FOXP3 調控非小細胞肺癌A549 細胞對阿霉素敏感性的作用及其機制

蓋曉東, 趙 穎, 王鶴霏, 何程遠, 王星翔, 歷 春

（1.北華大學基礎醫學院免疫學教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林大學第一醫院腫瘤婦科，吉林 長春 130021）

肺癌是世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌（non small-cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌的85%［1-2］。臨床上，化療是治療NSCLC 的重要手段之一，但腫瘤細胞對化療藥物產生的耐藥性是影響療效和患者預后的主要因素［3］。因此，降低腫瘤的耐藥性和提高化療效果是腫瘤治療領域的研究熱點。叉頭蛋白3（forkhead box protein 3， FOXP3） 是叉頭蛋白家族成員之一， 是 調 節 性 T 淋 巴 細 胞 （regulatory T lymphocytes，Tregs）的關鍵轉錄因子，通過發揮免疫抑制功能參與機體的免疫耐受和腫瘤逃逸［4］。研究［5-7］顯示：FOXP3 在肺癌等多種腫瘤細胞中均有表達，其表達水平與腫瘤的侵襲、轉移和患者的不良預后關系密切。本課題組前期研究［8-11］顯示：FOXP3 高表達不僅促進NSCLC 細胞增殖、侵襲和轉移，還可通過降低NSCLC 細胞對順鉑和5-氟尿嘧啶等化療藥物的敏感性促進腫瘤耐藥，但其參與化療耐藥的調控機制尚未明確。

Notch1 信號通路是一個高度保守的信號轉導通路，可調控細胞的增殖、分化和凋亡等功能。Hes1 是Notch1 信號通路下游的重要分子靶點，該通路的異常激活與肺癌等腫瘤細胞的增殖、侵襲和耐 藥 關 系 密 切［12-13］。研 究［14］顯 示：30% NSCLC患者出現Notch1 信號通路異常活化。本課題組前期研究［15］顯示：Notch1 信號通路可促進NSCLC細胞上皮間質轉化和增強順鉑的化療抵抗作用。目前，Notch1/Hes1 信號通路與FOXP3 介導的耐藥作用之間的關系尚不清楚。本研究以阿霉素（doxorubicin， Dox） 作為代表性化療藥，以γ-分泌酶抑制劑DAPT 作為Notch1/Hes1 信號通路抑制劑， 采 用 小 干 擾RNA （small interfering RNA，siRNA） 方法沉默人NSCLC A549 細胞中FOXP3表達，觀察FOXP3 對Dox 敏感性的變化及其通過Notch1/Hes1 信號通路參與Dox 耐藥的機制，為提高NSCLC 患者的化療效果提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人NSCLC A549 細胞由北華大學分子醫學重點實驗室保存。DMEM培養基購自上海中喬新舟生物公司，胎牛血清購自浙江天杭生物公司，FOXP3 siRNA 序列及陰性對照序列由廣州銳博生物公司合成，LipofectamineTM2000 試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，Dox 購自浙江海正藥業，FOXP3 抗體購自湖南 艾方 生 物 公 司， P- 糖 蛋 白（P-glucoprotein，P-gp） 和GAPDH 抗體購自武漢愛博泰克生物公司，Notch1 和Hes1 抗體、熒光二抗、CCK-8 試劑盒、放射性免疫沉淀測定（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液，二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒及ECL 發光試劑盒均購自上海碧云天生物公司。Western blotting 電泳設備購自美國Bio-Rad 公司， 正置熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司，全自動酶標儀購自美國Bio-Tek公司。

1.2 細胞培養將A549 細胞置于含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養基（含1%青霉素和1%鏈霉素）中，置于5% CO2、37 ℃飽和濕度的孵箱中常規培養。

1.3 siRNA 轉染和分組選取對數生長期細胞，以2.5×105個/孔的密度接種于6 孔細胞培養板，待細胞達到30%～50%融合時行siRNA 轉染。轉染步驟按照LipofectamineTM2000 說明書進行，分別于轉染后6 h 更換為含血清的DMEM 培養基。實驗分為空白對照組、si-NC 組（轉染對照siRNA）和si-FOXP3 組（轉 染FOXP3 siRNA）。si-NC 序列： 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3'；si-FOXP3 序 列：5'-CAUGGACUACUUCAAGUUCdTdT-3'。

