巨噬細胞外泌體lncRNA HULC 對肝癌細胞遷移、侵襲和轉移的影響及其機制

董 勇, 徐菱遙, 華 靜, 梁 晗, 劉東亞, 趙俊波, 孫正路, 程 序, 魏書堂

（河南大學第一附屬醫院消化內科，河南 開封 475100）

肝癌是全球癌癥相關死亡的第四大原因，80%以上肝癌為肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），目前中國的HCC 發病率和病死率均較高［1-2］。盡管手術、靶向和免疫治療等技術取得明顯進展，但多數HCC 患者預后仍較差，且腫瘤復發和轉移成為威脅患者生命的主要原因［3］。因此，探討HCC 轉移機制非常重要。

腫 瘤 相 關 巨 噬 細 胞 （tumor-associated macrophages，TAM）是腫瘤微環境的主要成分之一，TAM 的表型和功能更接近M2 巨噬細胞，可通過促進HCC 細胞存活、遷移、血管形成和侵襲等誘導腫瘤生長及轉移［4］。外泌體為多種細胞（包括腫瘤細胞）分泌的納米級囊性小泡，內部包裹著RNA、DNA 和蛋白質等活性分子，可傳遞細胞間信 息［5］。近 年 來 研 究［6-7］顯 示：TAM 外 泌 體 可 通過作用于基質細胞、腫瘤細胞和免疫細胞等增強腫瘤的免疫逃避、血管生成及轉移。TAM 外泌體中的長鏈非編碼RNA （hong non-coding RNA，lncRNA）已被證實具有調節腫瘤進程的作用，有望成為腫瘤治療的靶點［8-9］。肝癌高表達轉錄本（highly upregulated in liver cancer，HULC）是在肝癌組織中發現的一種特異性的高表達lncRNA。lncRNA HULC 已被證實在HCC 組織中呈高表達，可 通 過 微 小RNA-2052 （microRNA-2052， miR-2052）/間 充 質-上皮 轉 化（mesenchymal epithelial transformation，MET） 軸促進HCC 細胞的增殖、侵襲和異種移植腫瘤的生長［10-11］，但是目前關于TAE 外泌體中lncRNA HULC 表達與HCC 轉移關系的報道較少。本研究探討lncRNA HULC 在TAM 外泌體中的表達，并初步探討其在HCC 轉移中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞、主要試劑和儀器7 周齡C57BL/6 小 鼠10 只，7 周 齡BALB/c 裸 鼠20 只，體質量20～22 g，購于北京維通利華實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK （京） 2021-0011，飼養于河南省醫藥科學研究院，動物使用許可證號：SYXK（豫）2021-0017。人HCC HepG2細胞 （中國醫學科學院細胞資源中心）。Lipofectamine 3000 試劑和膜蛋白提取試劑盒（美國Invitrogen 公司），TB Green?Premix Ex Taq?和PrimeScript ? RT Master Mix （日 本TaKaRa 公司），PKH26 紅色染料和佛波酯（美國Sigma 公司）， WNT 通 路 激 動 劑 SKL2001 （ 美 國MedChemExpress 公司），含有lncRNA HULC-小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）及相應對照的質粒（上海吉瑪公司），GAPDH、CD9、CD81 抗體和羊抗兔二抗（美國CST 公司），小鼠腫瘤易感基因101（mouse tumor susceptibility gene 101，TSG101）、 Calnexin、 小 鼠Wnt3A 蛋 白、β-連環蛋白（β-catenin）、c-Myc 和Cyclin D1 抗體（英國Abcam 公司）。ABI StepOnePlus 實時熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 儀（美國Applied Biosystems 公司），MODEL550 型酶標儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 骨髓源巨噬細胞（bone marrow-derived macrophages，BMDM）分 離 和M2 巨 噬 細 胞 誘 導BMDM 分離和誘導：剖取10 只C57BL/6 小鼠的脛骨和股骨，剪成3 段，剪開骨腔，從一端注射無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）以沖出骨髓，加入紅細胞裂解液混勻，冰上放置10 min；離心后加入含12%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的RPMI 1640 培養基重懸，并加入100 μg·L－1佛波酯誘導48 h，觀察到骨髓單核細胞由懸浮生長轉為貼壁生長即說明成功誘導為BMDM （M0 巨噬細胞）。繼續培養7 d 后，加入20 μg·L－1白細胞介素4（interleukin-4，IL-4）誘導分化48 h 獲得M2 巨噬細 胞，即TAM［12］。

