樺褐孔菌提取物介導LXRs信號通路調控肝纖維化

劉賽虎,竇佳藝,崔振宇,廉麗花,南極星,吳艷玲

(延邊大學藥學院,長白山天然藥物研究教育部重點實驗室,吉林 延吉 133002)

肝纖維化是由慢性肝損傷所致的可逆性病理改變,是發展成肝硬化甚至肝癌的一個必經階段[1]。肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSCs)的活化是肝纖維化發展過程中的標志現象[2]。在健康肝臟中,HSCs主要產生IV型膠原,構成正常肝臟的膠原特征。隨著持續性刺激損傷,HSCs轉化為肌成纖維細胞,表達α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA),產生大量膠原蛋白,如I型膠原(type Ⅰ collagen,collagen Ⅰ)以及纖維化肝臟特征的其他細胞外基質(extracellular matrix,ECM)成分[3]。ECM的降解與合成分別受基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)和組織基質金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMPs)調控,其比值是評價細胞外基質代謝動態平衡的關鍵[4]。此外,炎癥反應也是肝纖維化發展的核心因素之一。當肝臟暴露于各種危險信號時,炎癥小體會誘導促炎因子的分泌,如白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β),半胱天冬氨酸蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)和白介素-6(interleukin-6,IL-6)等,從而啟動并延續異常的傷口愈合反應[5]。因此,抑制HSCs的激活和炎癥反應可以作為預防和改善肝纖維化的重要策略。肝X受體(liver X receptors,LXRs)在脂質代謝的轉錄控制中起著核心作用,其激活會調節一系列參與膽固醇吸收、流出、運輸和排泄的基因表達[6]。本課題組前期研究發現,LXRs也參與了肝臟炎癥和纖維化的調節,為肝臟疾病的防治提供了新的潛在靶點[7]。樺褐孔菌(Inonotusobliquus)是多孔菌科,纖孔菌屬的一種藥食兩用真菌,傳統用于預防和治療糖尿病、胃腸道疾病及腫瘤等[8]。研究發現,樺褐孔菌的多糖組分能夠改善弓形蟲感染的小鼠肝損傷,另外對高脂飲食誘導的大鼠脂質紊亂起到保護作用[9-10]。此外,總三萜類化合物可以明顯減輕對乙酰氨基酚引起的急性肝損傷,對肝臟及其功能有一定的保護作用[11]。我們前期研究初步證明了樺褐孔菌乙醇提取物(Inonotusobliquusextract,IOE)的肝保護作用,但其對肝纖維化的改善作用和作用機制尚不明確[12]。目前,臨床上尚缺乏確實有效的肝纖維化治療藥物。因此,本研究通過圍繞IOE對HSCs的活化、ECM沉積和炎癥因子分泌的影響,討論其對肝臟的調控作用是否通過潛在的LXRs信號通路介導,從而探究其抗肝纖維化的潛力,為開發新型、有效的肝纖維化的治療藥物提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑樺褐孔菌采摘自黑龍江省伊春市林區;Silymarin(SIGMA,S0417);硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)(aladdin,T118452);MTT(Solarbio,M8180);ECL發光試劑盒(Tanon,180-5001);ALT(A001),AST(A002)(長春匯力);DMEM(C11965500 BT);胎牛血清(900-108);總RNA提取試劑盒(上海普洛麥格生物產品公司);Fasting一步法除基因組cDNA第一鏈合成預混試劑(TIANGEN);慶大霉素(Macklin,G6064)、噻孢霉素(biotopped);TGF-β(PeproTech);即用型快捷免疫組化MAXVision2HRP試劑盒(鼠/兔)(邁新生物技術,KIT-5920);Anti-α-SMA(bs-0189R);Anti-collagen I(bs-0578R);Anti-MMP13(ab75606);Anti-TIMP1(ab61224);Anti-IL-6(sc-57315);Anti-LXRα/β(sc-377260)。

1.2 實驗動物飼養雄性,C57BL/6小鼠,體質量(20±5)g,購于延邊大學動物實驗中心 [動物許可證: SYXK(吉)2020-0010]。小鼠飼養環境溫度為(22±2) ℃,相對濕度保持在50%～60%,給予正常標準化飼料,分籠飼養,自由飲水,實行每12 h光暗循環光照。本實驗沿用前期研究IOE給藥劑量,分別為100、300和500 mg·kg-1[12]。小鼠適應1周后,隨機分為7組,每組7只:正常組、TAA組、TAA+IOE低中高劑量組(100、300和500 mg·kg-1)、IOE單獨給藥組(500 mg·kg-1)以及TAA+水飛薊素(silymarin,100 mg·kg-1)陽性對照組。小鼠肝纖維化模型的建立:第1周,腹腔注射TAA溶液(100 mg·kg-1),一周2次;從第2～4周增加至200 mg·kg-1,一周3次,連續4周。同時,第2～4周,除正常組和TAA組外,其余各組小鼠每天灌胃給予IOE(100、300和500 mg·kg-1)和Silymarin(100 mg·kg-1)。至最后一次腹腔注射TAA 24 h后,對小鼠進行安樂死,收集血液和肝組織,部分肝組織浸泡在10%福爾馬林液中,用于后續組織病理學檢查;其余肝臟樣本保存在-80 ℃中備用。

