紅景天苷對高原紅細胞增多癥模型大鼠骨髓CD71+有核紅細胞凋亡的影響

郭 勇, 王生艷, 易靜靜, 崔 森

（1.青海大學研究生院，青海 西寧 810000；2.青海衛生職業技術學院臨床醫學系，青海 西寧 810000；3.青海大學附屬醫院血液科，青海 西寧 810000）

高 原 紅 細 胞 增 多 癥 （high altitude polycythemia，HAPC）是長期生活在海拔2 500 m以上的人群在適應高原低氧環境失敗而導致紅細胞過度積累的疾病，以頭暈、頭痛、呼吸困難、乏力和睡眠障礙等為特征，主要表現為紅細胞（red blood cells，RBC） 數、血 紅 蛋 白（hemoglobin，Hb）水平和紅細胞比容（hematokrit，HCT）水平升高［1-2］。HAPC 患者主要為高原移居人群，隨著越來越多的人群移居高原，HAPC 發病率也逐漸升高，但其具體發病機制尚未完全闡明，目前其預防和治療也無針對性的方法。目前國內外關于HAPC患者細胞凋亡和增殖失衡方面的相關報道仍較少，對其機制的研究也不夠深入。

紅景天苷是從紅景天類植物中提取的主要成分，其具有廣泛的藥用價值，不僅在抗炎、抗毒、抗衰老、抗疲勞、抗氧化、減少自由基和抗凋亡等方面發揮重要作用，還可以治療多種慢性疾?。?］。有研究［4］顯示：紅景天苷可能通過抑制HAPC 大鼠體內促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）的分泌，降低HAPC 大鼠的RBC 數、Hb 水平、HCT水平和血漿黏滯度，從而改善缺氧。紅景天苷還可以使HAPC 大鼠紅細胞膜的流動性增強，提高紅細胞的變形能力，加快血流速度，同時通過改變紅細胞膜的成分來調節RBC 的功能，從而緩解HAPC 癥 狀［5］。目 前 紅 景 天 苷 防 治HAPC 和 抑 制骨髓象紅細胞（紅系細胞）過度代償性增生的機制尚未完全明確，而紅景天苷對HAPC 骨髓紅系細胞凋亡作用機制方面也暫無相關報道。

轉鐵蛋白CD71 在紅系細胞的各個分化階段均有表達，是確定的紅系細胞的特異性標志物，常被用以標記紅系細胞在體內的動態成熟過程。采用被CD71+標記過的有核RBC 可以更加直觀地觀察骨髓紅系細胞造血功能的動態變化。本研究以HAPC模型大鼠骨髓CD71+有核RBC 為材料，檢測紅景天苷對HAPC 模型大鼠骨髓CD71+有核RBC 百分率、細胞凋亡率、線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）、含半胱氨酸的天冬氨酸 蛋 白 水 解 酶 3 （cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）、B 細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相 關X 蛋 白（Bcl-2 associated X protein，Bax）和含半胱氨酸的天冬氨酸 蛋 白 水 解 酶 9 （cysteinyl aspartate specific proteinase-9，Caspase-9）等蛋白表達水平的影響，探討紅景天苷對HAPC 患者RBC 過度積累的保護效應的機制，為紅景天苷的臨床應用研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥物、主要試劑和儀器本研究獲青海大學附屬醫院倫理委員會批準（倫理批號：PSL-2022-044），遵循國際疼痛研究協會的倫理指南。45 只健康SD 雄性大鼠，6 周齡，體質量為180～220 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產許可證號：SCXK（京） 2021-0006，動物質量合格證號：110011210109392813。紅景天苷（純度>95%，美國麥克林試劑公司）。BCA 蛋白定量試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司），Caspase-9、Bcl-2 和Bax 及HRP-羊抗兔/小鼠二抗（武漢博士德生物工程有限公司）。流式細胞儀（美國艾森生物有限公司），低溫高速離心機（德國 Eppendorf 公司），Nano Drop 微量分光光度計（賽默飛世爾科技有限公司），蛋白電泳儀和全自動凝膠成像分析系統（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 實驗動物分組、模型制備和給藥處理45 只SD 雄性大鼠隨機分為對照組、模型組和藥物組，每組15 只。對照組大鼠在實驗室內以普通環境飼養，參考文獻［6-7］建立HAPC 大鼠模型，實驗室海拔1 500 m 藥物組和模型組大鼠在低壓氧艙內模擬海拔5 000 m 條件，溫度為20 ℃～26 ℃，相對濕度為40%～70%，自由進食飲水，連續飼養28 d。3 組大鼠均采用灌胃給藥的方式，藥物組大鼠給予0.15 g·kg－1·d－1紅景天苷，對照組和模型組大鼠均給予0.9%等體積NaCl 溶液，每日1 次，連續28 d。

