基于嘌呤配體P2X門控離子通道型受體7的資生腎氣丸鎮痛機制研究

李文昊 任鵬鵬 韓潔茹 常佳怡 解 穎 陳 飛 李富震 姜德友

(1 黑龍江中醫藥大學,哈爾濱,150040; 2 哈爾濱醫科大學附屬第一醫院中西醫結合科,哈爾濱,150000)

痛風性關節炎(Gouty Arthritis,GA)是尿酸鈉晶體沉積所引起的一種嚴重疼痛性關節炎[1],其急性發作被認為是最痛苦的癥狀之一,與分娩或內臟絞痛同等程度[2]。即使是晚期痛風患者也常常表現為慢性關節疼痛、腫脹、運動受限和痛風復發。資生腎氣丸(Zisheng Shenqi Decoction,ZSD)是姜德友教授經過多年研究,結合臨床實踐,創制的純中藥復方。具有補腎利濕、標本兼顧之功,前期的臨床觀察、網絡藥理學及實驗研究已初步證實ZSD治療GA疼痛及炎癥反應具有顯著的改善作用[3-6],可能與P2X7R/NLRP3/NEK7信號通路及COX-2/PGE2信號通路有關[7-8]。

NOD樣受體蛋白3[Nucleotide Binding Domain(NOD)-like Receptor Protein 3,NLRP3]是GA炎癥反應的主要參與者,近年來研究發現其與嘌呤配體P2X門控離子通道型受體7(Purinergic Receptor P2X,Ligand-gated Ion Channel 7,P2X7R)、NIMA相關激酶7(NIMA-related Kinase 7,NEK7)的關系密切[9-10],三者在GA疼痛及炎癥反應的發作中起到關鍵作用,但具體機制尚不清楚。因此,為了進一步探索ZSD對GA疼痛的具體調控機制,本實驗采用小鼠冰醋酸扭體致痛模型復制疼痛反應,觀察小鼠扭體次數,計算其扭體抑制率,并且應用酶聯免疫吸附技術)檢測相關疼痛因子白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)、神經生長因子(Nerve Growth Factor,NGF)含量,采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測P2X7R/NLRP3/NEK7信號通路中mRNA的表達情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 體質量18～22 g的健康雄性C57BL/6小鼠42只,6～8周齡,購自遼寧長生生物技術股份有限公司,許可證號SCXK(遼)2015-0001。動物實驗室為高清潔級,飼養溫度(22±1)℃,相對濕度45%～55%,通風條件良好,室內自然光照,符合《GB 14925-2010實驗動物環境及設施》要求[11]。

1.1.2 藥物 ZSD處方由熟地黃、山藥、茯苓、牡丹皮、懷牛膝、土茯苓等組成[7],方中藥材從黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院中藥房一次性選購。痛風舒片(湖北綠金子藥業有限責任公司,批號:140301),吲哚美辛(阿拉丁,批號:CAS53-86-1),冰醋酸(阿拉丁,批號:CAS64-19-7)。

1.1.3 試劑與儀器 IL-1β酶聯免疫吸附試驗檢測試劑(武漢優爾生公司，貨號：SEA563Mu)；PGE2酶聯免疫吸附試驗檢測試劑盒(武漢優爾生公司，貨號：MEA538Ge)；NGF酶聯免疫吸附試驗檢測試劑盒(武漢優爾生公司，貨號:SEA105Mu);酶標儀(BIOTEK公司,美國,型號:ELX-800);電熱恒溫培養箱(天津泰斯特公司,型號:DH36001B);實時PCR儀(BIONEER公司,韓國,型號:Exicycler 96)等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 42只雄性C57BL/6小鼠適應性喂養1周后,隨機分為7組,即空白組、模型組、痛風舒對照組、吲哚美辛對照組,ZSD低劑量組、ZSD中劑量組、ZSD高劑量組,每組6只。模型制備:除空白組外,其余各組小鼠分別腹腔注射0.6%冰醋酸生理鹽水溶液0.2 mL/只[12],空白組注射等量生理鹽水。分別觀察并記錄注射冰醋酸后10 min、15 min、20 min內小鼠的扭體次數,小鼠出現腹部內凹、身體扭曲、軀干與后腿伸展、臀部高起、蠕行反應為扭體反應[13],出現任意一項計為1次。