1.3 儀器凈化工作臺(上海新范醫療器械有限公司);水平搖床、二氧化碳培養箱(Thermo scientific);迷你雙垂直電泳儀、凝膠成像分析儀(Bio-Rad);PCR擴增儀(Eppendorf);酶標儀(Bio Tek);石蠟切片機(德國徠卡公司);電子天平(奧豪斯儀器有限公司);BX53F熒光顯微鏡(Olympus)。

1.4 IOE的制備本實驗采用乙醇熱回流提取IOE。取樺褐孔菌菌核,置于干燥研缽中研磨成芝麻顆粒大小粉末。在50 ℃下干燥至恒重,稱取粉末50 g,以料液比1 ∶10加入體積分數為50%的乙醇溶液,浸泡24 h。在50 ℃溫度下提取1 h,收集濾液,藥渣重復上述步驟2次。合并3次濾液置于旋轉蒸發儀中,進行減壓濃縮得到浸膏。在真空條件下冷凍干燥成粉末,即為IOE,4 ℃保存。

1.5 血清生化指標檢測小鼠取血后靜置30 min,4 ℃離心得到血清。按照試劑盒說明書檢測小鼠血清中AST和ALT的水平。

1.6 小鼠肝臟組織病理學檢查小鼠肝臟組織固定于體積分數為10%的福爾馬林溶液。取出肝臟組織,流水沖洗過夜,乙醇梯度脫水,石蠟包埋,肝臟組織5 μm切片,經蘇木精-伊紅(HE)染色、天狼猩紅染色和α-SMA免疫組織化學染色后觀察肝臟組織病理學改變。

1.7 細胞培養大鼠HSCs為韓國生命工學研究院(韓國大田)Jung Joon Lee博士慷慨相贈。從-80 ℃超低溫冰箱中取出HSCs種子,在37 ℃水浴環境下快速解凍,待將要完全融化時,將細胞懸液緩慢加入到含有10%胎牛血清、100 U·L-1慶大霉素/噻孢霉素的DMEM培養基中,在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中進行傳代培養,細胞狀態良好進行后續實驗。

1.8 MTT取對數生長期HSCs,以1×104個/孔的細胞密度接種于96孔板中。設置不同濃度IOE給藥組(0～25 mg·L-1),每組6個復孔。孵育24 h后,向每孔中加入100 μL MTT溶液(5 g·L-1)。3 h后吸出孔內MTT溶液,加入100 μL DMSO,室溫搖勻至紫色晶體完全溶解。使用酶標儀在570 nm處測定吸光度值,計算細胞存活率。

1.9 細胞實驗方案HSCs接種于6孔板,培養24 h后,給予轉化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)10 μg·L-1刺激2 h。隨后,孵育IOE 6 h后收集各分組細胞,提取蛋白。

1.10 Western blot實驗采用RIPA裂解液提取肝臟組織和HSCs蛋白,BCA法測定蛋白濃度。制備等量的蛋白樣品進行Western blot檢測,以GAPDH為內參,分析蛋白相對含量。

1.11 RT-PCR按照上海普洛麥格總RNA提取試劑盒的說明書進行細胞組織的總RNA提取,并測定其含量后制備cDNA,取反轉錄產物進行RT-PCR。以GAPDH為內參,檢測每個樣品mRNA的相對表達。引物序列見Tab 1。

2 結果

2.1 IOE對TAA誘導小鼠血清生化指標和肝組織形態學改變的影響ALT和AST的酶活性反映體內肝臟損傷程度。如Fig 1A、B所示,與正常組相比,TAA組小鼠血清ALT和AST水平升高(P<0.01),而IOE可以呈劑量依賴性地降低血清ALT和AST水平(P<0.01),并且效果與Silymarin陽性對照組相比無差異。通過HE和天狼猩紅染色觀察小鼠肝臟組織病理學改變。結果如Fig 1C,D所示,正常組肝細胞形態正常,肝小葉排列整齊,以中央靜脈為中心呈放射狀排列,而TAA組中央靜脈區域周圍出現大量炎性細胞浸潤,肝細胞腫脹,紅色膠原纖維沉積,發生交聯增生。給予不同濃度IOE后,中央靜脈區附近炎性細胞明顯減少,紅色膠原纖維沉積明顯減少,肝組織病理學改變得到改善,并且效果與陽性對照藥物Silymarin相似。

