蜂蜜中百里香酚含量的檢測

謝思瑤，劉仁清，蔣小良，李天寶，周偉光

（1.江門海關(guān)技術(shù)中心，廣東江門 529000；2.佛山海關(guān)綜合技術(shù)中心，廣東佛山 528500；3.陽江海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，廣東陽江 529500）

百里香酚為無色結(jié)晶粉末，具有抗菌、抗氧化、防蛀等特性，天然存在于唇形科植物百里香草、牛至草、麝香草等中，主要用于制香料、藥物、指示劑、防腐劑[1-3]。在養(yǎng)蜂領(lǐng)域，使用農(nóng)藥造成的藥物殘留及蜂螨耐藥性問題逐漸顯現(xiàn)，植物源性抗螨產(chǎn)物因易于獲得、毒性小，逐漸被關(guān)注和研究，張靜、梁偉博、吳子毅等都對百里香酚殺滅蜂螨進(jìn)行了研究，并收到了良好的效果[4-11]。2013年歐盟批準(zhǔn)將百里香酚作為植物保護(hù)產(chǎn)品投放市場；2016 年加拿大批準(zhǔn)登記百里香酚作為防控蜂巢瓦螨銷售和使用；2020 年歐盟批準(zhǔn)檸檬酸、山梨酸、百里香酚和香草醛制備物作為飼料添加劑；2022 年美國豁免百里香酚的殘留限量。隨著百里香酚的使用范圍擴大和使用量增加，我們應(yīng)關(guān)注其帶來的負(fù)面影響，提前進(jìn)行監(jiān)測和研究檢測方法，保證蜂蜜產(chǎn)量和質(zhì)量，促進(jìn)蜂蜜產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫三重四級桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（安捷倫科技有限公司；Agilent 8890），分析天平（德國賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；TE214S），超聲波清洗機（上海聲彥超聲波儀器有限公司；SCQ-5201B），高速離心機（德國西格瑪公司；Sigma 3K15），固相萃取柱（天津博納艾杰爾科技有限公司；Agela cleanert PEP），全自動氮吹儀（上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司；N1），有機相針式濾膜（尚騰科技（廣州）有限公司；0.22 μm）。

百里香酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（北京曼哈格科技有限公司；純度?98%），正己烷（上海麥克林生化科技有限公司；色譜純），水(自制；一級)。

2 實驗方法

2.1 試樣的制備及保存

無結(jié)晶的樣品，攪拌均勻即可；有結(jié)晶的樣品，在密閉條件下，于60 ℃以下的水浴中振蕩，待樣品全部融化后攪拌均勻，并迅速冷卻至室溫。以500 g作為試樣，制備好的試樣置于干凈的樣品瓶中，做好標(biāo)記，于干燥陰涼的環(huán)境中密封保存。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

以正己烷為溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，濃度為1 g/L，于4 ℃儲存，配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液時將標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液進(jìn)行逐級稀釋，稀釋后濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

2.3 樣品前處理

稱取2.000 g 試樣，置于50 mL 帶蓋離心管內(nèi)，加入10 mL 水，2 勺復(fù)合鹽，于超聲波清洗機中超聲提取5 min，再加10 mL 正己烷，繼續(xù)超聲提取10 min，再以8 000 r/min 的速率離心5 min，取上清液過PEP柱，收集洗脫液，40 ℃氮氣吹至近干，用正己烷定容至1 mL，搖勻。定容液過0.22 μm濾膜后收集于樣品瓶中待測。

2.4 色譜條件

氣相色譜條件：色譜柱為VF-1701ms（15 m ×250 μm ×0.25 μm），進(jìn)樣口溫度為250 ℃，載氣為高純氦氣（99.999%），載氣流量為1.7 mL/min，進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，升溫程序為初始溫度40 ℃，保持1 min，以40 ℃/min的速率升到120 ℃，再以5 ℃/min 的速率升到240 ℃，再以20 ℃/min 的速率升到300 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件為離子源溫度280 ℃，電子能量70 eV，掃描方式為SCAN和MRM。

3 結(jié)果與分析

3.1 質(zhì)譜分析條件的選擇

首先用SCAN 方式對百里香酚標(biāo)物進(jìn)行掃描（m/z:50～500），得到的譜圖通過譜庫檢索確定前級離子（m/z135）及保留時間為7.41 min，再進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描，依次設(shè)置碰撞能為10 eV，20 eV，30 eV，40 eV，通過比較不同碰撞能下產(chǎn)生的子離子強度確定對應(yīng)的子離子，然后進(jìn)行MRM 掃描，確定最佳碰撞能。前級離子TIC 圖與離子質(zhì)譜圖見圖1-圖5，具體分析參數(shù)詳見表1。

表1 離子對保留時間及質(zhì)譜分析參數(shù)

圖1 百里香酚產(chǎn)物離子135的TIC圖

圖2 百里香酚產(chǎn)物離子135在10 eV電子能轟擊下產(chǎn)生的質(zhì)譜圖

圖3 百里香酚產(chǎn)物離子135在20 eV電子能轟擊下產(chǎn)生的質(zhì)譜圖

圖4 百里香酚產(chǎn)物離子135在30 eV電子能轟擊下產(chǎn)生的質(zhì)譜圖

圖5 百里香酚產(chǎn)物離子135在40 eV電子能轟擊下產(chǎn)生的質(zhì)譜圖

3.2 提取方式的選擇

稱取2.000 g 不含被測物的樣品，加入0.020 μg標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為待測物進(jìn)行檢測。通過比較采取渦旋、振蕩、超聲三種提取方式對蜂蜜中百里香酚提取效率的影響。由圖6 可知，在提取時間相同的情況下，超聲提取的回收率最高，且采用超聲提取效率最高。

圖6 不同提取方式的提取效率

3.3 線性范圍及方法檢出限

通過繪制m/z=91 離子的濃度與峰面積曲線圖（圖7）可知，該曲線在0.5～50 mg/L 的范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 1。取20 份蜂蜜樣品，按上述2.3 的方法處理后上機檢測，以信噪比（S/N）=3 為檢出限可知，百里香酚的檢出限為2.5 mg/kg。

3.4 回收率與精密度

向蜂蜜樣品中添加百里香酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按2.3所述方法進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，方法的回收率與精密度如表2 所示。可見百里香酚在不同的添加水平下，回收率在88.67%～91.03%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤6.01%。

4 結(jié)論

本實驗所建立的蜂蜜中百里香酚含量的檢測方法，使用正己烷作為提取溶劑，用PEP 柱進(jìn)行凈化分離，檢測時間短，操作簡便，有機物使用量較少，方法檢出限為2.5 mg/kg，回收率為88.67%～91.03%，RSD≤6.01%，有較好的準(zhǔn)確度與精密度，可為蜂蜜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供檢測技術(shù)參考。