1.3 M2 巨噬細胞外泌體的提取和鑒定［13］將TAM 置于無血清RPMI 1640 培養基中培養48 h，收集培養液上清，差速離心法收集TAM 外泌體：4℃、 3 000 g 離心15 min 去除死細胞；6 000 g 離心40 min，去除細胞碎片；10 000 g 離心1 h 收集上清；100 000 g 離心1 h 取沉淀即為TAM 外泌體，記為TAM-exos。采用多聚甲醛固定TAM 外泌體，離心重懸在無水乙醇中，取2 μL 滴加至銅網，干燥后在透射電鏡（transmission electron microscope，TEM） 下觀察，并采用Western blotting 法檢測外泌體中外泌體蛋白（TSG101、CD81 和CD9） 和內質網蛋白Calnexin 表達。另外將TAM 外泌體采用PKH26 染料染色后，與HepG2 細胞共孵育2 h，采用DAPI 標記細胞核，在熒光顯微鏡下觀察HepG2 細胞對外泌體的攝取。

1.4 細胞分組和處理HepG2 細胞在含10% FBS的MEM 培養基中常規培養。①觀察不同來源外泌體對HepG2 細胞的影響：將HepG2 細胞分為對照組（未經任何處理的HepG2 細胞） 和TAM-exos組（HepG2 細胞與20 mg·L－1TAM 外泌體共孵育48 h）。②觀察TAM 來源的外泌體攜帶的lncRNA HULC 對HepG2 細胞的影響：將HepG2 細胞分為NC-exos 組（采用lncRNA HULC-siRNA 干擾質粒的陰性對照轉染TAM，轉染后提取外泌體處理HepG2 細 胞48 h） 和lncRNA HULC-siRNA-exos組（采用轉染lncRNA HULC-siRNA 干擾質粒轉染TAM，轉染后提取外泌體處理HepG2 細胞48 h）。③觀察TAM 來源的外泌體攜帶的lncRNA HULC對HepG2 細胞作用機制：將HepG2 細胞分為lncRNA HULC-siRNA-exos 組 （采 用 lncRNA HULC-siRNA-exos 處 理HepG2 細 胞48 h） 和lncRNA HULC-siRNA-exos+SKL2001 組（采 用lncRNA HULC-siRNA-exos 和 20 μmol·L－1SKL2001［14］共同處理HepG2 細胞48 h）。

1.5 HepG2 細胞轉染lncRNA HULC-siRNA 質粒分別將40 ng lncRNA HULC-siRNA 或對照質粒加入50 μL Opti-MEM 培養基中，再加入50 μL Lipofectamine 3000 試劑混勻后靜置20 min，現配現用。將TAM 接種于6 孔細胞培養板，每孔5×104個細胞，培養24 h 后棄去培養基，加入上述混合液，作用24 h 后更換為新鮮MEM 培養基+10%FBS，繼續培養48 h，再次更換為無血清培養基培養48 h，按照“1.3”方法提取各組含lncRNA HULC-siRNA 或對照質粒的TAM 外泌體，即lncRNA HULC-siRNA-exos 或NC-exos。

1.6 Transwell 小室實驗檢測HepG2 細胞遷移和侵襲細胞數細胞遷移實驗：將HepG2 細胞與外泌體共孵育48 h 后，取1×104個HepG2 細胞，采用無血清培養基重懸后加入Transwell 小室上室，在Transwell 小室的下室加入200 μL 含血清的培養基，培養48 h 后，取出小室，沖洗3 次，在4%多聚甲醛固定35 min，風干后結晶紫中染色1 h，顯微鏡下拍照。細胞侵襲實驗：接種前加入Matrigel膠凝固過夜，其余同細胞遷移實驗。選取5 個顯微鏡視野統計并比較各組遷移和侵襲細胞數。

