基于網絡藥理學和分子對接探究大黃-瓜蔞藥對防治新型冠狀病毒感染合并急性肺損傷的有效成分和分子靶點

齊卓操,劉樹森,吳蘇婉,譚 波,高 丹,汪 順,劉永銘,劉家明,龍子江,楊愛東

(1.上海中醫藥大學中醫學院,上海 201203;2.上海市重大傳染病和生物安全研究院,上海 200032;3.哈爾濱商業大學藥學院,黑龍江 哈爾濱 150076;4.上海中醫藥大學附屬曙光醫院,上海 201203;5.安徽中醫藥大學中西醫結合學院,安徽 合肥 230012)

近3年來,新型冠狀病毒感染(corona virus disease 2019,COVID-19)在全球各國迅速蔓延,影響巨大[1]。隨著對COVID-19研究的深入,與原始毒株相比傳播力更強、潛伏期更短及發病進程更快的變異毒株不斷出現,COVID-19的防治難度日益增加[2]。在較嚴重病例中,感染可導致肺炎、肺部損傷以及急性呼吸綜合征等病癥[3]。急性肺損傷(acute lung injury,ALI)作為典型的COVID-19癥狀,具體表現為多種因素導致的肺細胞損傷。近年來,新發急性呼吸道病毒感染備受關注,其危害性主要是ALI導致的嚴重低氧血癥。隨著ALI的進展,肺泡的氣體交換能力會隨著肺部炎癥介質的積累而不斷下降,最終導致呼吸衰竭進而危害生命安全[4]。與其它致病因素相比,COVID-19引起的肺損傷初始臨床癥狀包括更加嚴重的低氧血癥和呼吸困難,以及影像學特征不明顯的肺部損傷[5]。為防止COVID-19引起肺損傷及其它嚴重癥狀,尋找合適的藥物和治療方法防治COVID-19合并ALI成為臨床迫切需要。

新版COVID-19防治指南闡明,中醫藥在COVID-19防治中的價值不可忽視,并對中醫藥防治策略進一步更新[6]。大黃-瓜蔞藥對出自《溫病條辨》[7]卷二,原方為宣白承氣湯(瓜蔞皮、生大黃、苦杏仁、生石膏)。該方為COVID-19的經典名方和常用方[8],課題組前期研究亦提示,宣白承氣湯對ALI具有保護和治療作用[9]。在宣白承氣湯經典方中生大黃瀉熱以通便,瓜蔞皮潤肺而化痰,合用痰熱可清。目前針對大黃-瓜蔞藥對的臨床和實驗研究尚未被廣泛重視。而網絡藥理學這種預測及研究方法已在中藥相關研究中取得積極成效,其系統整體性和交叉關聯性的特點與中醫藥理論中的整體觀念、辨證論治的思想高度統一。因此,本研究運用網絡藥理學方法預測大黃-瓜蔞藥對干預COVID-19合并ALI,以期為大黃-瓜蔞抗COVID-19或ALI的臨床應用提供依據,為中藥大黃-瓜蔞藥對的研究開發提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 大黃-瓜蔞有效成分與靶基因篩選通過TCMSP數據庫(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)檢索大黃、瓜蔞的有效成分的理化性質和作用靶點信息,收錄不完整的信息通過化學專業數據庫(http://www.organchem.csdb.cn)進行補充。所有靶點信息均通過Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)獲得標準化基因名稱。

1.2 疾病相關基因篩選使用GeneCards數據庫(https://www.genecards.org),設置物種為“Homo sapiens”,以 “Corona Virus Disease 2019”、“COVID-19”及“Acute Lung Injury”、“ALI” 作為關鍵詞進行檢索。同時,使用DrugBank數據庫(https://go.drugbank.com/)和DisGeNET數據庫(http://www.disgenet.org/)按照以上相同篩選條件檢索。合并3個數據庫的靶點數據,使用excel表格功能合并去重后,通過UniProt數據庫獲得標準化基因名稱。

1.3 關鍵靶基因和關鍵有效成分篩選將大黃-瓜蔞藥對相關靶基因和疾病相關靶基因導入在線韋恩圖繪制網站Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/),通過取交集獲得的共同靶點,被認為是大黃-瓜蔞藥對防治COVID-19合并ALI的關鍵靶點。利用Cytoscape 3.9.1軟件構建“藥對-有效成分-靶點”網絡,并根據degree值篩選出前4名的化合物作為關鍵有效成分,通過PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得二維結構數據。

1.4 PPI構建及核心靶點篩選在STRING數據庫(https://string-db.org/)中添加關鍵靶點,并設置物種為“Homo sapiens”,最低相互作用閾值為0.4,其他參數為默認值[10],最終獲得PPI網絡。利用Cytoscape 3.9.1軟件中的CytoHubba插件對PPI網絡進行可視化,然后根據degree值大小篩選核心靶點[10]。

