2 型糖尿病患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因及其剪接異構體的表達水平和臨床意義

王嘉欣, 王珍琦, 張 萱

（1.吉林大學第二醫院內分泌科，吉林 長春130041；2.吉林大學公共衛生學院 國家衛健委放射生物學重點實驗室，吉林 長春130021；3.吉林大學第二醫院科研部，吉林 長春130041）

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus， T2DM）是一種以胰島素分泌不足導致高血糖為特征的嚴重而常見的慢性代謝紊亂性疾病，可導致各種代謝并發癥，如心腦血管疾病、糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）、腎病和神經病變等。國際糖尿病聯合會 （International Diabetes Federation，IDF）［1］數據顯示：2019 年全球糖尿病患病率約為9.3%（4.63 億人），到2030 年將上升 至10.2% （5.78 億 人），到2045 年 將 上 升 至10.9%（7.00 億人）。

近年來，全基因組關聯性研究（genome-wide association studies， GWAS）的最新進展已經成功揭示了一些與T2DM 遺傳易感性相關的基因和突變位點。細胞周期蛋白依賴性激酶5 調節亞基相關蛋 白 1 類 似 物 1 （cyclin-dependent kinase 5 regulatory subunit associated protein 1-like 1，CDKAL1）基因是歐洲和亞洲人群中重復性最強的位點之一。目前已鑒定出CDKAL1 的5 個不同風險單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP），均來自內含子：rs4712523［2］、rs6931514［3］、rs7756992［4］、rs10946398［5］和rs9465871［6］。攜帶CDKAL1 基因SNP 的個體患T2DM 的風險較未攜帶者增加2 倍［7］。

糖尿病微血管并發癥與CDKAL1 基因有密切關聯。 在T2DM 患者中發現了CDKAL1 基因（rs7756992、rs4712527 和rs10946398 位點） 與糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN） 之間的關聯［8］，CDKAL1 基 因（rs10946398 和rs7756992 位點）與DR 有關［9-10］。LIU 等［9］發現：與無視網膜病變的糖尿病患者比較， DR 患者CDKAL1（rs10946398） 的遺傳變異有顯著差異。上述研究表明： CDKAL1 可能在糖尿病相關并發癥的發病中起關鍵作用。CDKAL1 基因與T2DM 及其并發癥的關系多集中于SNP 位點上，而關于T2DM 患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因表達水平與糖尿病微血管并發癥關系的研究較少。本研究采用實時 熒 光 定 量 PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 法探討T2DM 患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因及其2 種mRNA剪接異構體CDKAL1-X1 和CDKAL1-X2 表達水平，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2020 年1 月—2021 年3 月在吉林大學第二醫院內分泌科住院的65 例糖尿病患者作為研究對象，患者平均年齡為（45.45±7.49） 歲， 其 中T2DM 無 并 發 癥 患 者20 例（T2DM 組），DN 患 者23 例（DN 組），DR 患 者22 例（DR 組），并選擇同期在吉林大學第二醫院28 名體檢正常者作為健康對照組，平均年齡為（45.70±9.67） 歲。分組標準：T2DM 無并發癥組，患者無并發癥史，如DN、DR 和糖尿病周圍神經病變等；DN 組，根據尿微量白蛋白與尿肌酐的比值（albumin/urine creatinine ratio，ACR） 連續2 次或者2 次以上≥30 mg·g－1的T2DM 患者被診斷為DN，并且通過相關臨床檢查排除其他腎臟疾病；DR 組，符合《眼科學》中關于2 型糖尿病視網膜病變（type 2 diabetic retinopathy，T2DR） 的診斷標準，且經眼底和熒光素眼底血管造影檢查確診為 T2DR；健康對照組：身體健康，無糖尿病家族史，空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）<7.0 mmol·L－1，糖化血紅蛋白<6.5%，無特殊用藥史，來源于本院體檢中心的健康體檢者，均簽署知情同意書。各組研究對象年齡和性別比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 納入和排除標準納入標準：T2DM 診斷標準參照1999 年WHO 糖尿病診斷標準，存在糖尿病癥狀且隨機血漿葡萄糖≥11.1 mmol·L－1或FBG≥7.0 mmol·L－1，或口服葡萄糖耐量試驗2 h 血糖≥11.1 mmol·L－1。排除標準：糖尿病急性并發癥，如糖尿病酮癥和高滲性昏迷等；高血壓；重度肥胖；原發性腎病；泌尿系異常、急（慢）性腎炎或腎盂腎炎或尿路感染等引起的蛋白尿和其他腎損害；嚴重心肺及肝臟病變；發熱；活動后、應激和情緒激動者；曾使用腎毒性或影響尿蛋白排泄的藥物和服用過影響血脂、凝血功能及血尿酸代謝的藥物。

