改善神經功能的作用,ICH發生后我們使用Sal進行治療,實驗結果發現大鼠腦水腫和神經細胞凋亡情況明顯減輕,隨后我們對Sal的作用機制進行了進一步探究。我們通過MitoSOX Red和ELISA實驗檢測了大鼠腦組織內的ROS水平和相關炎癥因子指標,實驗結果發現ICH發生后腦組織內ROS和IL-6、TNF-α、IL-1β水平顯著增高,但我們使用Sal治療后,能夠明顯逆轉ICH造成的氧化損傷和炎癥損傷以及ATP含量減少,TUNEL染色結果也顯示Sal能夠有效的抑制ICH導致的大鼠神經細胞凋亡。隨后我們發現ICH發生后大鼠神經細胞中的Bax、cleaved caspase-3、p-Drp1/Drp1高表達和Bcl-2、p-AMPK的低表達,Sal治療后可以逆轉。AMPK是調控能量穩態的重要激酶,在抗氧化應激中發揮了抗凋亡的作用。在抑制Drp1活化后,可以減少或ROS水平的變化,并減少線粒體不正常分裂,防止線粒體損傷。在本研究中,ICH后24 h左右,p-Drp1蛋白表達明顯下調,而Sal處理顯著降低了p-Drp1/Drp1蛋白表達水平,并對氧化損傷和炎癥因子釋放具有抑制作用。

綜上所述,Sal能夠有效保護急性ICH大鼠導致的神經功能損傷,其作用機制可能與調控AMPK/Drp1信號通路有關,本研究為急性ICH神經功能損傷早期臨床治療提供了理論依據。