淫黃葛合劑對APPswe/PS1dE9小鼠行為及海馬胱氨酸/谷氨酸反向轉運體的影響

張天賜,賀小平,劉 珊,孫寧寧,李佳明,林一璨,董賢慧

(河北中醫藥大學, 河北省心腦血管病中醫藥防治研究重點實驗室,河北 石家莊 050091)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是以學習記憶能力下降及自主探索行為減少為主要臨床表現的中樞神經系統退行性疾病[1],隨著老齡化進程的加快,逐漸增多的AD患者給家庭與社會帶來了沉重負擔。近年來研究發現,胱氨酸/谷氨酸反向轉運體(cystine/glutamate antiporter, systemXc)從維持細胞外谷氨酸濃度、降低神經元對Aβ的敏感毒性、抑制鐵死亡等角度減輕AD損傷[2],是AD的潛在治療靶點。SystemXc是位于細胞膜表面的異二聚體蛋白,由溶質載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11, SLC7A11)與溶質載體家族3成員2(solute carrier family 3 member 2, SLC3A2)共同組成[3],可以按照1 ∶1的比例交換細胞內外的胱氨酸和谷氨酸,SLC7A11也是最新發現的識別AD的生物標志物之一。因此,檢測海馬SLC7A11與SLC3A2的表達水平對于探討藥物對AD療效有一定的實際意義。

現階段AD治療藥物匱乏,臨床療效并不理想,而中藥多靶點、多角度的治療AD的特點逐漸受到重視。淫羊藿苷、黃芪甲苷、葛根素是中藥淫羊藿、黃芪、葛根的有效組分。前期研究基礎提示,淫羊藿苷、黃芪甲苷、葛根素組成的淫黃葛合劑可以減少APPswe/PS1dE9小鼠大腦皮質老年斑的沉積,降低神經元的損傷,但是其具體作用機制有待進一步探討。因此,本實驗以APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠為AD動物模型,通過檢測海馬SLC7A11、SLC3A2蛋白與mRNA的表達,初步探討淫黃葛合劑改善APPswe/PS1dE9小鼠行為學表現的機制,為AD的治療與用藥提供新方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑與儀器

1.1.1實驗動物 APPswe/PS1dE9小鼠動物購自北京華阜康生物科技股份有限公司,許可證編號為:SCXK(京)2019-0008。所有實驗經過河北中醫學院動物倫理委員會與河北中醫學院實驗動物中心批準,許可證號為SYXK(冀)2017-0005,保持12 h明暗周期,25 ℃室溫,50%濕度,所有動物單籠喂養及飲水。

1.1.2主要試劑與儀器 黃芪甲苷、淫羊藿苷、葛根素、地拉羅司(deferasirox, DFX)購自大連美侖(MB1955-1、MB2189、MB6183-1、MB1208-2),含量均≥97%;Prestained Protain MarkerⅡ(10-200KDA)、Anti-beta Actin Rabbit pAb(武漢賽維爾,G2058、GB11001);PageRulerTM預染蛋白分子量標準(10-180 ku)(Thermo Fisher Scientific,26616);Blue Plus?V Protein Marker (10-190 ku)(北京全式金,DM141-01);辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG (H+L)(江蘇碧云天,A0208);SLC7A11/XCT Polyclonal Antibody19 Publications(武漢三鷹,26864-1-AP);4F2hc/CD98 Rabbit Polyclonal Antibody(江蘇碧云天,AF6444);Alexa Fluor?594標記山羊抗兔IgG (H+L)(中杉金橋,ZF-0516);總RNA提取試劑盒(北京天根,DP419);PrimeScriptTMRT rengeat KIT with gDNA Eraser、TB GreenTMPremix EX TapTMⅡ(TaKaRa,RR407A、RR820A)。QuantStudio5熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher公司)、RM2255全自動輪轉切片機(德國Leica公司)、DM5000B型熒光顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1動物分組及干預 6只8月齡雄性C57BL/6J小鼠為正常組,18只8月齡雄性APPswe/PS1dE9小鼠每組6只,隨機分為模型組、合劑組、DFX組。所有實驗動物給藥至10月齡,每日灌胃1次。正常組和模型組小鼠給予等量蒸餾水灌胃。合劑組根據徐叔云主編《藥理實驗方法學》以臨床3倍藥量給藥,以淫羊藿苷、黃芪甲苷、葛根素配制為淫黃葛合劑(淫羊藿苷、黃芪甲苷、葛根素給藥量為120 mg·kg-1、80 mg·kg-1、80 mg·kg-1)灌胃,DFX組以DFX灌胃,劑量為100 mg·kg-1。