Fig 1 Effects of IOE on serum transaminases and liver histomorphological changes induced by TAA in mice n=6)

Tab 1 The primer sequences for RT-PCR

以上結果說明,IOE可以有效抑制TAA誘導小鼠血清生化指標的升高,并改善其肝組織病理特征。

2.2 IOE減少TAA誘導的小鼠肝臟ECM和膠原的沉積如Fig 2A所示,與正常組相比,TAA組小鼠肝臟α-SMA和collagen Ⅰ的蛋白表達和TIMP-1/MMP13的相對比率明顯升高(P<0.01),然而IOE處理可以明顯下調α-SMA和collagen Ⅰ蛋白表達和TIMP-1/MMP13的蛋白比,并呈劑量依賴性(P<0.01)。同時,α-SMA的免疫組化實驗也印證了上述實驗結果。如Fig 2B所示,與正常組相比,TAA模型組小鼠肝臟組織中觀察到明顯α-SMA棕色陽性表達,而IOE給藥組和Silymarin陽性對照組小鼠肝臟組織中α-SMA棕色陽性表達明顯減少。

Fig 2 IOE reduced TAA-induced ECM and collagen deposition

以上結果表明,IOE能夠減少TAA誘導的小鼠肝臟中ECM和膠原的沉積,改善肝纖維化。

2.3 IOE對TAA誘導的小鼠炎癥因子及LXRα/β信號通路表達的影響如Fig 3A所示,與正常組相比,TAA組小鼠炎癥因子IL-6的蛋白表達明顯升高(P<0.01),而IOE處理可以呈劑量依賴性地降低IL-6的蛋白表達(P<0.01)。同時,如Fig 3A所示,與正常組相比,TAA組小鼠LXRα/β的蛋白表達明顯降低(P<0.01),而IOE可以呈劑量依賴的方式上調LXRα/β的蛋白表達(P<0.01),且中劑量(300 mg·kg-1)和高劑量(500 mg·kg-1)的效果與Silymarin陽性對照組相似。

Fig 3 Effects of IOE on expression of IL-6 and LXRα/β in TAA-induced mice n=6)

以上結果表明,IOE可以抑制肝纖維化過程中炎癥因子的分泌,更重要的是,IOE可以激活LXRα/β信號通路,調節肝纖維化。

2.4 IOE對HSCs存活率及活化HSCs中ECM沉積的影響如Fig 4A所示,IOE(0.5～2.5 mg·L-1)在24 h內對HSCs的細胞活力沒有影響,在5～25 mg·L-1劑量時對HSCs的細胞活力有輕微影響。 如Fig 4B所示,TGF-β刺激明顯增加了collagen Ⅰ的蛋白表達(P<0.01),而給予不同濃度IOE(5～25 mg·L-1)孵育6 h發現,IOE可以明顯降低α-SMA、collagen Ⅰ和TIMP-1/MMP13的蛋白比(P<0.01)。同時,RT-PCR實驗也印證了上述實驗結果。如Fig 4C所示,TGF-β刺激明顯升高了α-SMA、collagen Ⅰ和TIMP-1的mRNA水平(P<0.01),而給予不同濃度IOE(5～25 mg·L-1)孵育6 h發現,IOE可以明顯降低他們的mRNA水平(P<0.01)。

以上結果說明,IOE能夠調控活化的HSCs中ECM的合成與降解動態平衡,防止ECM和膠原蛋白過度沉積。

2.5 IOE對活化HSCs中炎癥因子及LXRα/β信號通路表達的影響如Fig 5A所示,TGF-β刺激明顯增加了Caspase-1的mRNA水平(P<0.01),而給予不同濃度IOE(5～25 mg·L-1)孵育6 h發現,IOE可以明顯降低Caspase-1表達(P<0.01)。同時,如Fig 5A所示,TGF-β刺激明顯降低了活化HSCs中IL-6和LXRα/β的蛋白表達(P<0.01),給予不同濃度IOE(5-25 mg·L-1)孵育6 h發現,IOE可以降低IL-6的蛋白表達,并能呈劑量依賴性升高LXRα/β的蛋白表達(P<0.01)。在Fig 5B細胞熒光雙染實驗結果也可以發現,與正常組相比,TGF-β刺激的HSCs中LXRα/β(綠色)熒光表達明顯降低,IL-6(紅色)熒光表達明顯升高。給予不同濃度IOE后,可呈劑量依賴性升高LXRα/β(綠色)熒光表達并減少IL-6(紅色)熒光表達。