1.4 免疫熒光法檢測各組A549 細胞中FOXP3 表達情況0.25% 胰酶消化轉染48 h 的各組細胞，滴于6 孔細胞培養板中的蓋玻片上進行爬片。次日，PBS 緩沖液洗滌細胞玻片，80%乙醇4 ℃孵育10 min；PBS 緩沖液洗滌3 次，加入細胞打孔液室溫孵育20 min；加入 anti-FOXP3 一抗 4 ℃過夜；次日PBS 緩沖液洗滌3 次，加入FITC 熒光標記的二抗 37 ℃避光孵育 1 h；PBS 緩沖液洗滌3 次，DAPI 染核 5 min，封片后在熒光顯微鏡下拍攝并采集圖像。以免疫熒光強度代表FOXP3 表達水平。

1.5 Western blotting 法 檢 測各組A549 細胞中FOXP3、P-gp、Notch1 和Hes1 蛋白表達水平收集轉染72 h 的各組細胞，加入細胞裂解液裂解細胞并提取細胞總蛋白，BCA 蛋白試劑盒定量檢測蛋白，沸水浴中煮沸6 min 使蛋白變性。每孔加入30 μg蛋白，行10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用濕轉方式將蛋白移至PVDF 膜，5% BSA 室溫下封閉1 h 后 分 別 滴 加 一 抗 FOXP3（1∶500）、P-gp（1∶1 000）、Notch1（1∶1 000）、Hes1（1∶1 000）和GAPDH （1∶1 000），4 ℃過 夜。TBST 溶 液 清洗3 次 后 室 溫 孵 育 HRP 標 記 的 IgG 抗 體（1 ∶3 000）1 h，加入ECL 顯色底物，采用凝膠成像系統拍照，實驗重復3 次。采用Image J 軟件分析各條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 蛋白條帶灰度值。

1.6 CCK-8 法檢測各組A549細胞增殖活性

0.25%胰酶消化轉染24 h 的各組細胞，以5×103個/孔的密度接種于96 孔細胞培養板中，每組設3 個復孔。次日于各組細胞中分別加入不同濃度（0.5～8.0 mg·L－1） Dox，培 養48 h 后 每 孔 加 入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃ 孵育2 h。采用酶標分析儀在450 nm 波長處測量各孔吸光度（A）值，計算各組細胞增殖活性。細胞增殖活性= （給藥組平均A 值/對照組平均A 值） ×100%。采用SPSS 17.0 統計軟件中的Probit 回歸模型計算Dox 對細胞的 半 數 抑 制 濃 度 （half maximal inhibitory concentration， IC50）值。

1.7 Western blotting 法檢測DAPT 作用后各組A549 細 胞 中FOXP3、P-gp、Notch1 和Hes1 蛋 白 表達水平將對數生長期的A549 細胞，以每孔5×105個細胞的密度接種于6 孔細胞培養板中，每組設3 個復孔。次日各組細胞中分別加入0、10 和20 μmol·L－1DAPT， 作 為0、 10 和20 μmol·L－1DAPT 組，檢測各組A549 細胞中FOXP3、P-gp、Notch1 和Hes1 蛋白表達水平。另取A549 細胞，分別加 入0 μ mol·L－1DAPT、1.0 mg·L－1Dox 和1.0 mg·L－1Dox 聯 合10 μ mol·L－1DAPT，作 為0 μ mol·L－1DAPT 組、 1.0 mg·L－1Dox 組 和1.0 mg·L－1Dox 聯合10 μmol·L－1DAPT 組。培養48 h，采用“1.5”中的方法檢測各組A549 細胞中目的蛋白表達水平。

1.8 統計學分析采用SPSS 17.0 統計軟件進行統計學分析。各組細胞增殖活性，細胞中FOXP3、Notch1、Hes1 和P-gp 蛋白表達水平均符合正態分布，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組A549 細胞中FOXP3 蛋白表達水平免疫熒光法檢測各組細胞中FOXP3 蛋白表達，結果顯示FOXP3 標記的免疫熒光強度明顯減弱，見圖1。Western blotting 法檢測結果顯示：與空白對 照 組（0.62±0.05） 和si-NC 組（0.58±0.04）比較，si-FOXP3 組A549 細胞中FOXP3 蛋白表達水平（0.21±0.03）明顯降低（P<0.01）。