1.7 RT-qPCR 法檢測細胞外泌體中lncRNA HULC 表達水平將HepG2 細胞與外泌體共孵育48 h 后，采用TRIzol 法提取HepG2 細胞的RNA，并采用日本TaKaRa 公司的PrimeScript ? RT Master Mix 逆轉錄合成cDNA。lncRNA HULC 的RT-qPCR 法檢測參照TB Green?Premix Ex Taq?試劑盒說明書進行，采用2－ΔΔCt法計算lncRNA HULC 表達水平（以GAPDH 為內參）。采用同樣方法檢測TAM 或HepG2 細胞外泌體中lncRNA HULC 表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.8 Western blotting 法檢測細胞中Wnt 通路蛋白表達水平將HepG2 細胞與外泌體共孵育48 h 后，取各組1×106個HepG2 細胞，采用放射免疫沉淀試驗（radio immuno precipitation assay，RIPA）裂解液提取HepG2 細胞蛋白。測定濃度后取20 μg 蛋白上樣、電泳和轉膜，采用5%脫脂奶粉封閉聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF） 膜，清洗后與一抗Wnt3A （1∶1 000）、β-catenin（1∶200）、c-Myc （1∶1 000）、GAPDH （1∶2 000）和Cyclin D1 抗體（1∶5 000）4 ℃作用過夜，清洗后與二抗（1∶1 000） 室溫作用1 h，清洗后浸入ECL 發光液中顯像并拍照。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值。

1.9 M2 巨噬細胞外泌體lncRNA HULC 作用后裸鼠原位移植瘤肺轉移灶數將HepG2 細胞與PBS緩沖液、TAM-exos、NC-exos 和lncRNA HULCsiRNA-exos 共 孵 育 后 收 集HepG2 細 胞。將20 只7 周齡BALB/c 裸鼠隨機分為4 組，每組5 只。將上述HepG2 細胞（每只5×105個HepG2 細胞）原位注射至每組裸鼠的左肝葉中，記為對照組、TAMexos 組、NC-exos 組 和lncRNA HULC-siRNA-exos組。6周后，麻醉各組裸鼠，取肺組織，對肺組織進行HE 染色，光學顯微鏡下觀察各組裸鼠肺轉移灶數。

1.10 統計學分析采用SPSS 25.0 和GraphPad Prism 8.0 統計軟件進行統計學分析。2 組HepG2細胞的遷移和侵襲細胞數、細胞外泌體中lncRNA HULC 表 達 水 平，HepG2 中lncRNA HULC 表 達 水平、HepG2 細胞中Wnt 通路蛋白表達水平和裸鼠原位移植瘤肺轉移灶數符合正態分布，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 M2 巨噬細胞來源外泌體的鑒定TEM 檢測結果顯示：分離自TAM 的外泌體具有雙層膜的囊泡結構，直徑為35～100 nm （圖1A）。Western blotting 法檢測結果顯示：TAM-exos表達TSG101、CD9 和CD81蛋白，不表達Calnexin蛋白（圖1B）。說明TAM-exos符合外泌體的形態和生物學特征。

圖1 TEM 檢測TAM 外泌體的鑒定Fig.1 Identification of TAM-exosomes detected by TEM

2.2 對照組和TAM-exos 組HepG2 細胞遷移及侵襲細胞數將HepG2 細胞與紅色染料PKH26 標記的TAM-exos 共孵育后，熒光顯微鏡下觀察到HepG2 細胞核周圍存在紅色熒光（圖2），說明HepG2 細 胞 可 攝 取TAM-exos。Transwell 小 室 實驗檢測結果顯示：與對照組比較，TAM-exos 組HepG2 細胞的遷移和侵襲細胞數增加（P<0.05）。見圖3 和4。

