二甲雙胍通過miR-129-5p緩解膿毒癥相關(guān)肺損傷

袁 媛, 劉金虹, 袁江漢, 周發(fā)春

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,重慶 400016;2.天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院藥劑科,天津醫(yī)科大學(xué)寶坻臨床學(xué)院,天津 301800)

膿毒癥是由宿主對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)所引起的危及生命的器官功能障礙,其死亡率可高達(dá)25%～30%[1]。膿毒癥發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜,包括炎癥失衡、免疫功能障礙、細(xì)胞自噬等[2]。膿毒癥伴隨的多器官功能障礙是重癥患者死亡的重要原因。盡管目前膿毒癥治療已取得較大進(jìn)展,但膿毒癥合并急性肺損傷(acute lung injury, ALI)患者的死亡率仍高達(dá)30%～40%[3],遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他有ALI因素的患者。促炎和抗炎細(xì)胞因子的相互作用和隨后的級(jí)聯(lián)激活引起的全身炎癥反應(yīng)失衡被認(rèn)為是ALI發(fā)病的關(guān)鍵。失衡的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致膿毒癥相關(guān)肺損傷,血管通透性增加,肺組織水腫、結(jié)構(gòu)破壞,從而引發(fā)功能障礙[4]。因此,研究膿毒癥相關(guān)肺損傷中有效的抗炎藥物治療具有重要意義。

MET因具有安全性高、價(jià)格低廉以及出色的降糖能力,被推薦為2型糖尿病( type 2 diabetes mellitus, T2DM)治療的首選用藥。除了降糖作用外,二甲雙胍還被證實(shí)具有抑炎作用。MET還可通過激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶(B protein kinase B, AKT)通路,抑制膿毒癥大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng),減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡達(dá)到腦保護(hù)作用[5]。

微小RNA(microRNAs, miRNA)是一類重要的非編碼小RNA,在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。miRNA已被證實(shí)參與膿毒癥調(diào)控,miR-129-5p作為miRNA一員被證實(shí)可減輕過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬和凋亡[6]。在膿毒癥小鼠模型中,miR-129-5p還可通過調(diào)節(jié)肺表面活性蛋白D(surfactant protein D, Sp-D)表達(dá)減輕膿毒癥引起的急性腸道功能損傷[7]。二甲雙胍已被證實(shí)可通過調(diào)節(jié)miRNA表達(dá),起到器官功能保護(hù)作用,在糖尿病視網(wǎng)膜血管病變中,MET可通過與miRNA的結(jié)合減緩疾病進(jìn)展,并可通過調(diào)節(jié)miR-138-5p表達(dá),參與炎癥調(diào)控,緩解肺損傷[8]。然而,MET在膿毒癥相關(guān)肺損傷中的作用是否與miR-129-5p相關(guān)尚未報(bào)道,本研究擬通過觀察MET對(duì)膿毒癥中miR-129-5p水平、炎性因子表達(dá)和肺損傷的影響,來初步判斷MET和miR-129-5p的關(guān)系及可能機(jī)制研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料小鼠肺泡巨噬細(xì)胞(mouse alveolar macrophages, MHS)購于美國(guó)ATCC公司,LPS(Sigma, 美國(guó)),MET(麥克林,上海),Lipofectamine 6000促轉(zhuǎn)劑、CCK-8試劑盒、RIPA裂解液、BCA試劑盒(碧云天,中國(guó)),miR-129-5p模擬物(mimic)、抑制劑(inhibitor)和陰性對(duì)照(NC)由上海吉瑪公司構(gòu)建,SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠,購于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,TRIzol試劑 (Ambion, 美國(guó)),cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Accurate, 中國(guó)) ,SYBR Green Master Mix (TaKaRa, 日本),ELISA檢測(cè)試劑盒(Thermo,美國(guó)),PI3K抗體(48184)、p-PI3K(12057)、AKT抗體(33224)以及p-AKT(13357)抗體均購自(SAB,美國(guó))、流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson, 美國(guó))、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天,中國(guó))。

