男性不育患者Y 染色體AZF 區(qū)域STS 微缺失位點多重PCR 法檢測及其意義

馮 喬, 王曼伊, 于鴻浩, 李 君, 曾 丹, 侯 任

（1.桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院遺傳與精準醫(yī)學實驗室，廣西 桂林 541001；2.桂林醫(yī)學院生物技術學院細胞與遺傳學教研室，廣西 桂林 541100；3.桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院優(yōu)生遺傳科，廣西 桂林 541001）

據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO） 統(tǒng)計［1-2］：有10%～15% 已婚育齡期夫婦無法自然生育，其中男性因素占 30%～50%。男性不育癥（male infertility， MI）已被認為是一種常見病［3］，MI 是由多種因素導致男性生殖功能障礙的一類疾病，如感染、內(nèi)分泌紊亂、靜脈曲張（陰囊內(nèi)盤狀靜脈叢異常增大） 和精道梗阻等［4］，其中遺傳因素（Y 染色體異常）是導致男性不育的主要原因［5］。

研究［6］顯示：存在于Y 染色體長臂近端Yq11的無精子癥因子（azoospermia factor，AZF）基因區(qū)域與男性不育癥密切相關。有關Yq11 的AZF 區(qū)域缺失的相關研究［7］最早可追溯到20 世紀80 年代，VOGT 等［8］發(fā) 現(xiàn)：Yq11 中 存 在3 個 精 子 發(fā)生基因座，并將Yq11 近端、中端和遠端3 個重復缺失的亞區(qū)分別命名為AZFa、AZFb 和AZFc。然而目前有關AZF 微缺失與患者年齡、身高、激素譜和精子狀態(tài)等臨床參數(shù)之間關系的研究較少。本文作者選取Y 染色體AZF 區(qū)域3 個區(qū)段中最具代表性的15 個標簽位點（sequence tag site，STS）進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測， 其中包括歐洲分子遺傳學質(zhì)量網(wǎng)絡（European Molecular Genetics Quality Network，EMQN） 和歐洲男科學會（European Andrology Association，EAA）推薦的6 個STS，并采用多重PCR 法檢測這些基礎性STS 位點，明確廣西壯族自治區(qū)東北部地區(qū)MI 患者Y 染色體AZF 區(qū)域位點微缺失情況，旨在為完善國內(nèi)Y 染色體微缺失臨床常規(guī)檢測提供遺傳學基礎數(shù)據(jù)，為臨床治療MI 提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇于2014 年11 月—2022 年10 月在桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院生殖男科就診的2 586 例男性患者，依據(jù)年齡共分為4 組：≤20 歲組14 例、21～30 歲組988 例、31～40 歲組1 318 例、≥41 歲組266 例，納入患者年齡為17～58 歲，平均年齡為（33.25±5.70）歲。納入標準：診斷為無精癥、畸形精子癥、進行優(yōu)生咨詢和體外受精（in vitrofertilization，IVF）術前檢查的疑似MI 患者。排除標準：資料不全者和未經(jīng)多重PCR 法檢測的患者。本研究經(jīng)桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批（倫理審核編號：GYLL2021030）。

1.2 患者外周血提取采用枸櫞酸鈉或乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetra-acetic acid，EDTA）抗凝的真空采血管采集患者靜脈全血2 mL。采用Lab-Aid 824s 血液基因組DNA 提取試劑（醫(yī)療器械備案憑證編號/產(chǎn)品技術編號： 閩廈械備2018036 號），采用Lab-Aid824s 核酸提取儀（廈門致善生物科技股份有限公司）提取患者外周血基因組DNA，操作步驟嚴格按照相關說明書進行。

1.3 Y 染色體微缺失基因的檢測采用亞能生物技術（深圳）有限公司生產(chǎn)的Y 染色體微缺失基因檢測試劑盒（醫(yī)療器械備案憑證編號/產(chǎn)品技術要求編號：國械注準 20173403324），各管多重PCR法檢測的STS 分布見表1。擴增程序為50 ℃、10 min，95 ℃、15 min，94 ℃、30 s，58 ℃、60 s，72 ℃、60 s，35 個 循 環(huán) 后，72 ℃、10 min 充 分延伸。

