色甘酸二鈉對大鼠腦缺血/再灌注損傷的改善作用及其機制

朱 嫻, 陳薪旭, 陳奕斌, 黎昌炫, 劉 杰, 王 埮

（海南醫學院第一附屬醫院神經內科，海南 海口 570102）

缺血性卒中（cerebral ischemic stroke，CIS）是一種由大腦供血動脈狹窄或閉塞造成腦供血不足進而引起腦組織壞死的腦血管病［1］。海馬神經元易受CIS 影響而產生損傷，引起患者情緒失控，遠期出現運動功能障礙等癥狀［2］。CIS 造成大量神經元損傷的同時，也會啟動病灶周圍組織再生反應。有學者［3］認為：內源性神經干細胞快速增殖并遷移至受損腦組織是發揮組織重構和神經修復作用的基礎。然而，這種內源性修復功能不足以使神經功能完全恢復。因此，如何快速恢復海馬區神經元增殖是CIS 溶栓后治療的關鍵。

肥大細胞（mast cells，MCs）是血液中廣泛存在的一類粒細胞，能夠根據局部環境和激活狀態改變自身表型。既往研究［4］顯示：幼鼠圍手術期缺血后，MCs 經血-腦屏障進入中樞神經系統，可誘導小膠質細胞活化和炎癥反應，造成幼鼠腦神經元發育受阻。色甘酸二鈉（sodium cromoglycate，SCG）是一類抑制MCs 脫粒和遷移的藥物［5］，可減少CIS 溶栓大鼠模型中性粒細胞進入腦實質，降低模型大鼠死亡率，減輕大鼠海馬、丘腦及大腦皮質 區 域 損 傷［6］。目 前，有 關SCG 對CIS 溶 栓 治 療后神經元新生的影響尚不清楚。本研究采用線栓法構建大鼠腦缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷模型模擬靜脈溶栓，探討SCG 對I/R 大鼠腦組織神經元新生的作用，為研究SCG 在CIS 治療中的作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器80 只SD 大鼠由海南藥物研究所有限責任公司提供，無特定病原體動物（specific pathogen free，SPF） 級，雄性，8 周齡，動物生產許可證號：SCXK （瓊） 2020-0007，體質量170～180 g；大鼠飼養于海南醫學院動物實驗中心SPF 動物房中，飼養條件：溫度22 ℃～26 ℃，濕度30%～70%，12 h/12 h 固定晝夜循環，給予充足的食物和水。腦缺血模型線栓（型號：L3600，廣州佳靈生物技術公司），2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）（批號：133725，美國Sigma 公司），高爾基染色試劑盒（批號：103962，美國Thermo 公司）， 5-溴 脫 氧 尿 嘧 啶 核 苷（5-bromodeoxyuracil nucleoside， BrdU）（批 號：162290，美國Sigma 公司），抗鼠BrdU 抗體（批號：ab0753，英國Abcam 公司），抗鼠雙皮質素抗體（doublecortin，DCX）（批號：5302，美國CST公司），抗鼠腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、抗鼠抗酪氨酸激酶受體B （tyrosine kinase receptor B，TrkB），抗鼠神經生長因子3（neurotrophins-3，NT-3） 和抗鼠抗酪氨酸激酶受體C （tyrosine kinase receptor C，TrkC） 抗體（批號：bs3728、bs2837、bs3822 和bs1535，北京博奧森生物科技公司），辣根氧化酶偶 聯 山 羊 抗 鼠/兔IgG （H+L） 抗 體（批 號：b183237/b277372，上海碧云天生物科技公司）。Y 型迷宮設備（型號：SA204，江蘇賽昂斯公司），倒置熒光顯微鏡（型號：EVOS M5000，美國Thermo 公司），凝膠電泳裝置（型號：Miniprotean Tetra，美國Bio-Rad 公司），化學發光成像儀（型號：1600/1600R，上海天能生物公司），膜片鉗系統（型號：MultiClamp 700B 和MultiClamp 1550B，瑞士Axon 公司），激光掃描共聚焦顯微鏡（型號：CX7 Pro，美國Thermo 公司）。