末次記錄各組小鼠扭體次數后,以心臟采血法采集小鼠外周血。先將小鼠以7%水合氯醛腹腔注射麻醉,打開胸腔,暴露心臟,用一次性采血針針頭刺入右心室,吸取3.5 mL血液,并移入以小鼠組別編號的離心管內,靜置1 h,625×g離心10 min,取上清液,移入對應編號的EP管,-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 給藥方法 已知成年人標準體質量為70 kg,ZSD方中藥物總重量為225 g,即成年人1 d口服用量。根據徐叔云等主編的《藥理實驗方法學》可知[14],小鼠每日灌胃劑量約是成年人每日服用量的9.1倍。由此可知,痛風舒對照組給予痛風舒片混懸液0.26 g/kg;吲哚美辛對照組給予吲哚美辛溶液9.75 mg/kg;按照低∶中∶高=1∶2∶4比例計算[15];ZSD低劑量組、ZSD中劑量組、ZSD高劑量組分別給藥1.5 g/mL、3 g/mL、6 g/mL,依據小鼠每日的體質量變化給藥。空白組及模型組用等體積蒸餾水灌胃。各組均于造模前6 d開始給相應的藥物或給蒸餾水灌胃,2次/d,連續7 d,末次給藥1 h后造模。

1.2.3 檢測指標與方法 1)對小鼠一般狀態的觀察:觀察各組小鼠攝食、飲水、體質量、排泄、活動及精神狀態等一般情況。2)統計小鼠扭體次數并計算小鼠扭體抑制率:扭體抑制率(%)=(模型組扭體次數-給藥組扭體次數)/模型組扭體次數×100%[16]。3)酶聯免疫吸附試驗檢測小鼠血清中IL-1β、PGE2、NGF、P物質、5-羥色胺的表達:酶聯免疫吸附試驗試劑按標簽說明2～8 ℃儲存,使用前恢復到室溫,并充分搖勻,以避免試劑產生泡沫,造成浪費,按照試劑盒說明書進行操作。4)RT-PCR檢測小鼠血清中P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA的表達:a.提取總RNA。b.RNA濃度檢測:使用紫外分光光度計NANO 2000測定各樣本中RNA的濃度。c.反轉錄,引物的合成與設計,引物由金斯瑞生物科技有限公司根據Primer Premier 5軟件合成,引物序列見表1。

表1 擴增各靶基因的引物序列

1.3 統計學方法 全部數據使用IBM SPSS 22.0統計軟件進行數據分析,計量資料若滿足正態性和方差齊性,則應用單因素ANOVA;不滿足正態性和方差齊性時給予非參數檢驗中Kruskal-WallisH檢驗,P<0.05為差異有統計學意義;多組比較,數據滿足正態性和方差齊性時,采用單因素方差分析,不滿足正態性和方差齊性時采用非參數檢驗中Kruskal-WallisH檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ZSD對小鼠灌胃后的一般情況的影響 除空白組、模型組一般情況良好外,吲哚美辛對照組中部分小鼠逐漸出現飲食、飲水減少,腹瀉,精神萎靡,毛發暗淡無光,活動減少等表現。痛風舒對照組中部分小鼠亦逐漸出現精神萎頓,活動減少表現。ZSD各劑量組小鼠飲食及二便皆正常,活動靈活,精神飽滿,尤其以ZSD高劑量組中小鼠的一般情況最佳。

