ω-3 多不飽和脂肪酸促進1型糖尿病模型小鼠胰島β細胞再生的作用研究

邢朝鳳,唐敏怡,徐綺華,張宗猛,封文斌,穆云萍,李芳紅,趙子建

(廣東工業大學生物醫藥學院,廣東 廣州 510006)

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)主要是由自身免疫T淋巴細胞介導胰島β細胞破壞,導致胰島素分泌嚴重不足引起[1]。目前,T1DM治療以終身每日注射重組胰島素為主,重組胰島素的應用為T1DM患者的治療做出了巨大的貢獻,能夠大幅延長患者的生命。然而,注射外源性胰島素時常發生嚴重的低血糖,而且T1DM患者也容易出現并發癥,如視網膜病變、神經病變和心血管疾病。但是目前還無有效的手段能夠阻斷自身免疫進程對胰島的攻擊,以及延緩早期患者疾病的進展。大量研究嘗試利用特異的單克隆抗體作為自身免疫的拮抗藥物[2-3],以干預自身免疫系統攻擊胰島的進程。但是這類藥物非常昂貴,而且有各種副作用,不適合長期應用于T1DM治療。

自Edmonton Protocol 10公布以來,異體胰島移植曾經為T1DM患者能夠擺脫終身胰島素治療,根治糖尿病帶來很大的希望。2000年的研究揭示了使用胰島移植替代胰島素療法治療T1DM的潛力,7名受試患者持續1年沒有補充外源性胰島素[4]。此后,1 000多名T1DM患者單獨或在腎移植后接受了胰島移植治療[5]。然而,由于胰腺供體的匱乏,并且移植的胰島在一年左右開始纖維化[6],長期存活效果欠佳,且患者需要長期使用免疫抑制劑和抗排異反應的藥物等一系列原因,因此,在近期實施臨床胰島移植的患者數量大幅減少,已經無法成為擺脫終身注射胰島素治療T1DM的新型療法。因此,探索胰島β 細胞再生,從細胞水平增加分泌胰島素的細胞數量,成為糖尿病治療倍受期待的選擇。

最近的一系列遺傳學和臨床研究揭示,ω-3 PUFAs在抑制自身免疫以及保護和增強胰島功能方面的機制和治療潛力[7]。在動物研究中,Otani等研究表明,妊娠期和哺乳期母體飲食中ω-6/ω-3 PUFAs的比例較低(3.0),推遲了非肥胖型糖尿病(non-obese diabetes,NOD)小鼠后代糖尿病的發病時間。兩項大規模臨床觀察研究顯示,通過對嬰兒和兒童使用富含EPA/DHA的藥物進行早期干預,對T1DM的發生發展具有明顯的預防和治療作用。Stene等在一項基于大規模人群的病例對照研究中報道,在出生后第一年飲食補充魚肝油和維生素D可明顯降低兒童期T1DM的發病率。

本課題組前期研究發現NOD小鼠通過mfat-1轉基因表達能夠提高ω-3 PUFAs的含量,進而幾乎完全阻止了胰腺β細胞受到促炎細胞因子的攻擊,同時明顯增加了胰島素的分泌[8]。為了證明ω-3 PUFAs并非通過抑制自身免疫攻擊胰島β細胞,從而緩解機體的胰島素分泌不足的情況,本研究使用STZ誘導小鼠胰島β細胞損傷模型,探索ω-3 PUFAs促進胰島α細胞轉分化為β細胞的作用,為將來利用 ω-3 PUFAs 預防與治療T1DM的方案提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 SPF級雄性C57BL/6J小鼠(6周)購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司,mfat-1小鼠是本實驗室構建。實驗小鼠均飼養于華南理工大學大學城校區 SPF級實驗動物中心,動物中心使用許可證號: SYXK(粵)2017-0178。 研究方案獲得華南理工大學動物實驗倫理委員會批準。

1.1.2主要試劑 STZ(S0130)和鼠抗 glucagon(G2654)單克隆抗體購自 Sigma公司;兔抗 insulin(4590s)單克隆抗體、兔抗Alexa Flour 488(4412s)熒光二抗和鼠抗Alexa Flour 555(4409s)熒光二抗均購自Cell Signal Technology公司 ;97% EPA乙酯(批號:02200201)購自成都國為生物醫藥有限公司;75%魚油(EPA ∶DHA=25% ∶50%)購自上海賀普實業有限公司;小鼠胰島素ELISA試劑盒(90080)購自Crystal Chem公司。

1.1.3儀器 GC氣相色譜儀(美國Agilent);激光共聚焦(德國 Zeiss);酶標儀(瑞士Tecan);低溫離心機(美國Thermo);石蠟包埋機(德國SLEE);冷凍臺(中威電子儀器有限公司);石蠟切片機(美國Thermo);qTOWER3G analytic(德國 Jena)。