以上結果說明,IOE能夠抑制活化HSCs中炎癥因子的分泌,并激活LXRα/β信號通路。

3 討論

肝纖維化是一種可逆的慢性肝損傷疾病,病毒性肝炎、代謝疾病、長期酗酒、非酒精性脂肪肝以及非酒精性脂肪性肝炎都可能誘發肝纖維化[13]。HSCs的活化推動肝纖維化的發展,其靜止狀態時主要功能為吸收和儲存維生素A。當肝臟受損時,HSCs被激活轉變為肌成纖維細胞,造成ECM過度沉積并伴隨炎癥反應發生[3]。因此,抑制HSCs的活化對于肝纖維化的預防和治療具有重大意義。本課題組前期研究表明,樺褐孔菌乙醇提取物可以降低CCl4誘導的小鼠血清中ALT和AST的升高,提示其具有肝保護功能[12]。因此,本研究通過圍繞調控ECM沉積、抑制HSCs活化和炎癥反應,在體內外模擬建立肝纖維化微環境,發現IOE可以介導激活LXRs信號通路,從而調控肝纖維化的進程。

Fig 4 Effects of IOE on survival rate of HSCs and ECM deposition in n=6)

肝纖維化伴隨著結締組織過度沉積,其機制是HSCs被激活轉化為肌成纖維細胞釋放ECM,例如α-SMA和collagen Ⅰ是纖維化的主要標志物。此外,ECM的合成與降解處于一種動態平衡的狀態,依賴于TIMPs及MMPs。MMPs可以降解ECM,而TIMPs可以與MMPs結合,從而抑制ECM降解,導致ECM的合成與沉積增加[4]。本研究發現,與正常組相比,TAA誘導的小鼠體內和TGF-β激活的HSCs中,α-SMA、collagen Ⅰ和TIMP-1的蛋白表達明顯上升,MMP13的蛋白表達明顯降低,提示發生ECM沉積,破壞ECM合成與降解平衡。IOE可以明顯降低α-SMA、collagen Ⅰ的蛋白表達,恢復TIMP-1與MMP13之間的動態平衡。這說明IOE可減少ECM沉積,維持其合成與降解的動態平衡,從而發揮改善肝纖維化的作用。

肝纖維化的發生和發展中,炎癥和先天免疫系統的激活會導致HSCs激活。在肝損傷的早期階段,細胞死亡引發的炎癥有助于細胞碎片的清除,促進肝再生,確保急性肝損傷后肝結構和功能的恢復。然而,一旦刺激持續產生,就會誘發慢性炎癥和進行性肝纖維化[14]。研究發現,炎癥細胞因子如IL-1β、TNF-α等趨化因子以及TLR通路也參與肝纖維化的調控,在肝纖維化的進展中也起著重要作用[15]。本研究發現,與正常組相比,TAA誘導的小鼠體內和TGF-β激活的HSCs中,炎癥因子如IL-6和Caspase-1表達明顯升高,而給予IOE后炎癥因子表達明顯降低。以上結果提示,IOE可以抑制肝纖維化過程中的炎癥反應,或許是其改善肝纖維化的另一重要策略。

LXRs是參與調控肝臟疾病的重要靶點。有研究表明,LXR-/-動物暴露于四氯化碳或蛋氨酸膽堿缺乏的飲食中會導致α-SMA和膠原比例面積增加,與野生型小鼠相比肝纖維化加劇。同時,LXR-/-星狀細胞表現出纖維化基因的表達被啟動激活,炎癥介質水平增加[16]。這表明LXR配體在抑制肝星狀細胞活化標志物和小鼠肝纖維化中起關鍵作用。如預期相同,LXRs可以調節ECM沉積和肝臟炎癥反應[17]。本研究發現,與正常組相比,TAA誘導的小鼠體內和TGF-β激活的HSCs中LXRα/β的蛋白表達明顯降低,而給予IOE可以明顯升高LXRα/β的蛋白表達。由此可以說明,IOE可能是通過激活LXRα/β緩解肝纖維化發生時的ECM沉積和炎癥反應,從而逆轉其發生與發展。

綜上所述,IOE改善TAA誘導的血清轉氨酶升高、肝臟組織病理學變化,抑制ECM沉積和炎癥反應,并激活LXRα/β受體,改善小鼠肝纖維化發生發展。同時,IOE也可以減少活化HSCs中ECM沉積和炎癥因子分泌,激活LXRα/β信號通路,從而抑制HSCs活化。