1.2 細(xì)胞復(fù)蘇與造模MHS細(xì)胞加入培養(yǎng)基,置于孵箱培育。分3組:對(duì)照組,無LPS及MET處理;LPS組,加入LPS(100 μg·L-1);LPS+MET組,加入MET,培育2 h后,加入LPS,繼續(xù)培育。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染以2×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞接種于6孔板, 孵箱中培育,當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)70%～80% 時(shí),使用促轉(zhuǎn)劑轉(zhuǎn)染,孵育48 h, 收集用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 CCK-8檢測(cè)以3×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞接種于96孔板,24 h后,將細(xì)胞與不同濃度(1、2、3、4、5、6 μmol·L-1)MET一起孵育2 h,然后用或不用LPS繼續(xù)處理6 h,最后在每孔中加入CCK-8溶液,孵育2 h,450 nm處測(cè)量A值。計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)以4×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞接種于6孔板,貼壁24 h后,加入MET(4 μmol·L-1)孵育,2 h后加入LPS繼續(xù)處理6 h。干預(yù)結(jié)束后,同時(shí)收集培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞及貼壁細(xì)胞,其中貼壁細(xì)胞以0.25%胰酶(不含EDTA)消化變圓則終止。1 000 r·min-1離心5 min,洗滌2次,以500 μL Annexin V-PI結(jié)合液調(diào)至濃度1×109L-1單細(xì)胞懸液,加入5 μL Annexin V-FITC,混勻,后加入10 μL PI染色液混勻,室溫避光孵育20 min,冰浴上機(jī)待用。

1.6 動(dòng)物和造模SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠60只(鼠齡6～8周,體質(zhì)量為18～23 g),動(dòng)物使用許可證號(hào):SCXK-(渝)2018-0003。小鼠隨機(jī)分為3組(n=20)。盲腸結(jié)扎穿孔(Cecal ligation and puncture,CLP)手術(shù)組[9]:小鼠戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉,剃毛,消毒,沿腹中線垂直切開,找到盲腸,在其末端1/3處結(jié)扎,2 mm三棱針穿刺盲腸末端2孔,后還納。假手術(shù)(Sham)組:不進(jìn)行盲腸結(jié)扎穿孔;CLP+MET組:術(shù)前給予小鼠MET(200 mg·kg-1)腹腔內(nèi)注射,30 min后進(jìn)行造模。3組小鼠術(shù)后均進(jìn)行常規(guī)復(fù)蘇。

1.7 動(dòng)物取材造模成功24 h后行動(dòng)物取材,小鼠麻醉,眼球取血,離心取上清,采血后脫頸處死小鼠,手術(shù)分離肺組織,洗凈吸干水分,多聚甲醛固定。

1.8 肺組織HE染色固定備用的肺組織,經(jīng)乙醇梯度脫水,常規(guī)石蠟包埋切片,病理HE染色后,在低倍鏡下觀察各組小鼠肺組織的病理變化。

1.9 肺組織濕干比(W/D)左肺洗凈后用濾紙吸干,稱量濕重。然后置于80 ℃烤箱48 h至恒重后再次稱量干重,計(jì)算W/D值。

1.10 RT-qPCR檢測(cè)TRIzol法從肺組織和細(xì)胞中分離總RNA,cDNA逆轉(zhuǎn)錄。使用SYBR Green Master Mix在實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行RT-qPCR,U6為內(nèi)參,反應(yīng)體系10 μL,擴(kuò)增條件為:95 ℃預(yù)變性30 s,然后95℃變性5 s,60 ℃退火20 s,共40個(gè)循環(huán)。miRNA-129-5p引物序列為: 5′-GCGGTCTGGGC-3′(前引物),3′-CGGGTCTGGCG-5′(后引物)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。利用2-ΔΔCT公式計(jì)算miR-129-5p的表達(dá)水平。

1.11 ELISA實(shí)驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定細(xì)胞及小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量,實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按ELISA檢測(cè)試劑盒說明操作。測(cè)450 nm處A值,做標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算濃度。