1.2 實驗動物分組、給藥和模型制備80 只大鼠分為假手術組和I/R 模型組，假手術組18 只，I/R模型組62 只。所有大鼠適應環境喂養1 周，麻醉I/R 模型組大鼠，仰臥位姿勢固定在鼠板上，頸部備皮消毒，切開1 個長度約為2 cm 的切口。沿著肌肉組織分離出左側頸動脈，分別結扎頸總動脈和頸外動脈。在頸總動脈結扎處穿刺開孔，插入腦缺血模型線栓，經頸動脈分叉前進至頸內動脈，繼續推進直至大腦中動脈，深度約為16 mm。此時，大腦中動脈血流被線栓阻塞。持續2 h 后取出線栓，縫合傷口，結扎頸總動脈避免傷口出血。麻醉假手術組大鼠，頸部備皮消毒后分離頸動脈，不進行其他任何處理，縫合傷口，滴加青霉素避免感染。

1.3 改良的神經功能缺損程度評分（modified neurological severity score，mNSS）法評估各組大鼠神經功能建模后24 h 按參考文獻［7］中mNSS法評估大鼠神經功能。行為學實驗包括提尾實驗、運動實驗、感覺實驗、平衡木實驗、反射喪失實驗和不正常運動實驗，總評分為18 分，評分越高代表大鼠神經功能損傷越嚴重。剔除I/R 模型組神經功能評分<6 分（2 只） 和≥15 分（8 只） 及死亡（7 只）大鼠，將造模成功的45 只大鼠隨機分為I/R組、I/R+低劑量（20 mg·kg－1） SCG 組和I/R+高劑量（60 mg·kg－1） SCG 組，每組各15 只。假手術組和I/R 模型組大鼠分別腹腔注射生理鹽水，劑量為10 mL·kg－1，連續腹腔注射2 周。各劑量SCG 組大鼠給予相應劑量SCG，持續2 周。記錄各組大鼠mNSS 評分，評價不同劑量SCG 對大鼠神經功能的影響。

1.4 Y 型迷宮實驗檢測各組大鼠學習記憶能力腹腔給藥2 周后，每組隨機選取12 只大鼠開展Y 型迷宮檢測，檢測期間持續給藥治療。Y 型迷宮各支臂裝有信號燈，設置安全區（無電刺激）與非安全區（電刺激）。隨機確定安全區，測試大鼠電擊回避學習和記憶能力。訓練時，將大鼠置于Y 型迷宮中，以所在支臂為起點，安全區支臂信號燈亮，延遲5 s 啟動電刺激。當大鼠逃避至安全區，并且在信號燈持續時間（10 s） 內不折返至電擊區，記為正確反應，否則記為錯誤反應。大鼠共訓練20 次，記錄正確反應次數，并計算正確反應率，正確反應率=正確反應次數/20×100%，正確反應率可反映大鼠學習能力。將各組大鼠置入Y 型迷宮中，安全區亮燈，記錄各個大鼠到達安全區時間，記為正確反應時間，代表大鼠的記憶能力。

1.5 2，3，5- 氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色法檢測各組大鼠腦梗死區面積完成“Y”型迷宮實驗檢測后，各組隨機取3 只大鼠，取大鼠腦組織，冰箱冷凍成形后切片，約6 片。將切片浸于2%TTC 染色液中，水浴（37 ℃）中避光孵育，期間多次翻片保證染色充分，整個過程共30 min。取出染液中切片，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗后，將切片按順序排列后拍照，計算腦梗死區面積。腦梗死區面積＝白色梗死區域面積/腦組織區域面積。