2.2 ZSD對冰醋酸致小鼠扭體反應次數以及扭體抑制率的影響 與模型組比較,在10 min及15 min時,吲哚美辛對照組、痛風舒對照組及ZSD高劑量組中扭體次數顯著降低(P<0.05),扭體抑制率均明顯升高(均P<0.05);在20 min時,ZSD低劑量組及ZSD中劑量組的扭體次數亦降低(P<0.05),扭體抑制率亦升高(P<0.05)。與吲哚美辛對照組比較,在10 min及15 min時,ZSD低劑量組扭體次數較高(P<0.05),扭體抑制率降低(P<0.05),而ZSD中劑量組及ZSD高劑量組差異無統計學意義(P>0.05);在20 min時,ZSD各劑量組差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1A 各組小鼠不同時間點的扭體次數 圖1B 各組小鼠不同時間點的扭體抑制率注:空白組中小鼠各時間點的扭體反應次數為0,扭體抑制率為100%,不參與比較;與模型組比較,*P<0.05;與吲哚美辛對照組比較,△P<0.05

2.3 ZSD對小鼠血清IL-1β、PGE2、NGF表達的影響 與空白組比較,模型組中IL-1β、PGE2、NGF的表達均明顯升高(均P<0.05)。與模型組比較,吲哚美辛對照組、痛風舒對照組、ZSD中劑量組及ZSD高劑量組中IL-1β及PGE2的表達均下降(均P<0.05);吲哚美辛對照組、痛風舒對照組及ZSD高劑量組中NGF的表達亦下降明顯(P<0.05)。與吲哚美辛對照組比較,ZSD低劑量組及ZSD中劑量組中IL-1β、PGE2表達差異有統計學意義(P<0.05),痛風舒對照組及ZSD高劑量組則沒有差異;ZSD低劑量組中NGF的表達差異有統計學意義(P<0.05),其他用藥組則差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠血清IL-1β、PGE2、NGF的表達情況

2.4 ZSD對P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA表達的影響 與空白組比較,模型組中P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA的表達量均明顯升高(P<0.05)。與模型組比較,吲哚美辛對照組、痛風舒對照組及ZSD高劑量組中P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA的表達均降低(均P<0.05)。與吲哚美辛對照組比較,痛風舒對照組中P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA表達降低,ZSD低劑量組及ZSD中劑量組3者的表達均升高(均P<0.05),但ZSD高劑量組3者的表達差異無統計學意義(P>0.05)。各給藥觀察組中,痛風舒片、ZSD高劑量及吲哚美辛均可明顯降低小鼠血清中P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA的表達,其中ZSD高劑量與吲哚美辛療效相近,而ZSD低劑量、中劑量療效不明顯。見圖2。

圖2 各組小鼠P2X7RmRNA、NLRP3mRNA及NEK7mRNA的表達情況注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05;與吲哚美辛對照組比較,▲P<0.05

3 討論

3.1 ZSD對小鼠扭體次數及扭體抑制率的影響 根據實驗數據可得,各組治療藥物均能降低小鼠扭體次數,增加扭體抑制率,達到鎮痛效果。進一步分析扭體抑制率可知,在15 min時,ZSD低劑量、中劑量的扭體抑制率比10 min時略有降低,而在20 min時明顯升高。并且在20 min時,與模型組比較,ZSD各劑量組的扭體次數均顯著降低,扭體抑制率顯著增高。但在20 min時,ZSD各劑量均具有明顯的鎮痛作用,其療效與痛風舒片及吲哚美辛相近。

