硼替佐米聯(lián)合PLK1抑制劑處理腫瘤細(xì)胞A549、HeLa對其增殖影響

胡 玲,王 英,蔣斌元,胡錦躍

(1. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院,重慶 402160;2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154000;3.南華大學(xué)附屬長沙中心醫(yī)院,湖南 長沙 410004)

世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)發(fā)布的2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)中預(yù)估了全球185個(gè)國家36種癌癥類型的最新發(fā)病率、死亡率情況,以及癌癥發(fā)展趨勢。數(shù)據(jù)顯示,2020年全球新發(fā)癌癥病例1 929萬例,其中男性1006萬例,女性923萬例;2020年全球癌癥死亡病例996萬例,其中男性553萬例,女性443萬例[1]。

Polo樣激酶(polo-like kinases, PLKs)是一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸激酶家族,參與細(xì)胞凋亡周期進(jìn)展、中心粒的復(fù)制、有絲分裂、細(xì)胞凋亡動力學(xué)以及DNA損傷反應(yīng)的調(diào)節(jié)[2]。抑制PLKs功能會導(dǎo)致細(xì)胞周期阻止停滯于G2/M期,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]。PLK1高表達(dá)于快速增殖的組織,特別是基因組不穩(wěn)定的腫瘤組織,PLK1被認(rèn)為是癌癥治療的靶點(diǎn)之一[4]。目前,已有多種針對惡性腫瘤治療的PLK1抑制劑在進(jìn)行臨床II-Ⅲ期試驗(yàn)[5-6]。

硼替佐米(bortezomib,PS341) 是一種可逆性和選擇性的蛋白酶體抑制劑,通過靶向蘇氨酸殘基有效抑制20S蛋白酶體(Ki=0.6 nm),抑制蛋白酶體的功能會擾亂蛋白代謝導(dǎo)致泛素化蛋白的快速積累,當(dāng)代謝壓力無法修復(fù)將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。PS341在治療血液腫瘤方面取得了巨大的成就,研究者們對其治療實(shí)體瘤方面的表現(xiàn)同樣關(guān)注并進(jìn)行了大量的探索[7]。

不同藥理機(jī)制的小分子化合物聯(lián)合使用是一種提高抗腫瘤藥物的治療效果的化療策略[8],我們在探索PLK1抑制劑與蛋白酶體抑制劑聯(lián)合使用時(shí)發(fā)現(xiàn)PLK1抑制劑與低濃度PS341共同處理腫瘤細(xì)胞A549、HeLa后,PLK1抑制劑對腫瘤增殖抑制的效果明顯減弱,提示PLK1抑制劑與PS341的聯(lián)合使用可能需要注意藥物濃度等相關(guān)細(xì)節(jié)。因此,本研究針對此現(xiàn)象開展了以下實(shí)驗(yàn),旨在明確PS341削弱PLK1抑制劑對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制,探索相關(guān)的分子機(jī)制,為相關(guān)藥物的臨床推廣和應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料PLK1抑制劑GW843682X、BI2536、蛋白酶體抑制劑PS341購買自美國MCE (MedChemExpress)公司,CCK-8試劑購自索萊寶科技有限公司,PI、RNAse購買嘉美生物技術(shù)有限公司,胎牛血清(FBS)購買自杭州四季青生物公司、DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司,0.25%胰蛋白酶(含EDTA)、鏈霉素、青霉素購自美國Biological Iudustries公司,PLK1抗體、兔二抗體購自美國 Cell signaling technology公司, Cyclin A2、Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E1、CDK1、GAPDH、鼠二抗均購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞HeLa和肺癌細(xì)胞A549購自美國ATCC。細(xì)胞用含1%雙抗和10% FBS的DMEM培養(yǎng)基,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組PLK1抑制劑對腫瘤的增殖影響實(shí)驗(yàn)分11組:陰性對照(NC)組,GW843682X(GW)組(0.1、0.25、0.5、0.75、1 μmol·L-1)及BI2536(BI)組(10、25、50、75、100 nmol·L-1)。

PS341(PS)對PLK1抑制劑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞抑制的影響實(shí)驗(yàn)13組:陰性對照(NC)組、GW 1 μmol·L-1、GW 1 μmol·L-1+PS 10 nmol·L-1、 GW 1 μmol·L-1+PS 20 nmol·L-1、GW 1 μmol·L-1+PS 30 nmol·L-1, GW 1 μmol·L-1+PS 50 nmol·L-1、 GW 1 μmol·L-1+PS 100 nmol·L-1、BI 100nmol·L-1、BI 100nmol·L-1+PS10 nmol·L-1、BI 100 nmol·L-1+PS 20 nmol·L-1、BI100 nmol·L-1+PS 30 nmol·L-1、BI100 nmol·L-1+PS 50 nmol·L-1、BI100 nmol·L-1+ PS 100 nmol·L-1。

細(xì)胞形態(tài)學(xué)及蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)分6組:分別為NC、PS 20 nmol·L-1、 GW1 μmol·L-1、 GW 1 μmol·L-1+PS 20 nmol·L-1、BI 100 nmol·L-1、BI 100 nmol·L-1+PS 20 nmol·L-1。