1.6 長時程增強檢測各組大鼠學習和記憶能力每組隨機選取3 只大鼠以CO2處死，采用PBS緩沖液（4 ℃預冷）經心臟灌流沖盡全身血液后取出完整腦組織，置入冰浴人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF） 中。去除小腦，沿大腦中縫切開左右半球，取缺血側大腦，分離出海馬區組織，切斷海馬傘部，割斷下托，置于預備的瓊脂塊上，將海馬與瓊脂塊固定在切片機標本托上，冰浴ACSF、持續供氧條件下，將海馬沿長軸切出厚度為400 μm 的切片。轉移切片至ACSF 中平衡，以聚四氟乙烯涂層的鎢絲電極為刺激電極，以充滿 ACSF 的玻璃微電極為記錄電極，插入腦組織海馬CA1 區謝氏側支或者CA3 區錐體細胞發出的軸突通路，通電刺激后引發場興奮性突觸后電位（field excitatory postsynaptic potential，fEPSP）。調整電極位置和刺激強度以誘發不同fEPSP，設基線為200 μA 下最大值信號強度的40%。固定電極和刺激強度，穩定記錄20 min。更換更高頻率刺激誘發長時程電位增強（long term potentiation，LTP），連續給予20 串刺激，每串包含200 個脈沖，頻率為200 Hz，波寬200 μ s，串間隔30 s，穩定記錄60 min。計算每分鐘神經興奮性突觸后fEPSP 斜率和高頻刺激后fEPSP。

1.7 高爾基染色檢測各組大鼠腦組織中海馬齒狀回區樹突棘密度每組隨機取3 只大鼠以CO2處死，采用PBS 緩沖液（4 ℃預冷）經心臟灌流沖盡全身血液后取出完整腦組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h。取出腦組織，梯度乙醇脫水，浸泡入溶液1 與溶液2 的混合液中冷藏14 d（溶液1、2、3、4 和5 均為高爾基染色試劑盒中試劑）。取出腦組織浸入溶液3 冷藏48 h，置入異戊烷中包埋，冷凍后切成，片厚為10 μm，轉移至載玻片。載玻片上滴加溶液4 與溶液5 混合液反應30 min。蒸餾水沖洗，最后采用不同濃度乙醇脫水，分別采用二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ溶液透化，以中性樹膠封片。置于激光共聚焦顯微鏡下觀察各組大鼠腦組織中海馬齒狀回區神經元每50 μm 長度的樹突上樹突棘數，即為樹突棘密度。

1.8 免疫熒光法檢測各組大鼠腦組織中海馬齒狀回區5-溴脫氧尿苷（5-bromodeoxyuridine，BrdU）陽性細胞數和雙腎上腺皮質激素（doublecortin，DCX）蛋白表達水平各組隨機選取3 只大鼠，連續腹腔注射50 mg·kg－1BrdU 3 d 后處死，取腦組織，采用冷凍液包埋后切成約10 μm 厚切片。將切片置于染缸中滴加丙酮甲醇混合溶液（1∶1）浸沒，固定20 min。取出切片貼于載玻片上，浸沒于山羊血清中封閉60 min。PBS 緩沖液清洗，切片上滴加兔源抗鼠BrdU 抗體與鼠源抗鼠DCX 抗體稀釋液，4 ℃孵育過夜。PBS 緩沖液清洗，滴加Alexa Fluor 555 山羊抗兔IgG（H+L）或Alexaflour 488山羊抗鼠IgG（H+L）二抗稀釋液。室溫避光孵育1 h，滴加DAPI 染色液孵育20 min，再滴加抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察。采用Image Pro Plus 6.0統計軟件計算海馬齒狀回區BrdU陽性細胞數，掃描得到DCX 平均熒光強度，以DXC 平均熒光強度代表DCX蛋白表達水平。

1.9 Western blotting 法檢測各組大鼠大腦海馬組織 中BDNF、TrkB、NT-3 和TrkC 蛋 白 表 達 水 平

每組取3 只大鼠，處死后取缺血側基底節區，加入RIPA 裂解液勻漿，靜置30 min。4 ℃離心（12 000 r·min－1、30 min）吸取上清液，檢測蛋白濃度并加入上樣緩沖液，加熱10 min 使蛋白變性。取凝膠上樣并開啟電泳，通過濕法轉膜法轉移凝膠條帶蛋白至PVDF 膜上。取出PVDF 膜，脫脂奶粉封閉，分別加入抗鼠BDNF、抗鼠TrkB、抗鼠NT-3 與抗鼠TrkC 抗體孵育過夜，次日PBS 緩沖液洗凈一抗，加入辣根氯化酶偶聯山羊抗鼠/兔IgG（H+L）抗體室溫孵育。條帶上滴加增強型化學發光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色液，化學發光成像儀下獲得各個蛋白條帶，以β-actin作為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參條帶灰度值。