1.12 Western blot檢測(cè)RIPA裂解液裂解肺組織和細(xì)胞,離心,取上清,BCA法檢測(cè)蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液,100 ℃孵育使蛋白變性,電泳、轉(zhuǎn)膜,室溫下封閉膜1.5 h后。加入配好的一抗,4 ℃孵育搖床過夜,TBST反復(fù)洗滌3次。然后將膜與二抗室溫下孵育1 h后,洗膜,顯影,ImageJ軟件通過灰度掃描分析蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 MET可增強(qiáng)細(xì)胞活力LPS處理后,MHS細(xì)胞的活力明顯降低,不同濃度MET處理(1、2、3、4、5、6 μmol·L-1)后的細(xì)胞活力沒有明顯變化。然而,MET干預(yù)后LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞模型其活力不同程度增強(qiáng),以4 μmol·L-1時(shí)最明顯。

2.2 MET下調(diào)LPS誘導(dǎo)的促炎因子表達(dá)LPS可以刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子,誘發(fā)炎癥反應(yīng)。將MHS細(xì)胞暴露于LPS,IL-6、TNF-α和IL-1β的表達(dá)增加,以6 h時(shí)最明顯(Fig 2)。然而,這些促炎因子在MET干預(yù)后被明顯抑制。

2.3 MET可抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡LPS干預(yù)后可見細(xì)胞凋亡明顯增加,而MET(4 μmol·L-1)干預(yù)后可逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

2.4 MET可逆轉(zhuǎn)LPS所致的miR-129-5p低表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的MHS細(xì)胞miR-129-5p的表達(dá)降低,以6h降低最明顯。而MET干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)miR-129-5p的表達(dá)可顯著升高。

2.5 下調(diào)miR-129-5p逆轉(zhuǎn)MET在細(xì)胞中的抗炎及細(xì)胞保護(hù)作用miRNA在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,課題組前期研究發(fā)現(xiàn),miR-129-5p在膿毒癥患者體內(nèi)表達(dá)呈低水平[10]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證,分別轉(zhuǎn)染miR-129-5p mimic和inhibitor。如Fig 5A所示,轉(zhuǎn)染后,miR-129-5p的表達(dá)顯著升高或降低,表明轉(zhuǎn)染成功。同時(shí)miR-129-5p inhibitor可促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá),miR-129-5p mimic則下調(diào)促炎因子的表達(dá)。且miR-129-5p inhibitor可逆轉(zhuǎn)MET的抗炎效應(yīng)。同樣,miR-129-5p水平可影響細(xì)胞活力,抑制miR-129-5p可逆轉(zhuǎn)MET對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。

2.6 MET可上調(diào)LPS干預(yù)后的PI3K/AKT信號(hào)通路各蛋白的水平如Fig 6所示,敲低miR-129-5p時(shí),p-PI3K、p-AKT的蛋白水平下調(diào)。MET干預(yù)后p-PI3K、p-AKT的蛋白水平升高。而下調(diào)miR-129-5p的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)MET對(duì)PI3K、AKT的磷酸化。

Fig 1 Viability of MHS cells after MET

Fig 2 LPS-induced inflammatory response down-regulated by

Fig 3 Cell apoptosis after MET **P<0.01 vs Control group; ##P<0.01 vs LPS group.

Fig 4 Expression of miR-129-5p after MET

Fig 5 Anti-inflammatory and cytoprotective effects of MET reversed by inhibition of

2.7 MET可減輕膿毒癥相關(guān)肺損傷,提高小鼠存活率如Fig 7A所示,MET可明顯提高小鼠存活率,并減輕其肺水腫。HE染色根據(jù)Smith評(píng)分進(jìn)行炎癥結(jié)果判讀[11],發(fā)現(xiàn)Sham組組織結(jié)構(gòu)清晰,肺泡及肺間質(zhì)未見滲出,無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);CLP組組織結(jié)構(gòu)不清,肺泡及間質(zhì)內(nèi)大量滲出,伴較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);MET干預(yù)后,肺泡及肺間質(zhì)滲出及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度較CLP組明顯減輕。

2.8 MET可減輕體內(nèi)膿毒癥誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),上調(diào)miR-129-5p的表達(dá)CLP小鼠中IL-6、TNF-α和IL-1β的水平上調(diào),miR-129-5p呈低表達(dá)。而MET干預(yù)后,促炎細(xì)胞因子被明顯抑制,miR-129-5p水平明顯上調(diào)。