1.3 采血和骨髓收集采用1% 戊巴比妥鈉（0.04 g·kg－1）腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠無角膜反射和收縮反應后，經腹主動脈于EDTA 抗凝管采血2 mL，采用全自動獸血細胞儀檢測大鼠血常規。記錄大鼠外周血中RBC 數、Hb 水平和HCT水平，采用1×PBS 溶液沖洗大鼠雙后肢股骨和脛骨中骨髓液，過濾備用。

1.4 密度梯度離心法分離各組大鼠骨髓單個核細胞（bone marrow mononuclear cells，BMMNCs）和免疫磁珠法分選骨髓CD71+有核RBC將骨髓液以1 500 r·min－1室溫離心5 min 后棄去上清液，沉淀中加入2～3 mL 1×PBS 溶液混勻稀釋，再加入等體積大鼠骨髓淋巴細胞分離液，以2 000 r·min－1室溫離心20 min 后吸取單個核細胞，反復洗滌后離心備用。將BMMNCs 重懸于100 μL buffer 液中，加入FITCCD71 兔抗鼠單克隆抗體，4 ℃避光孵育10 min；加入5 mL buffer 液，1 500 r·min－1室溫離心10 min 后棄上清；加入180 μL buffer 液和20 μL抗FITC 免疫磁珠，混勻后4 ℃避光孵育10 min；洗滌后將細胞懸液加入MS 分選柱，待液體通過分選柱后采用1 mL buffer 液沖洗后在柱中加入3 mL buffer 液，采用分選柱活塞快速將其沖入15 mL 離心管中，得到大鼠骨髓CD71+細胞。

1.5 流式細胞術檢測各組大鼠骨髓CD71+有核RBC 百分率和細胞凋亡率調整BMMNCs 濃度至1×106mL－1，取100 μL BMMNCs 置于流式管中，分別加入CD71 單克隆抗體和Annexin Ⅴ- FITC，室溫下避光孵育15 min，采用流式細胞術檢測20 000 個BMMNCs 中CD71+細胞數、CD71+細胞百分率和CD71+有核RBC 凋亡率。

1.6 流式細胞術檢測各組大鼠骨髓CD71+有核RBC 中MMP 水平按照JC-1MMP 檢測試劑盒配制工作液，將1×106mL－1BMMNCs 懸液加入工作液混勻，37 ℃孵育15 min 后加入1×Assay buffer，室溫2 000 r·min－1、離心5 min 棄上清后上機檢測。參考其他熒光設置，在MMP 水平升高時，JC-1 以聚集體的形式分布于線粒體基質中，發出紅色熒光；當MMP 水平降低時，JC-1 聚集體從線粒體中釋放出來，形成單體，產生綠色熒光。

1.7 流式細胞術檢測各組大鼠骨髓CD71+有核RBC 中Caspase-3 蛋白表達水平調整BMMNCs濃度至1×106mL－1，取100 μL 置于流式管中，加入CD71 抗體，室溫下避光孵育15 min 后加入1×PBS 溶液，以1 500 r·min－1、離心5 min，共2 次，加入500 μL fixed/permeabilized 液 避 光 4 ℃孵 育20 min；加 入500 μL Perm/WashTM buffer，離 心后棄上清，加入Caspase-3 抗體室溫避光孵育30 min；清洗后加入500 μL Perm/WashTM buffer重懸上機檢測。

1.8 Western blotting 法檢測各組大鼠骨髓CD71+有核RBC 中Bcl-2、Bax 和Caspase-9 蛋白表達水平將保存于液氮中的大鼠骨髓CD71+有核RBC，采用預冷裂解液裂解，12 000 r·min－1、4 ℃離心10 min 后取上清。按照BCA 蛋白定量試劑盒方法檢測吸光度（A）值，采用標準曲線公式計算樣品濃度，根據不同濃度計算上樣體積。30 μg 蛋白上樣，80 ～130 V 電壓進行電泳，200 mA 恒流轉膜；1×TBST 溶液搖床清洗5 min，共3 次，5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，1×TBST 溶液清洗3 次，4 ℃一抗（1∶1 000 稀釋） 孵育過夜，洗膜3 次，每次10 min；室溫孵育二抗（1∶10 000 稀釋）1 h，洗膜3 次，每次10 min。將PVDF 膜與ECL 發光液反應2 min，采用化學發光凝膠成像系統曝光并拍照記錄，采用Image J 軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平＝目的蛋白條帶灰度值/內參β-actin 條帶灰度值。