1.2.2行為學測試 用藥結束后,采用八臂迷宮實驗檢測各組小鼠空間、學習記憶能力。八臂迷宮是由一中央圓形平臺放射出的等分八臂式旱迷宮。八臂迷宮實驗前對所有小鼠稱量體質量并記錄,禁食24 h,此后在每天的八臂迷宮訓練結束后限制性的給予正常飼料,使小鼠體質量維持在正常進食小鼠的75%～80%。實驗為期7 d。d 1～3在迷宮各臂盡頭及中央區分撒適量正常飼料顆粒,同時將4只動物置于迷宮中央區,而后打開各臂門,讓所有小鼠自由攝食、探索10 min以適應迷宮環境。d 4～5,取出中央區食物,在各臂盡頭分撒適量正常飼料顆粒,所有動物進行單獨訓練,每天2次。d 6后,將八臂迷宮所有臂進行編號,隨機選取4個臂,在臂盡頭分撒適量正常飼料顆粒,關閉各臂門。每次將一只實驗小鼠放置在迷宮中央區,30 s后打開所有臂門,讓小鼠在迷宮中自由活動并攝食,直至動物吃完所有4個臂的食物。如果在10 min測試時間內食物仍未吃凈,則實驗終止,每只小鼠結束測試后,清除迷宮底部糞便與尿液,并用75%酒精擦拭整個迷宮及隔板,避免氣味干擾。待酒精全部揮發后進行下一組小鼠實驗。進入放有食物臂視為正確,應用SMART 3.0軟件記錄并分析所有動物迷宮內行動軌跡、總正確次數、工作記憶錯誤次數、參考記憶錯誤次數。

1.2.3免疫熒光觀察海馬CA3區SLC7A11、SLC3A2的表達 行為學測試結束后,正常組、模型組各3只小鼠麻醉后4%多聚甲醛經心臟灌注固定,石蠟包埋,切片。滴加1 ∶50稀釋后的相應一抗,4 ℃濕盒內過夜。將處理好的切片放入pH 7.4的PBS中充分漂洗,加入1 ∶300稀釋后的Alexa Fluor?594標記山羊抗兔IgG(H+L),室溫下50 min后封片。每張切片選取3個視野進行顯微圖像(100倍)采集,采用ImageJ觀察并分析海馬CA3區SLC7A11、SLC3A2表達與平均熒光強度。

1.2.4Western blot檢測海馬組織SLC7A11、SLC3A2的蛋白表達水平 各組3只小鼠麻醉后斷頭取腦,冰上迅速剝離海馬,-80 ℃冰箱凍存。提取蛋白,應用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。每組蛋白上樣量為60 μg,以60 V,40 min,110 V,90 min電泳條件進行電泳。轉移到0.45 μm的PVDF膜上后用5%脫脂奶粉進行2 h封閉。Anti-beta Actin Rabbit pAb(1 ∶1 000)、SLC7A11/XCT Polyclonal Antibody19 Publications(1 ∶1 000);4F2hc/CD98 Rabbit Polyclonal Antibody(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次,室溫孵育二抗1.5 h,TBST洗膜3次發光。采用ImageJ軟件進行光密度值測量分析。

1.2.5Real time q-PCR檢測海馬組織SLC7A11、SLC3A2的mRNA表達水平 海馬組織放入低溫組織研磨儀中研碎,總RNA提取試劑盒進行RNA提取,超微量分光光度計檢測RNA濃度。按照PrimeScriptTMRT rengeat KIT with gDNA Eraser 取1 μg總RNA進行反轉錄。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成,引物序列見Tab 1。以10倍梯度稀釋cDNA樣本,上下游各取0.8 μL引物,按照TB GreenTMPremix EX TapTMⅡ說明書進行操作,反應總體系為20 μL,目的基因表達相對數量用2-△△CT表示。

Tab 1 Primer sequence

2 結果

2.1 行為學Fig 1八臂迷宮實驗結果顯示,與正常組相比,模型組小鼠總正確次數明顯減少(P<0.01),工作記憶錯誤次數、參考記憶錯誤次數明顯增加(P<0.01);與模型組相比,合劑組、DFX組總正確次數增加(P<0.01),工作記憶錯誤次數、參考記憶錯誤次數減少(P<0.01);合劑組、DFX組總正確次數、工作記憶錯誤次數、參考記憶錯誤次數差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 免疫熒光如Fig 2所示,圖片為SLC7A11與SLC3A2蛋白(均為紅色熒光)與DAPI(藍色熒光)復染細胞核后合成得圖。與正常組相比,模型組小鼠海馬CA3區SLC7A11、SLC3A2表達降低,平均熒光強度下降(P<0.05)。

Fig 1 Eight-arm maze test results of mice in each group

Fig 2 Expression of SLC7A11 and SLC3A2 i n hippocampus of mice in normal and

2.3 Western blotFig 3結果顯示,與正常組相比,模型組小鼠海馬SLC7A11、SLC3A2表達降低(P<0.05);與模型組相比,合劑組和DFX組SLC7A11、SLC3A2表達均升高(P<0.05);合劑組與DFX組SLC7A11、SLC3A2表達差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 Real time q-PCRFig 4結果顯示,與正常組相比,模型組小鼠海馬SLC7A11、SLC3A2mRNA表達降低(P<0.05);與模型組相比,合劑組和DFX組SLC7A11、SLC3A2mRNA表達升高(P<0.05);合劑組和DFX組SLC7A11、SLC3A2mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)。