1.2 方法

1.2.1T1DM小鼠模型的建立與分組 取7周的野生型C57BL/6J 和mfat-1雄性小鼠,腹腔注射溶于無菌檸檬酸緩沖液(pH 4.5,0.05 mmol·L-1檸檬酸鈉)的STZ,劑量為60 mg·kg-1,連續給藥5 d。1周后取尾部靜脈血,檢測血糖連續2周高于11.1 mmol·L-1的小鼠,確認為糖尿病小鼠模型。隨后進行以下實驗分組:野生型(WT)組; mfat-1組; EPA組;魚油(fish oil)組。

1.2.2細胞培養 利用小鼠胰島α細胞系αTC1進行體外培養。首先在細胞培養基中分別加入5 μmol·L-1DHA+EPA,5 μmol·L-1EPA給予細胞適應性培養7 d,之后分別增加ω-3 PUFAs總濃度至25 μmol·L-1,對照組加入相應濃度的DMSO,即分為DMSO(Con)組、EPA組、DHA+EPA組。培養4周之后,經過固定,利用熒光染色標記胰島素(insulin)和胰高血糖素(glucagon),并使用熒光共聚焦顯微鏡觀察記錄。

1.2.3ELISA法檢測小鼠血清中insulin水平 糖耐受試驗過程中在0、30、60和90 min小鼠尾部取血,分離血清,按照小鼠胰島素ELISA試劑盒說明書檢測糖耐受過程中各時間點小鼠insulin水平。

1.2.4免疫熒光法檢測細胞和小鼠胰腺組織中insulin與glucagon表達水平 將細胞系以5×105L-1的密度接種,ω-3 PUFAs處理后,PBS洗去殘留培養基,4%多聚甲醛固定 30 min,PBS清洗后用1/1 000的Triton-100室溫下穿透20 min,清洗后用1%牛血清白蛋白室溫下封閉1 h,吸去封閉液,加入一抗(1 ∶100兔抗insulin,1 ∶1 000鼠抗glucagon)4 ℃孵育過夜,第2天,PBS清洗3次后,加入二抗(1 ∶1 000兔抗Alexa Flour 488,1 ∶1 000鼠抗Alexa Flour 555),室溫避光孵育1 h,PBS清洗后滴加DAPI室溫避光孵育5 min,PBS清洗,滴加抗熒光淬滅封片劑,在熒光顯微鏡下拍攝。

2 結果

2.1 ω-3 PUFAs對αTC1細胞系胰島素分泌的影響結果顯示,在DHA與EPA 1 ∶1混合處理組以及單獨使用EPA處理4周后,胰島α細胞可產生胰島素(Fig 1),而對照組細胞未發現胰島素染色陽性,表明,ω-3 PUFAs可以在體外培養條件下促進α細胞分泌胰島素。

2.2 ω-3 PUFAs對αTC1細胞系向β細胞轉分化的影響利用qRT-PCR法檢測3組細胞培養4周后關鍵轉錄因子的mRNA在細胞中的表達情況,并發現相較于對照組細胞,調控胰島素表達的關鍵基因ins1、ins2在EPA以及DHA+EPA共同培養后均明顯提高。胰-十二指腸同源盒1(pdx1)基因作為胰島素基因轉錄激活的關鍵性調控因子,也是胰島β細胞的特異性表達基因。結果顯示,pdx1在EPA單獨培養組中表達明顯提高,而且在DHA+EPA組中也有明顯增強。Pax4 是β 細胞和δ 細胞分化過程中的一個關鍵性的轉錄因子,在胰腺發育過程中控制著內分泌細胞的命運。在DHA+EPA組中,Pax4表達的明顯增強表明α細胞正在向β 細胞方向分化。

Fig 1 Confocal images of αTC1(insulin, green; glucagon, red; DAPI, blue)

Fig 2 Expression of specific genes in pancreatic α cells and pancreatic β

2.3 ω-3 PUFAs 對糖尿病小鼠隨機血糖水平的影響在明確了ω-3 PUFAs 能夠促進α細胞向β細胞方向分化之后,進一步利用WT和mfat-1轉基因小鼠連續5 d注射STZ(60 mg·kg-1)誘發糖尿病,并在注射STZ 6周后,選取連續2周隨機血糖均超過11.1 mmol·L-1的WT小鼠給予按體質量4 g·kg-1的EPA和fish oil(50%EPA和25%DHA)治療。結果顯示, mfat-1組小鼠在注射STZ后隨機血糖明顯低于WT組模型小鼠,并且野生型模型小鼠給予EPA治療后其隨機血糖水平也明顯下調,而fish oil組小鼠的隨機血糖與WT組相比差異無顯著性,但是呈現了下調趨勢(Fig 3A)。表明,內源性和外源性ω-3 PUFAs對T1DM均有明顯的防治作用。