1.9 統計學分析采用SPSS 25.0 統計軟件進行統計學分析。各組大鼠外周血RBC 數、Hb 水平和HCT 水平，大鼠骨髓CD71+有核RBC 百分率，CD71+有核RBC 凋亡率，CD71+有核RBC 中MMP 水平，CD71+有核RBC中Caspase-3、Bcl-2、Bax 和Caspase-9 蛋白表達水平為計量資料，服從正態分布，以-±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠外周血中RBC 數、Hb 水平和HCT水平與對照組比較，模型組大鼠外周血中RBC數、Hb 水平和HCT 水平均明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，藥物組大鼠外周血中RBC數、Hb 水平和HCT水平均明顯降低（P<0.01）。見表1。

表1 各組大鼠外周血中RBC 數、Hb 水平和HCT 水平Tab.1 Counts of RBC, levels of Hb and HCT in peripheral blood of rats in various groups (n=15，-±s）

表1 各組大鼠外周血中RBC 數、Hb 水平和HCT 水平Tab.1 Counts of RBC, levels of Hb and HCT in peripheral blood of rats in various groups (n=15，-±s）

*P<0.01 compared with control group；△P<0.01 compared with model group.

Level of HCT（η/%）35.99±2.71 59.53±5.31*52.59±3.66△134.50<0.001 Group Control Model Drug F P Count of RBC（×1012 L－1）5.24±0.37 8.79±0.52*7.22±0.60△187.08<0.001 Level of Hb[ρB/（g·L－1）]131.93±10.19 218.33±17.49*190.73±10.73△166.98<0.001

2.2 各組大鼠骨髓CD71+有核RBC 百分率和CD71+有核RBC凋亡率與對照組比較，模型組大鼠骨髓CD71+有核RBC 百分率和CD71+有核RBC 凋亡率均升高（P<0.01）；與模型組比較，藥物組大鼠骨髓CD71+ 有核RBC 百分率和CD71+有核RBC 凋亡率均降低（P<0.01）。見表2 和圖1。

圖1 流式細胞術檢測各組大鼠骨髓CD71+有核RBC 百分率、細胞 凋 亡 率 和CD71+ 有 核RBC 中MMP 水平及Caspase-3 蛋白表達水平Fig.1 Pecentages and apoptotic rates of CD71+ nucleated RBC, levels of MMP,and expression levels of Caspase-3 protein in CD71+ nucleated RBC detected by flow cytometry

表2 各組大鼠骨髓CD71+有核RBC 百分率、CD71+有核RBC 凋亡率和CD71+有核RBC 中MMP 水平及Caspase-3 蛋白表達水平Tab.2 Pecentages and apoptotic rates of CD71+ nucleated RBC, levels of MMP and expression levels of Caspase-3 protein in CD71+ nucleated erythrocytes of rats in various groups (n=6，-±s）

表2 各組大鼠骨髓CD71+有核RBC 百分率、CD71+有核RBC 凋亡率和CD71+有核RBC 中MMP 水平及Caspase-3 蛋白表達水平Tab.2 Pecentages and apoptotic rates of CD71+ nucleated RBC, levels of MMP and expression levels of Caspase-3 protein in CD71+ nucleated erythrocytes of rats in various groups (n=6，-±s）

*P<0.01 compared with control group；△P<0.05，△△P<0.01 compared with model group.

Group Apoptotic rate（η/%）MMP（η/%）Caspase-3 protein Control Model Drug F P Pecentage of nucleated RBC（η/%）15.98±3.58 27.12±2.64*22.73±1.06△28.10<0.001 32.91±1.38 50.52±2.28*3.28±2.13△△830.58<0.001 28.50±5.00 40.65±5.15*1.17±0.55△△7.46<0.001 82.01±2.78 80.32±4.44 91.24±10.95△7.39 0.20