Fig 3 Expression of SLC7A11 and SLC3A2

3 討論

AD發病受環境、遺傳以及個體因素差異影響,以空間、學習記憶能力喪失為主要臨床表現。本實驗選用的APPswe /PS1dE9雙轉基因小鼠存在早老素1( presenilin-1, PS1)基因E9缺失,是較為常用的AD轉基因動物模型。APPswe /PS1dE9雙轉基因模型小鼠來源于C57BL/6J小鼠,所以選取C57BL/6J小鼠為正常對照組[4]。

AD發病機制復雜。近年來的研究提示,SystemXc是AD的潛在治療靶點。SystemXc是由輕鏈亞基SLC7A11和重鏈亞基SLC3A2通過二硫鍵組成的異二聚體,在腦中高度表達,生理功能為維持細胞內外谷氨酸、胱氨酸的交換平衡。SLC7A11與SLC3A2表達降低時將導致谷氨酸過度積累與鐵死亡激活,加速AD發病[5]。SLC7A11與SLC3A2表達異常將導致的谷氨酸傳遞受阻,引起神經元興奮障礙,最終影響學習與記憶功能。在細胞內部,過量谷氨酸因轉出障礙逐漸累積,通過激活12-脂肪氧合酶和環鳥苷酸依賴的Ca2+通道、消耗胞內的谷胱甘肽,導致能量代謝障礙以及促進胞內過氧化物積累導致神經元死亡[6-7];在細胞外部,由于突觸間的谷氨酸濃度降低,神經沖動無法正常傳導,同時由于胱氨酸攝入抑制將放大胞外非SystemXc釋放的谷氨酸介導的神經毒性,進而引起神經元功能障礙及退化,導致神經細胞死亡[8],加重AD認知損傷。另外,SLC7A11與SLC3A2也是鐵死亡的負調節基因,在AD中,SLC7A11與SLC3A2表達降低將激活鐵死亡過程,并由此抑制弗林蛋白,增強β-分泌酶活性,促進淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)的淀粉樣代謝通路加速Aβ沉積,加重AD病情[9]。SLC7A11與SLC3A2表達降低也將抑制谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)的水平并進一步加重神經元損傷[10]。另外,Lane的最新研究提示,SLC7A11在AD患者血液中的表達水平不受年齡影響,且對AD有超高敏感性,是潛在的AD生物標志物之一[5]。因此,SLC7A11與SLC3A2的表達水平一定程度上反映了AD進程。本實驗中八臂迷宮結果提示,與正常組小鼠相比,模型組小鼠總正確次數減少,參考記憶錯誤次數、工作記憶錯誤次數均增加,結合免疫熒光結果,模型組小鼠海馬CA3區SLC7A11與SLC3A2的表達降低,提示模型小鼠的認知障礙可能與SLC7A11與SLC3A2的表達降低相關。

Fig 4 Expression of SLC7A11 SLC3A2 mRNA

AD屬中醫“癡呆”、“呆病”范疇,是以腎虛精虧,氣血不足為本;痰瘀互結,濁毒內生為標的本虛標實之證,治以補腎為主。淫羊藿、黃芪、葛根均是在中醫病機理論指導下臨床常用的AD治療藥物[11],實驗開始前對淫羊藿、黃芪、葛根三藥進行了網絡藥理學分析與分子對接研究也發現三藥對AD有直接治療作用[12]。淫羊藿苷、黃芪甲苷、葛根素是中藥淫羊藿、黃芪、葛根的主要有效成分,3種單體組成合劑與傳統中藥合劑相比,有效成分更加清晰明確且易于質控?，F代藥理學研究發現,淫羊藿苷[13]、黃芪甲苷[14]、葛根素[15]從抑制氧化應激、促進神經元再生、抑制微管相關蛋白(microtubule-associated protein tau, Tau)異常磷酸化等角度緩解AD發病。前期實驗基礎也證實,淫黃葛合劑可以緩解APPswe/PS1dE9小鼠皮層神經元腫脹,減少皮質老年斑的沉積,降低神經元的損傷,且合劑效果要強于3藥有效成分單獨使用[16]。因此,為了進一步明確淫黃葛合劑治療AD的機制,本實驗以SystemXc為切入點,探討淫黃葛合劑對APPswe/PS1dE9小鼠的行為改善作用以及對海馬SLC7A11與SLC3A2的表達影響。DFX可以抑制Aβ沉積改善AD癥狀[17],促進SystemXc表達[18],因此作為陽性對照藥物。本實驗中,與模型組相比,合劑組小鼠的行為障礙得到改善,海馬中SLC7A11與SLC3A2蛋白及mRNA表達均上升,說明淫黃葛合劑可能通過促進海馬SLC7A11、SLC3A2的表達改善模型小鼠的行為障礙。

綜上所述,本實驗研究淫黃葛合劑對APPswe/PS1dE9小鼠行為及海馬SystemXc的影響,結果顯示,淫黃葛合劑可以改善APPswe/PS1dE9小鼠行為表現,其機制與促進海馬SLC7A11、SLC3A2的表達相關。該研究為AD的治療與用藥提供新的思路與方法。另外,對圍繞SLC7A11與SLC3A2發揮抗AD作用的上、下游分子機制的探討將是下一步的研究方向。