1.10 統計學分析采用SPSS 22.0 統計軟件進行統計學分析。各組大鼠神經功能評分和腦梗死面積，正確反應率和正確反應時間，fEPSP 斜率，腦組織中海馬齒狀回區樹突棘密度，腦組織中海馬齒狀回區BrdU 陽性細胞數和DCX 蛋白表達水平，海馬組織中BDNF、TrkB、NT-3 和TrkC 蛋白表達水平均符合正態分布，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠正確反應率和正確反應時間與假手術組比較，I/R 組大鼠正確反應率降低（P<0.05），正確反應時間增加（P<0.05）。與I/R 組比較，I/R+低劑量SCG 組大鼠正確反應率和正確反應時間差異無統計學意義（P>0.05），而I/R+高劑量SCG 組大鼠正確反應率明顯增加（P<0.05）， 正 確 反 應 時 間 明 顯 降 低（P<0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠正確反應率（A）和正確反應時間（B）Fig.1 Accurate reaction rate（A） and accurate reaction time （B）of rats in various groups

2.2 各組大鼠神經功能評分和腦梗死面積與假手術組比較，I/R 組大鼠神經功能評分升高（P<0.05），缺血側出現明顯的梗死區域；與I/R 組比較，I/R+高劑量SCG 組大鼠神經功能評分明顯降低（P<0.05），且腦梗死面積明顯減少（P<0.05）；I/R+低劑量SCG 組大鼠神經功能評分和腦梗死面積與I/R 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖2 和3。

圖2 各組大鼠神經功能評分（A）和腦梗死面積（B）Fig.2 Neurological function scores(A) and cerebral infraction areas(B) of rats in various groups

圖3 TTC 染色法檢測各組大鼠腦梗死面積Fig.3 Cerebral infraction areas of rats in various groups detected by TTC staining method

2.3 長時程增強檢測各組大鼠電刺激后海馬神經元fEPSP 斜率與假手術組比較，I/R 組大鼠fEPSP 斜率明顯降低（P<0.05）；與I/R 組比較，I/R+高劑量SCG 組大鼠fEPSP 斜率明顯升高（P<0.05）。見圖4 和5。

圖4 不同時間點電刺激后各組大鼠海馬神經元fEPSP 斜率Fig.4 fEPSP slopes of hippocampus neurons of rats in various groups after electrical stimulation at different time points

圖5 各組大鼠海馬神經元fEPSP 斜率Fig.5 fEPSP slopes of hippocampus neurons of rats in various groups

2.4 各組大鼠腦組織中海馬齒狀回區樹突棘密度假手術組、I/R 組、I/R+低劑量SCG 組和I/R+高劑量SCG組大鼠腦組織中海馬齒狀回區樹突棘密度分別為（146.67±10.60）、（54.33±11.93）、（86.67±12.66） 和（119.00±16.46） 個/50 μm，組間比較差異有統計學意義（F=26.792，P<0.001）。與假手術組比較，I/R 組大鼠腦組織中齒狀回區樹突棘密度明顯降低（P<0.05）；與I/R 組比較，I/R+高劑量SCG 組大鼠腦組織中海馬齒狀回區樹突棘密度明顯升高（P<0.05）。各組大鼠腦組織中海馬齒狀回區樹突棘形態表現見圖6。

圖6 各組大鼠腦組織中海馬齒狀回區樹突棘形態表現（高爾基染色，Bar=10 μm）Fig.6 Morphology of dendritic spines in dentate gyrus of hippocampus in brain tissue of rats in various groups (Golgi staining, Bar =10 μm)