2.9 MET可上調(diào)CLP小鼠體內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路各蛋白的水平與體外結(jié)果相似,CLP組PI3K、AKT蛋白磷酸化水平降低,與CLP組相比,CLP+Met組p-PI3K、p-AKT蛋白的水平顯著增加。

3 討論

膿毒癥具有高發(fā)病率、高死亡率及進(jìn)展迅速等特點(diǎn),其本質(zhì)是由感染引起的免疫反應(yīng)失衡,導(dǎo)致的多器官功能障礙。膿毒癥相關(guān)ALI發(fā)生率高達(dá)40%,臨床表現(xiàn)為呼吸窘迫及進(jìn)行性、頑固性低氧血癥,其病理特征為肺上皮及血管內(nèi)皮細(xì)胞的受損及大量炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)[12]。

MET可增強(qiáng)胰島素敏感性,研究表明,在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥中,MET通過抑制心肌Toll樣受體4(Toll-like recetor 4, TLR 4)活性,發(fā)揮心臟保護(hù)作用,并可緩解膿毒癥所致的肺損傷,其機(jī)制可能是通過抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)[13]。我們的研究結(jié)果提示,MET可以在體內(nèi)外模型中下調(diào)膿毒癥中促炎因子的水平,起到器官功能保護(hù)作用。

miR-129-5p作為非編碼RNA的一員,與多種正常或異常的病理生理過程密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道,miR-129-5p在膿毒癥小鼠中低表達(dá),通過調(diào)控miR-129-5p水平,可抑制炎癥反應(yīng),減輕肺損傷[14]。本課題前期研究發(fā)現(xiàn),在膿毒癥患者血清中,miR-129-5p水平顯著下調(diào),提示其可能參與調(diào)控膿毒癥進(jìn)程。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)LPS干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)miR-129-5p的表達(dá)水平降低,TNF-α、IL-6、IL-1β水平呈高表達(dá)伴隨細(xì)胞活力降低及凋亡增加。通過MET干預(yù)后細(xì)胞miR-129-5p表達(dá)增加,炎癥因子水平下調(diào),細(xì)胞活力增強(qiáng)。但敲低miR-129-5p可逆轉(zhuǎn)MET的積極作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證,我們建立了膿毒癥小鼠模型,發(fā)現(xiàn)CLP組小鼠肺組織充血水腫明顯并大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。且miR-129-5p的表達(dá)較對(duì)照組下調(diào),伴隨TNF-α、IL-6、IL-1β水平增高。MET干預(yù)則可減輕肺水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),并下調(diào)促炎因子的表達(dá)。從而起到肺保護(hù)作用,提高小鼠存活率。PI3K/AKT信號(hào)通路在膿毒癥中起關(guān)鍵作用[15],PIK3激活導(dǎo)致AKT磷酸化,促進(jìn)細(xì)胞抵抗炎癥和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷。通過Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),LPS誘導(dǎo)細(xì)胞中p-AKT、p-PI3K蛋白表達(dá)降低,而MET干預(yù)或過表達(dá)miR-129-5p可增加p-AKT、p-PI3K蛋白的表達(dá)水平。敲低miR-129-5p則呈現(xiàn)出相反的結(jié)果,且可逆轉(zhuǎn)MET的作用。同樣,在小鼠模型中,MET干預(yù)可上調(diào)AKT、PI3K蛋白磷酸化水平。上述結(jié)果表明,miR-129-5p在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,且MET可能通過上調(diào)miR-129-5p的表達(dá),激活PI3K/AKT通路,調(diào)控膿毒癥炎癥反應(yīng),減少細(xì)胞凋亡,緩解肺損傷。

Fig 6 Effect of MET on expression of PI3K, p-PI3K, AKT and

Fig 7 Effects of MET on survival rate and lung injury in sepsis

Fig 8 Effects of MET on expression of IL-1β, IL-6, TNF-α and miR-129-5p in serum of sepsis

Fig 9 Effect of PI3K, p-PI3K, AKT and p-AKT in lung tissue of septic mice after MET

綜上,MET可能通過激活miR-129-5p/PI3K/AKT軸來抑制炎癥反應(yīng),減少細(xì)胞凋亡,減輕膿毒癥相關(guān)肺損傷。