細(xì)胞周期檢測實(shí)驗(yàn)分為10組:分別為NC、PS 20 nmol·L-1、GW 1 μmol·L-1、GW 1 μmol·L-1+PS 10 nmol·L-1、GW 1 μmol·L-1+PS 20 nmol·L-1、GW 1 μmol·L-1+PS 30 nmol·L-1,、BI 100 nmol·L-1、BI 100 nmol·L-1+PS 10 nmol·L-1、BI 100 nmol·L-1+PS 20 nmol·L-1、BI 100 nmol·L-1+PS 30 nmol·L-1。

1.4 CCK-8檢測細(xì)胞活性收集對數(shù)生長期的A549、HeLa細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107L-1,每孔100 μL接種于96孔板中,37 ℃,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將NC組細(xì)胞培養(yǎng)液更換為完全培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組更換含對應(yīng)藥物的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后,去上清,每孔加入 90 μL DMEM培養(yǎng)基和 10 μL CCK-8試劑,37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h后,酶標(biāo)儀(BioTek)測定波長為450 nm的吸光度(A)值,平行重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化使用倒置光學(xué)顯微鏡(Leica)觀察拍攝PS341對PLK1抑制劑誘導(dǎo)A549、HeLa細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的變化制備A549、HeLa細(xì)胞懸液,分別在12孔板每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞,貼壁后,按照實(shí)驗(yàn)分組加入含有對應(yīng)藥物的混合培基,24 h后收集細(xì)胞,用PI染色法檢測細(xì)胞周期。具體步驟為:消化細(xì)胞,PBS洗2遍,細(xì)胞用300 μL的PBS吹勻,再加入700 μL的已預(yù)冷的無水乙醇,4 ℃固定過夜,PBS洗2遍,加入PI 5 μL,RNase A 2 μL,輕輕混勻,室溫避光30 min,上流式細(xì)胞儀(BD Accuri C6)檢測。平行重復(fù)3次。

1.7 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接種于24孔板中,按照“1.3”分組處理24 h,收集細(xì)胞,用裂解液裂解收集蛋白。SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜,BSA室溫封閉1 h,加入一抗、4 ℃過夜,二抗室溫1.5 h,加入發(fā)光液顯影,蛋白條帶進(jìn)行掃描與分析。

2 結(jié)果

2.1 PLK1抑制劑對腫瘤的抑制作用采用CCK-8方法檢測PLK1抑制劑GW843682X、BI2536不同濃度處理A549細(xì)胞、HeLa細(xì)胞48 h后的細(xì)胞存活情況。與NC組相比,GW843682X在濃度0.25、0.5、0.75、1 μmol·L-1時(shí)明顯抑制A549細(xì)胞的增殖(Fig 1A),BI2536在濃度10、25、50、75、100 nmol·L-1時(shí)明顯抑制A549細(xì)胞的增殖(Fig 1A);與NC組相比,GW843682X在濃度0. 5、0.75、1 μmol·L-1時(shí)明顯抑制HeLa細(xì)胞的增殖(Fig 1B),BI2536在濃度25、50、75、100時(shí)明顯抑制A549細(xì)胞的增殖(Fig 1B)。為后續(xù)研究的目的,我們將GW843682X處理細(xì)胞濃度定在1 μmol·L-1,BI2536處理細(xì)胞濃度定在100 nmol·L-1,保證PLK1抑制劑的對細(xì)胞的抑制效果。

2.2 PS341對PLK1抑制劑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞抑制率的影響A549、HeLa細(xì)胞采用GW、BI單獨(dú)處理以及聯(lián)合不同濃度的PS341處理48 h之后, CCK-8結(jié)果發(fā)現(xiàn)(Fig 2),與GW 1 μmol·L-1組的OD值相比, 20 nmol·L-1PS341和1 μmol·L-1GW組合處理組的OD值明顯增加,BI組結(jié)果與GW組結(jié)果一致,表明PLK1抑制劑聯(lián)合低濃度PS341處理對腫瘤的增殖抑制有明顯削弱的影響。

Fig 1 Effect of PLK1 inhibitors on proliferation of A549 and HeLa cells

2.3 PS341對PLK1抑制劑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響為了解PS341對PLK1抑制劑誘導(dǎo)A549、HeLa細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響,采用倒置光學(xué)顯微鏡觀察(Fig 3A)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白組比較,GW 1 μmol·L-1以及BI 100 nmol·L-1處理A549、HeLa細(xì)胞,24 h后觀察,細(xì)胞變圓貼壁性減弱,不完全貼壁細(xì)胞增加,然而聯(lián)合20 nmol·L-1的PS341的實(shí)驗(yàn)組,貼壁細(xì)胞明顯增多(Fig 3B,C)。