2.4 ω-3 PUFAs對糖尿病小鼠葡萄糖穩態的影響隨機血糖水平升高的直接原因之一是由體內血清胰島素水平下降導致的葡萄糖耐量降低,如果糖耐量試驗后30 min 內血糖超過7.8 mmol·L-1,則表明胰島β細胞儲存和釋放胰島素的功能受損,機體對葡萄糖的吸收和利用能力下降,這是診斷糖尿病的確診試驗。本研究結果顯示, STZ給藥第11周,分別向各組小鼠腹腔注射葡萄糖,30 min 后WT和mfat-1小鼠血糖開始恢復,從第60 min開始,ω-3 PUFAs干預組小鼠血糖明顯低于WT組小鼠(Fig 3B)。此外,葡萄糖耐量試驗(injection glucose tolerance tests,IGTT)結果顯示,ω-3 PUFAs干預組曲線下面積(area under the curve,AUC)明顯低于WT模型組,表明ω-3 PUFAs明顯改善機體對葡萄糖的吸收與利用,降低血糖總量(Fig 3C)。

機體葡萄糖耐量增加或降低,一方面受血清胰島素的直接調控,另一方面也可能是外周胰島素抵抗的下降或增高所致。因此在進行IGTT 試驗的同時,在腹腔注射葡萄糖 0、30、60和90 min后經尾部取血檢測各組小鼠血清胰島素水平。結果顯示,空腹時mfat-1組和EPA組小鼠相較于WT組小鼠明顯上調,給予葡萄糖刺激30 min后,各組小鼠血清中的胰島素水平沒有明顯差異,但60 min 和90 min后,ω-3 PUFAs干預組血清胰島素分泌水平明顯高于WT組(Fig 3D),表明,ω-3 PUFAs 明顯改善STZ引起的T1DM小鼠β細胞胰島素分泌功能。為了進一步探究ω-3 PUFAs增強葡萄糖耐受性與葡萄糖誘導的胰島素分泌增加之間的聯系,本研究繼續展開了胰島素耐受性試驗,結果顯示,造模30 min后,4組小鼠血糖水平沒有明顯差異(Fig 3E,F),表明ω-3 PUFAs可促進STZ誘發的T1DM小鼠葡萄糖代謝的正常化。

2.5 ω-3 PUFAs干預對小鼠胰腺中多不飽和脂肪酸含量和比例的影響利用氣相色譜檢測各組小鼠胰腺中各種PUFAs 含量,結果如Tab 1 所示,與WT組相比,mfat-1組、EPA組和fish oil組小鼠胰腺組織中α-LA、EPA以及C22:5含量明顯高于WT組(P<0.01),而外周血中AA含量明顯低于WT(P<0.01)。此外,ω-3 PUFAs干預明顯降低胰腺組織中ω-6/ω-3 PUFAs的比例,表明內外源性ω-3 PUFAs均能夠促進小鼠體內的ω-6 PUFAs轉化為ω-3 PUFAs,降低ω-6/ω-3 PUFAs比例,為進一步探究ω-3 PUFAs 防治T1DM的發生發展奠定了基礎。

2.6 ω-3 PUFAs 對糖尿病小鼠胰島β細胞再生的影響本研究進一步利用免疫熒光技術,檢測WT組和mfat-1組(注射STZ第12周)小鼠胰島的功能,觀察兩組小鼠分泌胰島素與胰高血糖素功能的變化。結果顯示,與WT組相比,ω-3 PUFAs干預組小鼠部分胰島細胞恢復了分泌胰島素功能,進而可以維持正常的血糖濃度以及糖代謝水平,且存在可同時分泌胰島素和胰高血糖素的細胞(Fig 4),表明ω-3 PUFAs干預可促進胰島α細胞轉分化為β細胞。但ω-3 PUFAs促進胰島β細胞再生以及α細胞轉分化的分子機制還有待進一步研究。

Fig 3 ω-3 PUFAs normalized glucose metabolism in T1DM

Tab 1 Analysis of ω-3 PUFAs and ω-6 PUFAs composition and rations in pancreatic samples of