圖1 免疫熒光法檢測各組A549 細胞中FOXP3 蛋白表達Fig.1 Expressions of FOXP3 in A549 cells in various groups detected by immunofluorescence method

2.2 各組A549 細胞增殖活性和IC50值CCK-8 法檢測結果顯示：在0.5～8.0 mg·L－1范圍內，Dox呈濃度依賴性抑制各組A549 細胞增殖活性。在Dox≥1.0 mg·L－1時，與空白對照組和si-NC 組比較，si-FOXP3組細胞增殖活性明顯降低（P<0.05或P<0.01）；si-FOXP3 組IC50值（3.64 mg·L－1±0.44 mg·L－1）明顯低于空白對照組（5.94 mg·L－1±0.50 mg·L－1） 和 si-NC 組 （5.69 mg·L－1±0.41 mg·L－1）（P<0.01）。見圖2。

圖2 CCK-8 法檢測各組A549 細胞增殖活性和IC50值Fig.2 Proliferation activities of A549 cells and IC50 values in various groups detected by CCK-8 method

2.3 各 組A549 細胞中Notch1、Hes1 和FOXP3 蛋白表達水平Western blotting 法檢測結果顯示：與空白對照組和si-NC 組比較，si-FOXP3 組A549 細胞中Notch1、Hes1 和FOXP3 蛋白表達水平明顯降低 （P< 0.01）。見圖3。

圖3 Western blotting 法檢測各組A549 細胞中Notch1、Hes1 和FOXP3 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.3 Electrophoregram（A） and histogram（B） of expressions of Notch1,Hes1,and FOXP3 proteins in A549 cells in various groups detected by Western blotting method

2.4 DAPT 處理后各組A549 細胞中Notch1、Hes1和FOXP3 蛋白表達水平與0 μmol·L－1DAPT 組比 較，10 和20 μmol·L－1DAPT 組A549 細 胞 中Notch1、Hes1 和FOXP3 蛋白表達水平明顯降低（P<0.01），呈劑量依賴性。見圖4。

圖4 Western blotting 法檢測DAPT 處理后各組A549 細胞中Notch1、Hes1 和FOXP3 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.4 Electrophoregram（A） and histogram（B） of expressions of Notch1,Hes1,and FOXP3 proteins in A549 cells in various groups after treated with DAPT detected by Western blotting method

2.5 Dox 單獨及聯合DAPT 處理后各組A549 細胞中FOXP3、P-gp、Notch1 和Hes1 蛋白表達水平與

0 μmol·L－1DAPT 組 比 較，1.0 mg·L－1Dox 組A549 細 胞 中FOXP3、P-gp、Notch1 和Hes1 蛋 白表 達 水 平 明 顯 升 高（P<0.01）；與1.0 mg·L－1Dox 組 比 較，1.0 mg·L－1Dox 聯 合10 μmol·L－1DAPT 組A549 細 胞 中FOXP3、P-gp、Notch1 和Hes1 蛋白表達水平明顯降低（P<0.01）。見圖5。

圖5 Dox 單獨和聯合DAPT 作用后各組A549 細胞中FOXP3、P-gp、Notch1 和Hes1 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.5 Electrophoregram（A） and histogram（B） of expressions of FOXP3，P-gp，Notch1,and Hes1 proteins in A549 cells in various groups after treated with Dox alone or in combination with DAPT