2.3 各組大鼠骨髓CD71+有核RBC 中MMP 水平和Caspase-3 蛋白表達水平與對照組比較，模型組大鼠骨髓CD71+有核RBC 中MMP 水平差異無統計學意義（P>0.05），Caspase-3 蛋白表達水平升高（P<0.01）；與模型組比較，藥物組大鼠骨髓CD71+有核RBC 中MMP 水平升高（P<0.05），Caspase-3 蛋白表達水平降低（P<0.01）。見表2 和圖1。

2.4 各組大鼠骨髓CD71+有核RBC 中Bcl-2、Bax和Caspase-9 蛋白表達水平與對照組比較，模型組大鼠骨髓CD71+有核RBC 中Bax 和Caspase-9蛋白表達水平升高（P<0.05）；與模型組比較，藥物組大鼠骨髓CD71+有核紅細胞中Bax 和Caspase-9 蛋白表達水平降低（P<0.01）。各組大鼠骨髓CD71+有核RBC 中Bcl-2 蛋白表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。見表3 和圖2。

圖2 Western blotting 法檢測各組大鼠骨髓CD71+有核RBC 中Bcl-2、Bax 和Caspase-9 蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of Bcl-2，Bax，and Caspase-9 proteins in CD71+ nucleated RBC of rats in various groups detected by Western blotting method

表3 各組大鼠骨髓CD71+有核RBC 中Bcl-2、Bax 和Caspase-9 蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of Bcl-2，Bax，and Caspase-9 proteins in CD71+ nucleated RBC of rats in various groups(n=9，-±s）

表3 各組大鼠骨髓CD71+有核RBC 中Bcl-2、Bax 和Caspase-9 蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of Bcl-2，Bax，and Caspase-9 proteins in CD71+ nucleated RBC of rats in various groups(n=9，-±s）

*P<0.05 compared with control group；△P<0.01 compared with model group.

Caspase-9 protein 1.45±0.38 1.85±0.20*0.94±0.47△12.696<0.001 Group Control Model Drug FP Bcl-2 protein 0.93±0.37 0.92±0.36 0.53±0.27 3.27 0.06 Bax protein 0.59±0.11 1.05±0.53*0.32±0.17△10.109 0.01

3 討 論

HAPC 是一種常見的慢性高原病，會導致慢性肺源性心臟?。ê喎Q肺心?。┖托牧λソ?，危及患者生命，但其致病機制至今尚未完全明確。本研究結果顯示：與對照組比較，模型組HAPC 大鼠的RBC 數、Hb 水平、HCT 水平和骨髓CD71+有核RBC 百分率明顯升高，HAPC 大鼠CD71+有核RBC 凋亡率、CD71+有核RBC 中Caspase-3、Bax和Caspase-9 表達水平升高，MMP 水平降低，提示成功制備HAPC 模型，表明大鼠為了適應低壓低氧環境，骨髓紅系細胞增殖增多，從而生成更多的RBC 及Hb 以 提 高 攜 氧 能 力， 本 研 究 結 果 與董旭等［8］報道結果一致。有研究［9］也同樣證明了上述觀點。HAPC 大鼠CD71+有核RBC 凋亡率與CD71+有核RBC 中促凋亡蛋白的表達均升高，提示骨髓RBC 凋亡升高在HAPC 中RBC 過度積累機制中具有一定作用，與RBC 增殖增強發揮協同作用，與MA 等［10］研究結果一致。廖瑜等［11］通過檢測12 只低氧干預小鼠BMMNCs 中CD71+ 和Ter119+細胞凋亡率結果顯示：低氧組小鼠CD71+和Ter119+細胞凋亡率高于對照組，表明在低氧條件下，骨髓RBC 凋亡的增加在HAPC 的疾病發生發展中發揮重要作用。線粒體在細胞凋亡過程中發揮重要作用，作為提供能量的場所，其參與體內的多種氧化應激反應。線粒體結構和形態會隨著環境的變化而改變，故而對各種損傷較敏感，特別是低氧導致的損傷，常表現為線粒體腫脹［12-13］。當線粒體受到外界低氧刺激時，線粒體膜通透性增加，MMP 水平升高［14］。細胞色素c（cytochrome c，Cyt-c） 是由線粒體釋放的一種促凋亡蛋白，在由線粒體介導的細胞凋亡途徑中發揮重要作用。Bcl-2 家族成員形成的通道是Cyt-c 釋放的主要途徑。Bcl-2 家族成員主要是代表抗細胞凋亡的Bcl-2 蛋白和促細胞凋亡的Bax 蛋白。細胞質中Bax 蛋白受到凋亡刺激時會引起線粒體膜的通透性增加，釋放線粒體內膜上的Cyt-c 到細胞質中，然后與同樣存在于細胞質中的凋亡酶激活因子1（apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1） 結合，誘導并催化Caspase-9 活化，再進一步激活凋亡效應蛋白酶Caspase-3，促進細胞凋亡［15］。Bcl-2家族成員在線粒體介導的細胞凋亡途徑中起雙向調控的作用。Bcl-2 可以與B 細胞淋巴瘤xl（B-cell lymphoma-xl， Bcl-xl）、 凋 亡 蛋 白 激 活 因 子1（apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1） 及Caspase-9 結合形成復合物，使Apaf-1 構型發生改變，從而使Cyt-c 釋放減少，抑制細胞凋亡［16］。Bcl-2 相關啟動子（Bcl-2 asociated death promoter，Bad） 可以通過去磷酸化后改變構型與Bax-Bcl-xl二聚體的Bcl-xl結合而釋放出Bax，隨后釋放Cyt-c，進而導致細胞凋亡［17］。Bid 在JNK 信號通路作用下形成jBid，促進線粒體釋放促凋亡因子（second mitochondria -derived activator of Caspases，Smac），激活Caspase-8，隨后直接激活Caspase-3 誘導細胞凋亡；被激活的Caspase-8 還可以裂解Bid 形成tBid，促進線粒體釋放Cyt-c，激活Caspase-9 或Caspase-3 后 誘 導 細 胞 凋 亡［18］。Bim 蛋 白 是 一 種BH3-only 蛋白，BH3 結構域在細胞凋亡起始過程中起關鍵作用，Bim 可以通過促進Cyt-c 和Smac 等的釋放導致細胞凋亡［19］。