表1 多重PCR 法檢測的STS 分布Tab.1 STS distributions detected by multiplex PCR method

1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 27.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。STS 序列異常、位點缺失、AZFc 區(qū)域中STS 位點和AZFbc 片段異常率以百分率表示，多組間比較采用χ2檢驗，若期望值<5 則采用連續(xù)校正χ2檢驗；組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組患者Y 染色體AZF 區(qū)域STS 位點的異常分布AZF 區(qū)域發(fā)生微缺失的頻率占總受檢人數(shù)的8%；各組患者Y 染色體AZF 區(qū)域STS 異常例數(shù)及百分率：≤20 歲組，1 例（7.14%）；21～30 歲組，80例（8.10%）；31～40歲組，106例（8.04%）；≥ 41 歲組，20 例（7.52%）；多組間患者STS 異常率比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=10.836，P=0.013）；21～30 歲 組 和31～40 歲 組 患 者STS 異 常率比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；≥ 41 歲組患者Y 染色體AZF 區(qū)域中STS 序列總體異常率（7.52%）最高。見表2。

表2 各組患者Y 染色體AZF 區(qū)域中15 個STS 序列異常分析Tab.2 Analysis on 15 STS sequence abnormalities in AZF region of Y chromosome of patients in various groups[n（η/%）]

在2 586 例受檢樣本中，發(fā)生基礎片段缺失樣本52 例，異常率為2.01%，各組樣本異常率比較差 異 有 統(tǒng) 計 學 意 義（χ2=9.658，P=0.022）；AZFc 片段缺失者占所有受檢人數(shù)的1.39%，其中21～30 歲組和31～40 歲組患者AZFc 缺失率分別為1.92% 和1.14%，明顯高于≥41 歲組（0.38%），其中21～30 歲組與31～40 歲組患者總體缺失率比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=3.612，P=0.040），而21～30 歲組與≥ 41 歲組患者總體缺失率比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.605，P=0.008）。見表3。

表3 各組患者基礎位點缺失情況Tab.3 Deletions of base sites of patients in various groups

2.2 各組患者AZFc 區(qū)域中STS 位點異常分析AZFc 區(qū)域中STS 異常位點分析結果顯示：不同年齡患者發(fā)生sY254 合并sY255、sY1192/sY143和 sY153 缺 失 率 為 1.39% （χ2=8.022，P=0.048）；只發(fā)生sY1192/sY143 缺失率為4.56%；sY1192/sY143 合并sY153 缺失率為1.35%；其中sY1192/sY143 位點缺失率更高。見表4。

表4 各組患者AZFc 區(qū)域中STS 位點的異常分布Tab.4 Abnormal distributions of STS sites in AZFc region of patients in various groups

2.3 各組患者中AZFb 和AZFc 區(qū)域異常狀況分析在不同年齡患者AZFb和AZFc區(qū)域中，sY127、sY134 合 并sY105、 sY121、 sY1192、 sY153 和sY160位點缺失率比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），不同年齡患者AZFbc 中sY254、sY255 合并sY105、sY121、sY1192、sY153 和sY160 位點缺失率比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表5。

表5 各組患者中AZFb 和AZFc 片段異常分布情況Tab.5 Distributions of AZFb and AZFc fragment abnormalities of patients in various groups

3 討 論

導致MI 的因素十分復雜，其中Y 染色體異常是主要遺傳因素［5］。由于Y 染色體上的特異區(qū)域存在大量重復序列，這些序列間有頻發(fā)的染色體內(nèi)非等位基因同源重組，易引起生精基因的改變，導致MI［9］。研究［10］顯示：全球約有7.5% 的不育男性出現(xiàn)Y 染色體長臂微缺失。Y 染色體長臂微缺失橫跨AZFa、AZFb 和AZFc 共3 個AZF，其 中AZFc是Y 染色體長臂上最活躍的區(qū)域［9］，位于Y 染色體上的無精癥缺失（deleted in azoospermia，DAZ）基因家族被認為是最有可能導致男性生精缺陷的候選基因。因此，許多國家常用Y 染色體長臂缺失篩查作為判定MI 的依據(jù)［10］。目前檢測Y 染色體上的特異區(qū)域突變的方法［11-12］不斷更新，在臨床實踐中通常檢測AZF 區(qū)的15 個STS 位點微缺失，采用多重PCR 技術檢測STS 被認為是檢測Y 染色體AZF 區(qū)域缺失的標準方法［13］。