1.5 GO與KEGG富集分析在DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)錄入篩選的關鍵靶點,設置物種為“Homo sapiens”、P<0.05為篩選條件,以P值進行排序[10]。GO功能分析分類如下:生物過程(biological process,BP)、細胞成分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)[10],采用氣泡圖、弦圖分別對排序前10個GO條目及KEGG通路進行可視化。利用Cytoscape 3.9.1軟件(ClueGO插件)進行富集網絡分析。

1.6 分子對接驗證從PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)和Uniprot數據庫(http://www.uniprot.org/)下載核心靶點的高解析精度(<2.50 ?)的蛋白質三維結構數據,將篩選的關鍵成分和核心靶點信息輸入AutoDock Vina(The Scripps Research Institute,Molecular Biology,CA,USA)軟件,進行分子對接,結合能負值越大,對接構象越穩定,自發結合能力越強。

2 結果

2.1 大黃-瓜蔞藥對有效成分及相關靶基因的預測通過TCMSP數據庫檢索,分別獲得大黃成分44個,瓜蔞成分56個。將大黃、瓜蔞靶點信息核對、合并、去重后,輸入Uniprot數據庫,校正并標準化所得到的基因名,最終得到300個潛在的大黃-瓜蔞藥對靶基因。

2.2 疾病相關靶基因的預測在GeneCards、OMIM及DrugBank數據庫中檢索COVID-19與ALI的相關基因,核對、去除重復基因,最終篩選出COVID-19與ALI相關靶點。將靶點信息輸入Uniprot數據庫,對基因名標準化,得到COVID-19相關靶基因1 502個,ALI相關靶基因4 359個。

2.3 關鍵靶基因和關鍵有效成分篩選采用大黃-瓜蔞藥對靶基因、COVID-19與ALI相關靶基因繪制Venn圖,獲得32個共同靶點(即關鍵靶點)(Fig 1)。構建的“藥對-有效成分-靶點”網絡圖,一共具有53個節點和63條邊,即大黃-瓜蔞藥對中有19個關鍵有效成分作用于32個關鍵靶點(Tab 1和Fig 2)。其中degree值排名前4位的成分依次為油酸(oleic acid)、小麥黃素(tricin)、蘆薈大黃素(aloe-emodin)、D-乳酸(D(-)-lactic acid,DLA),被認為可能是大黃-瓜蔞藥對發揮防治COVID-19合并ALI的關鍵有效成分。

Fig 1 Venn diagrams integrating key targets of Dahuang-Gualou,COVID-19 and ALI

Tab 1 Chemical information for active compounds of Dahuang-Gualou medicine pair

Fig 2 The “medicine pair-active component-target” network

2.4 構建PPI網絡分析采用32個共同靶點構建的PPI網絡圖一共具有23個節點和99條邊(Fig 3)。PPI網絡圖中靶點顏色深淺與其代表的大黃-瓜蔞藥對靶點的degree值正相關,顏色越深,degree值越大。Degree值排序前10位的核心基因分別為:INS、TNF、IL-1β、PPARG、MAPK1、PPARA、MAPK14、IL10、GSK3B、CASP8。它們是大黃-瓜蔞藥對治療COVID-19合并ALI的潛在核心靶點。

Fig 3 PPI network of common targets

2.5 關鍵靶點基因功能及富集分析采用DAVID在線工具對關鍵靶點進行基因功能分析、通路富集分析[10],共獲得顯著富集的136個GO條目(P<0.05),其中生物過程105項,包括基因表達的負調控等;細胞成分11項,包括細胞外區等;分子功能20項,包括蛋白質結合等(Fig 4)。KEGG弦圖提示,COVID-19合并ALI相關的通路(Fig 5)。

Fig 4 Bubble diagrams of GO enrichment

2.6 分子對接驗證采用分子對接技術對大黃-瓜蔞藥對的關鍵成分(油酸、小麥黃素、蘆薈大黃素、D-乳酸)與核心靶點(INS、TNF、IL-1β、PPARG、MAPK1、PPARA、MAPK14、IL10、GSK3B、CASP8)的結合情況進行驗證。如Fig 6所示,小麥黃素、蘆薈大黃素與核心靶點親和力較好,能自發結合。在最佳模式下,小麥黃素與INS、TNF、IL-1β的結合能分別為-7.6、-8.6、-7.7 kcal·mol-1,而蘆薈大黃素與INS、TNF、IL-1β的結合能分別為-7.9、-8.9、-8.6 kcal·mol-1(Tab 2)。