2.5 各組大鼠腦組織中海馬齒狀回區BrdU 陽性細胞數和DCX 蛋白表達水平與假手術組比較，I/R 組大鼠腦組織中海馬齒狀回區BrdU 陽性細胞數和DCX 蛋白表達水平差異無統計學意義（P>0.05）；與I/R 組比較，I/R+高劑量SCG 組大鼠腦組織中海馬齒狀回區BrdU 陽性細胞數和DCX 蛋白表達水平升高（P<0.05）。見圖7 和表1。

表1 各組大鼠腦組織中海馬齒狀回區BrdU 陽性細胞數和DCX 蛋白表達水平Tab.1 Number of BrdU positive cells and expression levels of DCX protein in dentate gyrus of hippocampus in brain tissue of rats in various groups (n=3,±s)

表1 各組大鼠腦組織中海馬齒狀回區BrdU 陽性細胞數和DCX 蛋白表達水平Tab.1 Number of BrdU positive cells and expression levels of DCX protein in dentate gyrus of hippocampus in brain tissue of rats in various groups (n=3,±s)

*P<0.05 compared with I/R group.

Group Sham operation I/R I/R+low dose of SCG I/R+high dose of SCG Expression level of DCX protein 497.86±38.62 594.94±54.67 667.37±44.45 936.61±55.13*Number of BrdU positive cells 7.33±1.53 10.00±2.65 13.00±3.61 20.33±2.08*

圖7 免疫熒光法檢測各組大鼠腦組織中海馬齒狀回區BrdU 陽性細胞和DCX 蛋白表達情況（Bar=100 μm）Fig.7 BrdU positive cells and expressions of DCX protein in dentate gyrus of hippocampus in brain tissue of rats in various groups detected by immunofluorescence method (Bar =100 μm)

2.6 各組大鼠大腦海馬組織中BDNF、TrkB、NT-3和TrkC 蛋白表達水平與假手術組比較，I/R 組大鼠大腦海馬組織中NT-3 蛋白表達水平升高（P<0.05），而BDNF、TrkB 和TrkC 蛋白表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。與I/R 組比較，I/R+高劑量SCG 組大鼠大腦海馬組織中BDNF、TrkB、NT-3 和TrkC 蛋白表達水平升高（P<0.05）。見圖8 和表2。

表2 各組大鼠大腦海馬組織中BDNF、TrkB、NT-3 和TrkC 蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of BDNF,TrkB, NT-3， and TrkC proteins in hippocampus tissue of brain of rats in various groups(n=3,±s)

表2 各組大鼠大腦海馬組織中BDNF、TrkB、NT-3 和TrkC 蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of BDNF,TrkB, NT-3， and TrkC proteins in hippocampus tissue of brain of rats in various groups(n=3,±s)

*P<0.05 compared with sham operation group； △P<0.05 compared with I/R group.

Group Sham operation I/R I/R+low dose of SCG I/R+high dose of SCG TrkC 0.22±0.02 0.20±0.04 0.26±0.01 0.41±0.03△BDNF 0.23±0.04 0.30±0.03 0.36±0.05 0.82±0.07△TrkB 0.26±0.06 0.37±0.05 0.39±0.07 1.02±0.14△NT-3 0.08±0.01 0.14±0.03*0.17±0.03 0.62±0.07△

圖8 各組大鼠大腦海馬組織中BDNF、TrkB、NT-3 和TrkC 蛋白電泳圖Fig.8 Electrophoregram of expressions of BDNF,TrkB, NT-3， and TrkC proteins in hippocampus tissue of brain of rats in various groups

3 討 論

CIS 溶栓誘發再灌注會造成大腦海馬區神經元死亡［8］。本研究結果顯示：I/R 大鼠腦組織中出現梗死灶和神經功能損傷，Y 型迷宮實驗檢測結果顯示：I/R 組大鼠出現認知功能障礙，表明I/R 構建成功。I/R 模型可模擬臨床患者部分肢體運動受損及口眼歪斜等癥狀［9］和模擬CT 檢查呈現的缺血側低密度陰影信號的情況［10］。此外，I/R 模型易造成遠期認知功能障礙情況，這與臨床患者CIS 溶栓后遠期可能發展為血管性癡呆的病情相符［11］。