1.3 細胞分離和處理上述糖尿病患者和健康對照者均知情同意后，采集其EDTA 抗凝靜脈血5 mL，抗凝血用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，提取總RNA， 采用焦碳酸二乙酯 （diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理的無菌EP管于－80 ℃條件下保存待檢測。

1.4 RT-qPCR 法檢測各組研究對象外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因表達水平按照紅細胞裂解液說明書裂解紅細胞，按照TRIzol 試劑說明書提取總RNA。RNA 濃度和純度檢測：A（260）/A（280）比值為1.8～2.0，以3 μg RNA 為模板，按照逆轉錄試劑盒操作程序進行逆轉錄合成cDNA。CDKAL1 基因表達及其可變剪切異構體及GAPHD引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。采用美國Agilent Technologies 公司的RT-qPCR 試 劑 盒（Brilliant ⅡSYBR Green qPCR Master Mix）進行RT-qPCR 反應。

表1 RT-qPCR 引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-qPCR

總反應體系為25 μL： 2× SYBR Green qPCR Master Mix 12.5 μL，Primer mix（上下游引物均為10 mmol·L－1）1 μL，ROX Reference dye 0.375 μL，ddH2O 10.125 μL， cDNA 1 μL。 采 用 美 國Stratagene MX3000P 熒 光 定 量PCR 儀， 采 用Comparative Quantitation 方法進行PCR 擴增，RTqPCR 反應條件：預變性95 ℃、30 s，95 ℃、20 s，60 ℃、35 s，共45 個循環；熔解曲線測定95 ℃、1 min ，55 ℃、30 s，95 ℃、30 s， 1 個循環。以GAPDH 基 因 為 內 參 基 因， 采 用2－ΔΔCt法 計 算CDKAL1 基因表達水平。

1.5 統計學分析采用SPSS 26.0 統計軟件進行統計學分析。各組研究對象外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因及其2 種剪接異構體CDKAL1-X1 和CDKAL1-X2 表達水平均不符合正態分布，以中位數和四分位數［M （P25，P75）］ 表示，多組間樣本比較采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

RT-qPCR 法檢測各組研究對象外周血淋巴細胞中CDKAL1、CDKAL1-X1 和CDKAL1-X2 表達水平，以GAPDH 為內參。CDKAL1、CDKAL1-X1、CDKAL1-X2 和GAPDH 在T2DM 患者外周 血中均有表達。與健康對照組比較，T2DM 組患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因表達水平升高（Z=4.705，P<0.01），DN 組 和DR 組 患 者 外 周血淋巴細胞中CDKAL1 基因表達水平均升高（Z=－3.199，P=0.001；Z=－4.950，P<0.01）。與健康對照組比較，T2DM 組患者外周血淋巴細胞中CDKAL1-X1 表達水平升高（Z=2.698，P=0.007），DN 組和DR 組患者外周血淋巴細胞中CDKAL1-X1 表達水平升高（Z=－2.508，P=0.012；Z=－2.814，P=0.005），T2DM 組患者外周血淋巴細胞中CDKAL1-X2 表達水平差異均 無統計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 各組研究對象外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因及其可變剪切異構體表達水平Tab.2 Expression levels of CDKAL1 and its splice isomers of subjects in various groups [M(P25,P75)]