圖2 熒光顯微鏡觀察2 組HepG2 細胞攝取TAM-exos 情況（Bar=200 μm）Fig.2 Uptake of TAM-exos in HepG2 cells in two groups observed under fluorescence microscope（Bar=200 μm）

圖3 2 組HepG2 細胞遷移和侵襲情況(結晶紫,×200)Fig.3 Migration and invasion of HepG2 cells in two groups (Crystal violet,×200)

圖4 2 組HepG2 細胞遷移和侵襲細胞數Fig.4 Numbers of migration and invasion HepG2 cells in two groups

2.3 各組細胞外泌體中lncRNA HULC 表達水平TAM-exos 中 lncRNA HULC 表 達 水 平（2.98±0.56） 高 于HepG2 細 胞 外 泌 體（1.00±0.05） （P<0.05）。 在 TAM 中 轉 染 lncRNA HULC-siRNA 和對照后，提取各組TAM 分泌的外泌體，記為lncRNA HULC-siRNA-exos和NC-exos，RT-qPCR法檢測結果顯示：lncRNA HULC-siRNAexos中lncRNA HULC 表達水平（0.28±0.05） 低于NC-exos（1.00±0.07）（P<0.05），可用于后續實驗。

2.4 M2 巨噬細胞來源外泌體作用后HepG2 細胞中lncRNA HULC 表達水平RT-qPCR 法檢測結果顯示：對照組和TAM-exos 組HepG2 細胞中lncRNA HULC 表 達 水 平 為1.00±0.09 和2.64±0.37，與對照組比較，TAM-exos 組HepG2 細胞中lncRNA HULC 表 達 水 平 升 高 （P<0.05）。lncRNA HULC-siRNA-exos 組 HepG2 細 胞 中lncRNA HULC 表達水平（0.32±0.05）低于NCexos 組（1.00±0.08）（P<0.05）， 說 明TAMexos 可將lncRNA HULC 轉移至HCC 細胞中。

2.5 敲低M2 巨噬細胞外泌體中lncRNA HULC表達后HepG2 細胞遷移和侵襲細胞數將HepG2細 胞 與NC-exos 和lncRNA HULC-siRNA-exos 共孵育，Transwell 小室實驗檢測結果顯示：lncRNA HULC-siRNA-exos 組遷移細胞數和侵襲細胞數低于NC-exos 組（P<0.05）。見圖5 和6。

圖6 敲低M2 巨噬細胞外泌體中lncRNA HULC 表達后2 組HepG2 細胞遷移和侵襲細胞數Fig.6 Numbers of migration and invasion HepG2 cells in two groups after knocking down lncRNA HULC expression

2.6 敲低M2 巨噬細胞外泌體lncRNA HULC 后HepG2 細胞中Wnt 通路蛋白表達水平與對照組比較，TAM-exos 組 HepG2 細 胞 中 Wnt3A、β-catenin、c-Myc 和Cyclin D1 蛋白表達水平升高（P<0.05）（圖7）；lncRNA HULC-siRNA-exos 組HepG2 細 胞 中 Wnt3A、 β -catenin、 c-Myc 和Cyclin D1 蛋白表達水平低于NC-exos 組（P<0.05）（圖8）。

圖7 Western blotting 法檢測敲低M2 巨噬細胞外泌體lncRNA HULC 表達后對照組和TAM-exos 組HepG2 細胞中Wnt 通路蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.7 Electrophoregram (A) and histogram (B) of Wnt pathway proteins in HepG2 cells in control and TAM-exos groups after knocking down expression of lncRNA HULC in M2 macrophage exosomes detected by Western blotting method

圖8 Western blotting 法檢測敲低M2 巨噬細胞外泌體lncRNA HULC 表達后NC-exos 組和lncRNA HULC-siRNA-exos 組HepG2 細胞中Wnt 通路蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.8 Electrophoregram (A) and histogram (B) of Wnt pathway proteins in HepG2 cells in NC-exos and lncRNA HULC-siRNA-exos groups after knocking down expression of lncRNA HULC in M2 macrophage exosomes detected by Western blotting method