3 討論

本研究采用TCMSP數據庫檢索獲得“大黃-瓜蔞”藥對100個有效成分及靶基因,其中大黃成分44個,瓜蔞成分56個。另外,從GeneCards、DisGeNET、DrugBank數據庫中篩選與COVID-19、ALI相關的潛在靶點,通過“藥對-有效成分-靶點”網絡和PPI分析,得到關鍵有效成分19個及關鍵靶點32個。依據degree值排序,關鍵成分包括黃酮類和蒽醌類成分,核心靶點(10個)多為蛋白激酶、促炎細胞因子等。同時,獲得“大黃-瓜蔞”藥對的關鍵靶點在136個GO條目和57條KEGG通路中(P<0.05)顯著富集,其中抗病毒、抗炎機制為本研究主要相關的功能與通路,如IL-17信號通路、T細胞受體信號通路等。最后,分子對接研究也表明,大黃-瓜蔞藥對的關鍵有效成分小麥黃素和蘆薈大黃素可以與疾病相關核心靶點(INS、TNF、IL-1β)自發結合。

Fig 5 KEGG chord graph

Tab 2 The binding affinities of active compounds of Dahuang-Gualou medicine pair and clinical treatment drugs with core targets

小麥黃素和蘆薈大黃素分別屬于黃酮類和蒽醌類化合物。如黃酮類化合物具有抗病毒、抗炎作用,可通過調節p38MAPK或NF-κB炎癥通路,有效減輕LPS誘導的ALI炎癥反應[11]。而蘆薈大黃素、大黃酸與大黃素等大黃蒽醌類化合物也可抑制LPS引起的ALI細胞模型,其作用機制主要為炎癥通路等[12]。其中蘆薈大黃素與蒽醌類化合物結合受體的結合力強于大黃酸和大黃素,表現出更強的抗炎能力,這一特性與蘆薈大黃素分子結構的疏水作用更強有關[12]。由此提示,以小麥黃素和蘆薈大黃素為代表的黃酮類和蒽醌類化合物可能是大黃-瓜蔞藥對發揮抗病毒、調節肺部急性炎癥、抗ALI作用的關鍵作用物質基礎。

PPI網絡圖排序靠前的靶點,即INS、TNF、IL-1β、PPARG、MAPK1、PPARA、MAPK14、IL-10、GSK3B與CASP8,可能是大黃-瓜蔞藥對治療目的疾病的核心靶點。已有研究表明,COVID-19患者有明顯的淋巴細胞減少和中性粒細胞增加,在幸存的重癥COVID-19患者中出現了T細胞計數逐漸恢復,促炎細胞因子(IL-10與IL-17等)升高的情況[13]。由此可知,在COVID-19病程發展階段會引發免疫反應,調節免疫將成為將治療COVID-19重要方向。MAPK1、MAPK14等是治療COVID-19的關鍵靶標,參與炎癥轉化等相關過程[14]。

GO分析結果提示,大黃-瓜蔞藥對在基因表達的負調控、細胞外區及蛋白質結合等方面具有突出作用。同時,KEGG通路富集結果提示,大黃-瓜蔞藥對的抗病毒、抗炎作用與IL-17信號通路、T細胞受體信號通路等相關。其中,6個靶點與IL-17信號通路相關,分別為GSK3B、CASP8、IL-1β、MAPK1、MAPK14與TNF。5個靶點與T細胞受體信號通路相關,分別為IL10、GSK3B、MAPK1、MAPK14、TNF。IL-17是由CD4+T細胞分泌的一種促炎因子,其能夠誘導上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞合成分泌免疫及炎癥因子(包括多種白介素)。IL-17信號通路可激活MAPK途徑中的抗細胞因子和趨化因子,從而影響機體的免疫反應[14]。T細胞受體信號通路在T細胞活化、T細胞亞群分化以及效應T細胞功能等過程中至關重要,是經典的炎癥通路之一[14]。這表明大黃-瓜蔞藥對可以通過這些靶點作用于顯著富集的通路,在目的疾病的治療中發揮重要價值。

綜上所述,本研究結果提示“大黃-瓜蔞”藥對防治COVID-19合并ALI的治療作用機制可能與以小麥黃素和蘆薈大黃素為代表的黃酮類和蒽醌類成分結合核心靶點(INS、TNF、IL-1β等),從而調控病毒、炎癥相關信號通路和生物學過程。由于“大黃-瓜蔞”藥對的新成分和新靶點仍在不斷被報道,擴展數據分析范圍并完善計算機算法顯得尤為重要。本研究初步揭示了大黃-瓜蔞藥對防治COVID-19合并ALI的有效成分與潛在靶點,下一步將通過高效液相色譜等實驗鑒定有效成分,開展藥理實驗驗證核心靶點與關鍵通路,以期指導臨床應用。