3.2 ZSD對多種疼痛因子的調控作用 隨著炎癥細胞中NLRP3炎癥小體激活,作為疼痛和炎癥反應核心的IL-1β被釋放如細胞外及血液中,誘導并產生更多的炎癥介質及趨化因子[17]。臨床研究發現,GA患者的疼痛與IL-1β、IL-6、IL-8的水平正相關[18]。在與GA相似的骨關節炎的研究中,亦發現外周血白細胞中IL-1β基因的高表達與疼痛增加相關[19],并且IL-1β與關節炎緩解后疼痛的持續或復發有關[20]。IL-1β亦可通過向下丘腦發出炎癥疼痛信號參與傳入疼痛反應,促進痛覺過敏[21],并誘導下丘腦產生PGE2。最新研究表明PGE2亦與GA的疼痛機制相關[22],其可通過致敏和興奮作用與組胺、緩激肽協同作用,增強組織對疼痛遞質和因子的敏感性,從而引起疼痛并加重疼痛[23-24]。除PGE2外,NGF亦與關節疼痛及關節軟骨細胞和滑液中的炎癥有關[25-26]。有學者在人類細胞培養中發現IL-1β對正常和骨關節炎成纖維細胞的NGFmRNA和蛋白的表達具有調控作用[27]。

本實驗發現模型組組小鼠血清中IL-1β、PGE2及NGF表達明顯高于空白組,提示IL-1β、PGE2及NGF與小鼠疼痛反應密切相關。與模型組比較,吲哚美辛對照組、痛風舒對照組及ZSD高劑量組的藥物均能夠明顯下調IL-1β、PGE2及NGF的表達。由此可知,ZSD可通過下調IL-1β、PGE2及NGF的表達發揮鎮痛作用。在ZSD各劑量組中,以ZSD高劑量下調IL-1β及PGE2的效果最佳。

3.3 ZSD對P2X7R、NLRP3、NEK7的調控作用 通過國內外研究可知,在免疫系統激活的條件下,細胞釋放ATP,ATP通過P2X7R促進細胞內外離子環境改變[28],進而調控NEK7、NLRP3的表達,促進IL-1β等炎癥介質及疼痛介質的分泌,從而引起炎癥反應及疼痛[10]。本研究進一步發現,模型組中P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA的表達均明顯高于空白組,可知在醋酸致小鼠扭體模型中,P2X7R、NLRP3、NEK7均在轉錄水平參與疼痛反應。而吲哚美辛、痛風舒片及ZSD各劑量在轉錄水平上對P2X7R、NLRP3、NEK7具有調控作用。研究亦發現,與ZSD低劑量、中劑量比較,ZSD高劑量對P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA的調控作用更強。結合扭體次數及扭體抑制率結果可推測,ZSD高劑量的鎮痛效果更佳,療效與吲哚美辛及痛風舒片相近,這提示ZSD高劑量對小鼠疼痛反應的抑制作用更強有關。

值得一提的是,通過觀察小鼠的一般情況發現,吲哚美辛對照組中小鼠出現諸多消化系統異常的癥狀,如大便偏稀,毛色暗淡,精神萎頓等表現,可見雖然吲哚美辛鎮痛效果顯著,但其不良反應明顯。痛風舒對照組中小鼠亦出現明顯的精神倦怠表現,這可能與痛風舒片的功效側重清熱利濕,忽略補益脾腎有關。而ZSD各劑量組小鼠的飲食、排泄均無異常,且精神飽滿,尤其以ZSD高劑量組的一般情況最佳,可見ZSD扶正祛邪,標本同治之功強于痛風舒片及吲哚美辛。

綜上所述,在醋酸致小鼠扭體模型中,ZSD降低小鼠扭體次數,提高扭體抑制率從而發揮鎮痛效果的機制可能與其在轉錄水平調控P2X7R/NLRP3/NEK7信號通路,抑制P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA的表達,進一步下調IL-1β、PGE2及NGF的表達有關。且ZSD對扭體小鼠的鎮痛效果呈劑量依賴性增加,與ZSD低劑量、中劑量比較,ZSD高劑量的鎮痛效果更佳,且無不良反應。因此,在ZSD高劑量鎮痛效果與吲哚美辛及痛風舒片相近的條件下,選擇ZSD治療GA更加符合臨床實踐。這一發現可為ZSD調控GA疼痛機制的深入研究提供理論依據。

利益沖突聲明:無。