2.7 激活Wnt 信號通路后HepG2 細胞遷移和侵襲細胞數和細胞中Wnt3A、β-catenin、c-Myc 及Cyclin D1 蛋白表達水平與lncRNA HULC-siRNA-exos組比較，lncRNA HULC-siRNA-exos+SKL2001 組HepG2 細胞的遷移和侵襲細胞數及細胞中Wnt3A、β-catenin、c-Myc 和Cyclin D1 蛋白表達水平均升高（P<0.05），說明激活Wnt 信號通路可減弱敲低TAM 外泌體lncRNA HULC 對HCC 細胞遷移和侵襲的作用。見圖9～11。

圖9 激活Wnt 信號通路后2 組HepG2 細胞遷移和侵襲情況(結晶紫,×200)Fig.9 Migration and invasion HepG2 cells in two groups after activation of Wnt signaling pathway (Crystal violet,×200)

圖10 激活Wnt 信號通路后2 組HepG2 細胞遷移和侵襲細胞數Fig.10 Numbers of migration and invasion HepG2 cells in two groups after activating Wnt signaling pathway

圖11 Western blotting 法檢測激活Wnt 信號通路后lncRNA HULC-siRNA-exos 組和lncRNA HULC-siRNA-exos+SKL2001 組HepG2 細胞中Wnt 信號通路蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.11 Electrophoregram (A) and histogram (B) of Wnt signaling pathway proteins in HepG2 cells in lncRNA HULC-siRNA-exos and lncRNA HULCsiRNA-exos+SKL2001 groups after activating Wnt signaling pathway detected by Western blotting method

2.8 M2 巨噬細胞外泌體lncRNA HULC 作用后裸鼠原位移植瘤肺轉移灶數與對照組比較，TAMexos 組裸鼠原位移植瘤肺轉移灶數增多（P<0.05）； 與 TAM-exos 組 和 NC-exos 組 比 較，lncRNA HULC-siRNA-exos 組裸鼠原位移植瘤肺轉移灶數減少（P<0.05）。見圖12。

圖12 M2 巨噬細胞外泌體lncRNA HULC 作用后原位移植瘤裸鼠肺組織形態表現（HE,×100）Fig.12 Morphology of lung tissue in nude mice with in situ transplantation tumor after treated with M2 macrophage extracellular vesicle lncRNA HULC（HE,×100）

圖13 M2 巨噬細胞外泌體lncRNA HULC 作用后各組裸鼠原位移植瘤肺轉移灶數Fig.13 Numbers of lung metastasis in nude mice with in situ transplantation tumor after treated with M2 macrophage extracellular vesicle lncRNA HULC

3 討 論

巨噬細胞存在M1 和M2 2 種激活狀態，與發揮促炎和抗腫瘤作用的M1 型不同，特異性表達CD206 和精氨酸酶1（arginase 1，ARG1）等的M2巨噬細胞與TAM 極為相似，具有抗炎和促腫瘤發生 的 功 能［13-15］。本 研 究 采 用IL-4 誘 導BMDM 分 化為M2 巨 噬 細 胞 來 模 擬TAM。研 究［16-18］顯 示：TAM 與HCC 的血管新生和殘留腫瘤轉移等關系密切。 TAM 外泌體能夠將其包裹的lncRNA、miRNA 和蛋白質等活性分子轉移至腫瘤細胞，調控腫瘤細胞的增殖及遷移等惡性特征，進而促進腫瘤發展。lncRNA 為外泌體的主要內容物之一，可通過多種方式參與HCC 過程，如外泌體lncRNA HMMR-AS1 可通過miR-147a/ARID3A 軸介導巨噬細胞極化并影響HCC 的進展［19］。本研究采用差速離心法收集TAM 外泌體，經TEM 觀察到TAM外泌體為具有雙層膜的囊泡結構，Western blotting法 檢 測 證 實TAM-exos 表 達TSG101、 CD9 和CD81 蛋白（外泌體的標志蛋白），符合外泌體的形態和生物學特征，表明成功分離TAM-exos。