既往研究［12-13］顯示：SCG 具有治療中樞神經系統損傷的作用，給予癲癇大鼠SCG 可明顯改善大鼠癲癇癥狀；50 mg·kg－1SCG 可明顯降低圍術期腦卒中大鼠中樞神經系統中MCs 數，減輕腦損傷嚴重程度。本研究采用20 和60 mg·kg－1SCG 觀察 SCG 對I/R 大鼠的影響，結果顯示：與I/R 組比較，I/R+高劑量SCG 組大鼠神經功能評分明顯升高，腦梗死面積減少，大鼠認知功能改善；I/R+低劑量SCG 組大鼠各項神經功能評分和腦梗死面積等雖有改善趨勢，但差異無統計學意義。

I/R 誘發中樞神經系統損傷機制復雜，但無論何種機制，其恢復治療機制均涉及提高神經元狀態［14］。神經元發生損傷后，腦組織產生代償性促進神經元新生的反應，該過程是生物體的一種內源性保護行為，神經元新生與神經功能恢復密切相關。有 研 究［15］顯 示： 海 馬 中BDNF/TrkB 和NT-3/TrkC 信號通路蛋白表達與神經發育、突觸形成及學習記憶緊密相關。以基因技術編碼敲低BDNF 表達可能導致突觸功能障礙、突觸可塑性降低和學習及記憶功能受損［16］。增加BDNF和NT-3蛋白表達則有助于樹突棘的生長，調節軸突形態，促進神經元新生［17-18］。本研究結果顯示：與假手術組比較，I/R 組大鼠大腦海馬組織中NT-3 蛋白表達水平升高，但BDNF、TrkB 和TrkC 蛋白表達水平無明顯變化。BrdU 是胸腺嘧啶核苷酸類似物，能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶進入正在復制的DNA 分子中，可通過熒光標記準確地反映細胞增殖情況，而DCX 則是未成熟新生的齒狀回顆粒細胞的可靠標記物。在生物內源性修復過程中，BrdU 陽 性 細 胞 數 和DCX 蛋 白 表 達 水 平 升 高［19-20］。本研究結果顯示：采用SCG 治療后大鼠腦組織中海馬齒狀回區DCX 表達水平和BrdU 陽性細胞數升高。

樹突棘是信號傳遞基本單位，與個體認知功能相關［18］。樹突棘數、密度和長度的變化可直觀反映突觸可塑性改變，可以通過電生理信號長時程增強電位顯示［21］。I/R 造成大鼠腦組織海馬區域樹突棘密度降低，長時程增強檢測中fEPSP 斜率降低，且Y 型迷宮實驗中大鼠正確反應率減少，正確反應時間延長。這是由于大鼠腦組織結構復雜，缺血區雖然恢復了血供，但較長時間缺血和復灌造成神經元不可逆損傷，且腦組織自我修復能力較弱，無法完全逆轉I/R 造成的損傷［22］。因此深入探討發生I/R 損傷后如何采用藥物提高缺血區神經元新生具有重要意義。本研究結果顯示：SCG干預后，I/R 大鼠腦組織中BrdU 陽性細胞數增多，DCX 蛋白表達水平升高，且樹突棘密度明顯升高；與I/R 組比較，I/R+高劑量SCG 組大鼠腦組織海馬齒狀回區樹突棘密度明顯升高，且fEPSP 斜率升高。

綜上所述，SCG 具有中樞神經系統保護作用，其機制可能是通過提高BDNF/TrkB 和NT-3/TrkC 信號通路蛋白表達，促進腦組織海馬區神經元增殖，提高樹突棘密度，最終起到提高長時程電位和改善I/R 大鼠認知功能的作用。此外，與自體生理修復比較，SCG 可以進一步減少腦梗死區域，減輕大鼠神經功能障礙。但本研究也存在一定局限性，未探討部分神經元新生指標（如轉化生長因子β1和血管內皮生長因子）的變化及其意義。SCG 一方面調控了神經元的分化和增殖［23］，另一方面在缺血區血管重構過程中發揮了巨大作用［24］。