3 討論

T1DM的發病率和患病率在全球范圍內有很大差異[9-10],不同國家的發病率隨著時間的推移而發生變化[11],但T1DM一直是兒童最常見的慢性疾病之一[12]。無論是T1DM還是T2DM最終都引起胰腺β細胞丟失和慢性高血糖。在人類中,β細胞增殖發生在發育早期,成年人的β細胞增殖水平很低,幾乎檢測不到[13]。因此,依賴于重新激活成人β細胞增殖來治療T1DM在正常情況下是一個不切實際的幻想。重要的是,盡管糖尿病治療取得了最新進展,但與健康個體相比,T1DM患者仍然顯示出較短的預期壽命和惡化的生活質量。目前旨在開發替代療法,使用不同來源的細胞(例如干細胞,前體或分化細胞)替換丟失的β細胞成為一種有前途的治療方法。然而,盡管在體外模仿胚胎β細胞發育方面取得了重大進展,但仍然需要更深入地了解胰島β細胞發生發展的遺傳程序,以最終產生完全分化的β細胞。有研究表明,在產生胰高血糖素的細胞中異位表達Pax4,其可以轉化為產生胰島素的β樣細胞[14]。研究發現Pax4在小鼠α細胞中的錯誤表達也誘導其新生和轉化為β樣細胞,這些細胞具有分泌胰島素的功能,并允許逆轉化學誘導的高血糖的多個循環。研究還發現胰高血糖素細胞中Arx活性的下調是α轉化為β樣細胞的主要觸發因素。在T1DM研究的背景下,產生胰高血糖素的細胞的再生能力及其轉化為β樣細胞的潛力非常有趣。然而,上述轉基因方法并不能轉化為人類糖尿病的治療方法。

已有研究揭示,利用營養干預或基因治療手段提高體內ω-3 多不飽和脂肪酸水平,可以實現早期干預、延緩和逆轉T 細胞亞群失衡導致的自身免疫進程以及T1DM的進展,更意外發現了胰島α細胞轉分化為分泌胰島素的β細胞的現象[15]。本研究結果發現,αTC1細胞中添加EPA或者EPA+DHA培養一段時間后開始表達胰島素,EPA處理組胰島β細胞特異性基因ins 1、ins 2以及pdx 1不僅相較于對照組明顯上調而且與EPA+DHA處理組相比也明顯上調,說明EPA更能促進胰島α細胞轉分化為胰島β細胞。

在STZ誘導的糖尿病模型中,過表達 mfat-1 基因從而使胰腺富集 ω-3 PUFAs 也可以預防糖尿病的發生發展[16]。然而,最近研究發現,ω-3 PUFAs喂養無法模擬在 mfat-1轉基因小鼠中觀察到對胰島β細胞的保護作用,引起這些爭論的原因可能是混雜飲食因素,喂養過程可能會產生許多變量,包括所用油中的雜質、食物儲存和飲食持續時間,這些都會影響組織中脂肪酸的分布。通過轉基因表達mfat-1,細胞增加ω-3 PUFAs 和減少ω-6 PUFAs 可增強分離的胰島和胰島中葡萄糖、氨基酸和 GLP-1 刺激的胰島素分泌[17]。本研究發現,與 WT 相比,在 mfat-1 轉基因小鼠中觀察到的更高血清胰島素水平和更大的胰島,與最近報道的 mfat-1轉基因小鼠胰島數據一致[8]。

本研究最引人注目的是,無論在糖尿病小鼠中內源性的將ω-6 PUFAs轉化為ω-3 PUFAs,還是外源補充ω-3 PUFAs后,都能促進小鼠血糖水平的穩定和正常化,并且補充EPA的效果尤為明顯。這充分說明,血漿和胰腺中豐富的ω-3 PUFAs可以保護小鼠免受STZ引起的胰島β細胞破壞,ω-3 PUFAs水平與高血糖防治密切相關。研究發現,即使在T1DM和T2DM患者胰島中仍然存在大量有生理功能的胰島α細胞,Thorel等通過選擇性表達大鼠胰島素啟動子下游的白喉毒素受體,發現隨著99% β細胞的消融,α細胞可進入“雙激素”(同時表達胰島素和胰高血糖素)狀態并進一步發展為單一胰島素分泌細胞,表明β細胞再生可源于非β細胞,同時提示α細胞在β細胞團的損傷修復中發揮重要作用[18]。本文研究結果同樣發現了無論是mfat-1小鼠還是營養干預的小鼠胰腺組織切片,都存在胰島α細胞和胰島β細胞共定位現象,即α細胞進入了“雙激素”狀態,表明 ω-3 PUFAs 在胰島β細胞損傷的情況下,可促進胰島α細胞轉分化為胰島β細胞,但是是否能夠促進胰島α細胞完全轉化為胰島β細胞還有待進一步研究。

Fig 4 Islet and β cell regeneration and colocalization of α cells and β cells in diabetic mice treated with ω-3 PUFAs

綜上所述,本研究首次證明轉基因表達mfat-1及胰腺富集 ω-3 PUFAs可以預防并治療化學藥物誘導的糖尿病;并且EPA扮演了至關重要的角色,其作用是通過促進胰島α細胞轉分化為胰島β細胞,從而增加胰島素的分泌預防及治療T1DM。本研究為ω-3 PUFAs 防治T1DM 提供了理論基礎,但其相關機制有待深入研究。