TAM 外泌體可參與調節HCC 的進展，如TAM 外泌體可調控相關信號傳導增加肝癌細胞的侵襲，調節肝癌進展［20］。lncRNA HULC 已被證實在HCC 組織中高表達［10-11］。本研究證實：TAM 外泌體可轉移lncRNA HULC 進入HCC 細胞中，且可顯著促進HCC 細胞遷移和侵襲，說明TAM 外泌體可增強HCC 細胞的轉移能力。lncRNA HULC在肝癌組織中表達上調，其致癌作用已在多種腫瘤中被證實，lncRNA HULC 可促進膠質母細胞瘤細胞的侵襲、上皮間質轉化及在裸鼠內的生長和轉移［21］。在宮頸癌組織中lncRNA HULC 也可調控miR-218/TPD52 軸 而 促 進 細 胞 增 殖 和 侵 襲［22］。本研究中，lncRNA HULC 在TAM 外泌體中高表達，敲低lncRNA HULC 的TAM 外泌體可降低HCC 細胞遷移和侵襲， 說明TAM 外泌體中下調的lncRNA HULC 可降低HCC 細胞的轉移能力。

腫瘤轉移過程與Wnt/β-catenin 信號通路密切相關，如致癌效應器通過促進Wnt/β-catenin 信號傳導，共同驅動胰腺導管腺癌轉移［23］，腫瘤壞死因子9 通過激活Wnt 信號通路誘導巨噬細胞M2 型極化，促進胰腺癌轉移［24］。Wnt3A 是一種關鍵的Wnt 配體，在HCC 患者的腫瘤組織中表達水平高于正常肝組織；Wnt3A 可從腫瘤細胞中分泌并激活Wnt/β-catenin 信號轉導，介導HCC 細胞的增殖、侵襲和轉移，是治療HCC 的有效靶點；c-Myc和cyclin D1 是 其 靶 基 因［25］。研 究［26］顯 示：激 活Wnt/β-catenin 信號可促進HCC 肝轉移。本研究結果顯示：TAM 外泌體能夠上調細胞中Wnt3A、β-catenin、c-Myc 和Cyclin D1 蛋白表達，即Wnt 信號通路被激活，而敲低lncRNA HULC 的TAM 外泌體可下調Wnt3A、β-catenin、c-Myc 和Cyclin D1蛋白表達，說明TAM 外泌體中lncRNA HULC 可激活Wnt 信號通路。為了進一步驗證TAM 外泌體中lncRNA HUL 在HCC 中的作用機制，本研究在對敲低lncRNA HULC 的TAM 外泌體處理的基礎上，采用Wnt 信號通路激活劑SKL2001 進行干預，結果顯示：激活Wnt 信號通路可減弱敲低TAM 外泌體lncRNA HULC 對HCC 細胞遷移和侵襲的作用，提示TAM 外泌體中的lncRNA HULC 可能通過上調Wnt3A 的表達，激活HCC 細胞中的Wnt/β-catenin 信號通路，進一步促進HCC 細胞遷移和侵襲。

為了研究TAM 外泌體中的lncRNA HULC 對體內腫瘤細胞轉移的影響，本研究采用肝內注射方式構建裸鼠原位肝癌移植模型，結果顯示：TAM外泌體中lncRNA HULC 的敲低減少了HCC 細胞的肺轉移；體內研究進一步證實：敲低TAM 外泌體中的lncRNA HULC 可抑制HCC 細胞的肺轉移。

綜上所述，TAM 外泌體lncRNA HULC 具有促進HCC 細胞侵襲和轉移的作用，其作用機制可能與激活Wnt 信號通路有關。在后續的研究中將結合體內實驗進一步證明TAM 外泌體中lncRNA HULC 的具體作用機制。