本文作者采用多重PCR 法對廣西壯族自治區(qū)東北部地區(qū)疑似MI 患者AZF 區(qū)域微缺失情況進行了分析，結果顯示：該地區(qū)納入檢測的人群中AZF 發(fā)生微缺失率為8%；不同年齡患者的Y 染色體AZF 區(qū)域STS 的總體異常率分別為7.14%、8.10%、8.04%和7.52%；不同年齡患者在基礎位點合并擴展位點缺失方面差異明顯，其中21～30 歲組和≥ 41 歲 組 患 者Y 染色體AZF 區(qū)域STS 的總體異常率比較差異有統(tǒng)計學意義；Y 染色體AZF 區(qū)域的STS 序列總異常分析結果顯示：21～30 歲患者Y 染色體AZF 區(qū)域STS 總體異常率明顯高于其他各組。在2 586 例受檢樣本中，發(fā)生基礎位點片段缺失52 例，異常率為2.01%，各組樣本異常率比較差異有統(tǒng)計學意義；研究［14-16］顯示：多AZF 區(qū)域缺失者精子質(zhì)量較低。本研究中AZF片段缺失以AZFc 片段缺失為主，占所有受檢人數(shù)的1.39% ，其中21～30 歲組和31～40 歲組患者AZFc 缺失率分別為1.92% 和1.14%，明顯高于≥41 歲組。21～30 歲組和31～40 歲組患者總體缺失率比較差異有統(tǒng)計學意義，21～30 歲組和31～40 歲組患者總體缺失率比較差異有統(tǒng)計學意義。

對AZFc 區(qū)域中的STS 異常位點進一步分析發(fā)現(xiàn)： 在不同年齡組患者sY254 并發(fā)sY255、sY1192/sY143 和sY153 缺失率為1.39%；只發(fā)生sY1192/sY143 缺 失 率 為4.56%，sY1192/sY143 合并sY153 缺失率為1.35%，可見sY1192/sY143 位點發(fā)生缺失的差異性更為顯著，這一結果與HSU 等［17］和KURODA- KAWAGUCHI 等［18］的研究結果基本相同，說明該地區(qū)受檢人群的不育原因與AZFc 區(qū)域變異有關。但sY1192 位點缺失的臨床意義尚有待于進一步證實。各年齡組患者AZFbc 片段異常發(fā)生情況結果顯示： sY127、sY134 合 并sY105、 sY121、 sY1192、 sY153 和sY160 位點缺失率比較差異無統(tǒng)計學意義，sY254、sY255 合 并sY105、 sY121、 sY1192、 sY153 和sY160 位點缺失率比較差異無統(tǒng)計學意義。在多數(shù)AZFc 區(qū)域缺失的男性患者中，精子發(fā)生已經(jīng)完成，但由于多種原因?qū)е戮訑?shù)減少，甚至出現(xiàn)重度少精癥［19］。導致Y 染色體微缺失的因素較多，如少數(shù)患者可能是遺傳自父親，即Y 染色體微缺失的男性患者，其父親可能也存在Y 染色體微缺失，說明遺傳因素導致的Y 染色體微缺失患者中仍有部分弱精或少精者具有生育能力；此外，還有一些重要因素，如在胚胎發(fā)育早期和（或）母親受孕前2 個月受到物理、化學或生物等外界因素影響時，胚胎中Y 染色體會發(fā)生突變，亦可導致Y 染色體微缺失。現(xiàn)在越來越多的MI 患者選擇通過人工授精技術解決不育難題，如第1 代試管嬰兒的IVF 和第2 代試管嬰兒的單精子胞漿內(nèi)注射 （intracytoplasmic sperm injection， ICSI）。然而，AZF 區(qū)段的微缺失會遺傳給男性后代，因此在進行人工授精之前有必要對MI 患者進行AZF 微缺失 檢測［20-22］。

綜上所述，廣西壯族自治區(qū)東北部地區(qū)的不育男性Y 染色體異常主要發(fā)生在sY1192 和sY153 位點微缺失，其中以sY1192 位點微缺失為主，且隨著年齡增長該位點突變的檢出率呈升高趨勢。