2.4 PS341對PLK1抑制劑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯的影響采用流式細(xì)胞術(shù)測試分組處理A549、HeLa細(xì)胞24 h后,細(xì)胞周期變化情況(Fig 4A-D),結(jié)果表示,與NC組比較,GW 1 μmol·L-1與BI 100 nmol·L-1組,細(xì)胞阻滯在G2/M期的數(shù)目大幅增加;與GW 1 μmol·L-1組,BI 100 nmol·L-1組相比,GW/BI聯(lián)合PS341實(shí)驗(yàn)組G2/M期阻滯數(shù)目明顯下降,其中聯(lián)合PS341 20 nmol·L-1效果最明顯,P<0.01(Fig 4E,F);表明低濃度PS341具有逆轉(zhuǎn)PLK1抑制劑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞。

2.5 PS341對PLK1抑制劑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期蛋白的變化細(xì)胞的復(fù)制增殖與細(xì)胞周期密切相關(guān),Cyclin家族蛋白是參與調(diào)控細(xì)胞周期的主要蛋白[9],Cyclin A在S期交界處含量到最大值,穩(wěn)定維持到G2期,進(jìn)入有絲分裂中期時(shí)迅速被蛋白酶體降解[10], Cyclin B從G1晚期開始表達(dá)積累,到G2期后期達(dá)到最大值并維持到M期中期,然后降解。CDK1/Cyclin B復(fù)合物是G2/M期過渡的主要調(diào)節(jié)因子,在M期具有最大活性[11]。Cyclin D 作為G1到S期轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,在細(xì)胞周期中持續(xù)表達(dá),Cyclin D1的過表達(dá)會導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生[12]。Cyclin E則在M期的晚期開始表達(dá)并逐漸積累,G1晚期含量達(dá)到最大值,隨后的泛素依賴性降解有助于S期的有序進(jìn)展,在G2晚期其含量降到最小值[13]。各組藥物處理A549和HeLa細(xì)胞24 h后,Western blot檢測細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果顯示(Fig 5):PS341的加入上調(diào)CyclinE1,下調(diào)Cyclin A2、CDK1、CyclinD1和PLK1。

Fig 2 Effect of PS341 on tumor cell inhibition induced by PLK1 inhibitor

3 討論

腫瘤細(xì)胞中PLK1活性增加,抑制PLK1可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯抑制增殖,進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞凋亡,是抗腫瘤藥物開發(fā)的靶點(diǎn)之一。BI2536、GW843682X是一類ATP競爭性的PLK1抑制劑, 與PLK1的激酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合并抑制其活性,擾亂有絲分裂進(jìn)程,導(dǎo)致異常染色體的形成及細(xì)胞周期紊亂[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn),有效濃度的BI2536和GW843682X可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,且抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果呈劑量依賴性,但與低濃度PS341聯(lián)合使用后對腫瘤增殖的抑制大幅削弱,具體機(jī)制還有待探索。

Fig 3 Effect of PS341 on tumor cell morphology induced by PLK1 inhibitor

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白代謝的關(guān)鍵機(jī)制,可清除未折疊和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),過度抑制泛素-蛋白酶系統(tǒng)可誘發(fā)嚴(yán)重的蛋白代謝障礙并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。以泛素-蛋白酶體系統(tǒng)為靶點(diǎn)治療惡性腫瘤的小分子抑制劑一直受到研究者的關(guān)注,PS341是第一個(gè)也是最成功的治療多發(fā)性骨髓瘤等血液系統(tǒng)惡性腫瘤的臨床主要用藥,主要是通過引起細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生抗腫瘤作用[16],其在實(shí)體瘤中應(yīng)用的相關(guān)探索也一直在進(jìn)行。

我們最初為了探索不同分子機(jī)制藥物的聯(lián)合使用,將PLK1抑制劑和蛋白酶體抑制劑PS341組合進(jìn)行了初步嘗試,發(fā)現(xiàn)低濃度PS341明顯削弱了PLK1抑制劑對A549細(xì)胞、HeLa細(xì)胞的增殖抑制及周期阻止效果,提示PLK1抑制劑與蛋白酶體抑制劑的聯(lián)合使用可能存在藥效減弱的風(fēng)險(xiǎn)。為探索相關(guān)分子機(jī)制,我們將研究目標(biāo)鎖定在細(xì)胞周期相關(guān)蛋白及細(xì)胞周期依賴性激酶,檢測后發(fā)現(xiàn)加入PS341可明顯增加Cyclin E1的表達(dá),且PS341處理細(xì)胞后G1期細(xì)胞明顯增加。鑒于Cyclin E1可在G1進(jìn)入S期的階段發(fā)揮功能且Cyclin E1的表達(dá)增加會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展[13], 我們推測Cyclin E1的異常累積是引起腫瘤細(xì)胞抵抗PLK1抑制劑的主要原因,并計(jì)劃開展后續(xù)研究。

綜上所述,低濃度的PS341對PLK1抑制劑有拮抗作用,導(dǎo)致PLK1抑制劑誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞G2/M期阻滯減少,抑制增殖能力減弱,我們認(rèn)為PLK1抑制劑與低濃度蛋白酶體抑制劑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)可能會降低療效,并建議兩者的治療應(yīng)用可能需要考慮PLK1抑制劑藥效減弱的風(fēng)險(xiǎn)。

Fig 4 Effect of PS341 on tumor cell cycle induced by PLK1 inhibitors detected by flow cytometry

Fig 5 Effect of PS341 on tumor cyclin induced by