本研究結果顯示：在紅景天苷的作用下，HAPC 大鼠外周血中RBC 數、Hb 水平和HCT 水平及骨髓CD71+有核RBC 百分率降低，CD71+有核RBC 凋亡率、CD71+有核RBC 中Caspase-3、Bax 和Caspase-9 蛋白表達水平均降低，MMP 水平升高，提示紅景天苷可能通過抑制凋亡的方式參與HAPC 的調控，并改善大鼠在低氧條件下引起的紅細胞積累。研究［20-21］顯示：紅景天苷能夠降低HAPC 大 鼠 的RBC 數、Hb 水 平、HCT 水 平 和 血 液黏滯度，同時降低HAPC 大鼠的EPO 水平，抑制RBC 過度增生，達到改善或者預防HAPC 的作用。研究［22］顯示：紅景天苷可以通過抑制Bim 及其下游蛋白（Bax 及裂解的Caspase-3）表達來抑制近端腎小管細胞的凋亡；紅景天苷可以通過抑制相關信號傳導途徑來緩解缺氧大鼠神經干細胞凋亡［23］；紅景天苷可通過減少Cyt-c 釋放，裂解Caspase-9 或Caspase-3 來抑制股骨頭的骨細胞凋亡，誘導成骨細胞的生成［24］。鄔玫竹等［25］研究顯示：紅景天苷能夠通過降低活性氧水平，升高MMP 水平，增加Bcl-2 蛋白表達，減少Bax 和Caspase-3 蛋白表達來降低心肌細胞的凋亡水平。張常銀等［26］研究顯示：紅景天苷能夠通過降低Caspase-3 表達水平來降低不育癥大鼠睪丸生精細胞的凋亡。魏玉萍等［27］研究顯示：紅景天苷可以通過上調Bcl-2 基因表達水平，下調Bax 基因表達水平來抑制阿糖胞苷誘導的人骨髓間充質干細胞凋亡。上述研究結果均表明：紅景天苷通過抑制細胞凋亡的方式發揮作用，與本研究的結果一致，紅景天苷通過抑制HAPC 大鼠骨髓CD71+有核RBC 凋亡的方式，對HAPC 大鼠的發病過程起預防和保護作用。

本研究探討了紅景天苷對HAPC 模型大鼠骨髓CD71+有核RBC 凋亡的影響，發現HAPC 大鼠骨髓有核RBC 凋亡增加，提示凋亡途徑在HAPC的發病機制中發揮作用。紅景天苷可有效抑制低氧條件下大鼠骨髓有核RBC 凋亡增加，提示紅景天苷可能通過抑制凋亡的方式對HAPC 模型大鼠的發病過程起預防和保護作用。本研究為HAPC 的發病機制和臨床干預提供了科學依據。