3 討 論

研究［4-11，16-18］顯示：FOXP3 在Tregs 和腫瘤細胞中呈高表達，不僅參與腫瘤的侵襲和轉移，還與化療耐藥關系密切。胃癌晚期患者接受新輔助化療后，外周血和腫瘤組織中Tregs 數明顯減少，患者生存期提高，表明腫瘤患者體內FOXP3+Tregs 數可影響化療效果［16-17］。LIANG 等［18］研究顯示：化療藥物替莫唑胺作用后，FOXP3 過表達的膠質母細胞瘤細胞IC50值升高，表明FOXP3 參與替莫唑胺的耐藥作用。本課題組前期研究［9-10］顯示：FOXP3 沉默的人NSCLC A549 細胞對順鉑和5-氟尿嘧啶的化療敏感性增加，FOXP3 過表達小鼠Lewis 肺癌細胞對Dox 和絲裂霉素C 的化療敏感性降低［11］，上 述結果表明FOXP3 參與NSCLC 細胞對化療藥物的抵抗作用，但其作用機制尚不明確。因此，本研究選擇Dox 作為代表性化療藥，采用siRNA 法沉默A549 細胞中FOXP3 基因，驗證其對Dox 耐藥性的影響并探討其相關機制。本研究結果顯示：不同濃度Dox 作用后， A549 細胞的活性和IC50值明顯降低，表明FOXP3 表達下調可提高NSCLC 細胞對Dox 的敏感性，改善對Dox 的耐藥作用。

腫瘤細胞中Notch1 信號通路的異常活化不僅參與腫瘤的侵襲和轉移等惡性行為，還與化療藥物的 耐 藥 作 用 密 切 相 關［12-13］。 研 究［19-20］顯 示：Notch1 信號通路參與順鉑的耐藥作用，抑制Notch1 信號通路可增強順鉑對卵巢癌細胞和三陰性乳腺癌細胞的敏感性，降低腫瘤細胞對順鉑的化療抵抗。本課題組前期研究［15］顯示：抑制Notch1信號通路后，肺腺癌細胞對順鉑的敏感性明顯增加。此外，Notch1 信號通路還與Dox 的耐藥性關系密切。抑制Notch1 信號通路能增強骨肉瘤細胞對Dox 的化療敏感性，抑制Dox 對骨肉瘤干細胞的富集作用［21］。沉默Notch1 基因可降低肺癌細胞對Dox 的耐藥性，其作用機制與PTEN 表達上調有關［22］。最新研究［23-24］顯示：沉默T 細胞-急性淋巴白血病細胞中FOXP3 表達可下調Notch1 和Hes1 mRNA 表達，阻斷黑色素瘤細胞Notch1 信號通路后FOXP3 表達降低。Hes1 是Notch1 信號通路下游的關鍵靶基因，因此本研究推測FOXP3 介導的Dox 耐藥作用可能與Notch1/Hes1 信號通路有密切聯系，A549 細胞中FOXP3 與Notch1/Hes1 信號通路之間具有雙向調節作用。FOXP3 沉默后，Notch1 和Hes1 蛋白表達水平降低，提示FOXP3 蛋白表達水平可影響Notch1/Hes1 信號通路的活性。Notch1 信號通路抑制劑DAPT 作用后，FOXP3 蛋白表達水平降低，且呈劑量依賴性，且與Notch1和Hes1 下降的趨勢相符，表明Notch1/Hes1 信號通路也可調控FOXP3 表達。

腫瘤細胞高表達P-gp，這是化療耐藥的主要機制之一，P-gp 是跨膜轉運蛋白，作為一種能量依賴的外排泵，能將進入細胞中的化療藥物排出細胞外，從而降低化療效果［25-26］。本課題組前期研究［10，15］顯示：在NSCLC 細胞中，FOXP3 基因沉默和阻斷Notch1 信號通路均可抑制P-gp 表達，由此推測FOXP3 誘導的Dox 耐藥作用可能是通過Notch1/Hes1 信號通路調控P-gp 表達實現的。本研究結果顯示：Dox 處理后，A549 細胞中FOXP3、P-gp、Notch1 和Hes1 蛋白表達水平均升高，而在聯合DAPT 處理后，上述蛋白表達水平均降低，表明Dox 的耐藥作用與FOXP3 和P-gp 高表達及Notch1/Hes1 信號通路的活化有密切關聯，阻斷Notch1/Hes1 信號通路可逆轉Dox 誘導的FOXP3和P-gp 高表達。因此，Notch1/Hes1 信號通路可能通過調控P-gp 表達參與FOXP3 介導的Dox 耐藥作用。

綜上所述，FOXP3 基因沉默可提高NSCLC 細胞對Dox 的敏感性，其作用機制與抑制Notch1/Hes1 信號通路有關。本研究結果不僅為FOXP3 參與NSCLC 化療耐藥提供了新的理論， 也為NSCLC 的靶向治療提供了潛在的分子靶點。