與T2DM 組比較，DN 組和DR 組患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因及其可變剪切異構體表達水平差異無統計學意義（P>0.05）；DR 組患者外周血淋巴細胞中 CDKAL1 基因表達水平略高于DN 組（P<0.05），CDKAL1-X1 和CDKAL1-X2表達水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。

3 討 論

本研究結果顯示：與健康對照組比較，T2DM組患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因和CDKAL1-X1 表達水平升高，而 CDKAL1-X2 表達水平差異無統計學意義；DN 組和DR 組患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因表達和CDKAL1-X1表達水平升高，提示其參與糖尿病及其并發癥的發生發展。

CDKAL1 基因位于染色體6p22.3 上，全長為697 948 bp。CDKAL1 基因異常引起胰島素分泌減少［11-12］，在β 細胞功能障礙和易感性的病理生理學中起關鍵作用［13-14］。因此，CDKAL1 基因被多項研究［15-18］證實為T2DM 的易感基因，目前已發現CDKAL1 基因的SNPs 位點1.6 萬個，與T2DM 相關的SNPs 位于深層內含子區域，因此在中國人群中CDKAL1 基 因 的SNPs 存 在 不 確 定 性［19］。本 文作者發現：T2DM 組患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因和CDKAL1-X1 表達水平較健康對照組升高，提示CDKAL-X1 在T2DM 中發揮主要作用。既往國內對于T2DM 患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因表達研究較少，研究［20］顯示：在DN 患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因表達水平升高，而國內至今尚無關于CDKAL1 剪接異構體的表達水平的研究。ZHOU 等［21］研究發現一種獨特的CDKAL1 特殊剪接變異，稱為CDKAL1-V1，其可下調細胞中CDKAL1 基因表達及蛋白翻譯水平，且這種特殊剪接變異體周圍聚集大量與T2DM發病相關的SNPs。HOSSEINIPOOR 等［22］檢測到T2DM 患者外周血單個核細胞中晚期糖基化終產物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）、沉默信息調節因子1（silent information regulator 1，Sirt1）和核轉錄因子NF-E2 相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）基因表達水平升高，但未檢測出CDKAL1 基因。

本研究結果顯示：T2DM 患者并發DN 和DR時，CDKAL1 基因和CDKAL1-X1 表達水平升高。與DN 組比較，DR 組患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因表達水平升高更明顯。研究［20］顯示：DN 患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因表達水平升高，與本研究結論一致。SHATAF 等［23］研究7 個T2DM 易感基因表達，結果顯示：WFS1 和NOTCH2 基因表達改變可能在DN 發生發展中起作用。本研究結果顯示：T2DM 微血管并發癥患者中，T2DM 易感基因CDKAL1 及其剪接異構體表達發生變化。由于血漿樣本較易得，以其為樣本的基因表達研究更多是采用RT-qPCR 法尋找潛在生物標志物，探討T2DM 發生發展的機制，但這些機制目前尚不十分明確。血液指標可以反映患者全身代謝情況的變化，但是難以反映腎臟和眼局部病變的代謝情況，且個體差異較大，導致結果重復性差，仍需更多的研究來驗證這些結論。本研究局限性：尚未討論基因表達與糖尿病患者臨床檢驗指標的關系；研究的樣本量較少，有待進一步開展大樣本的研究。

本研究針對T2DM 患者外周血淋巴細胞中易感基因CDKAL1 表達及其剪接異構體進行初步研究，結果顯示：T2DM 患者外周血淋巴細胞中CDKAL1 基因及其剪接異構體CDKAL1-X1 的表達水平較健康對照者升高，證明T2DM 及其并發癥患者外周血淋巴細胞中易感基因及其剪接異構體表達水平不同，本研究結論可為深入了解T2DM 的發病機制提供依據。