腦膠質瘤組織中FOXC1 mRNA的表達水平及其與預后的相關性

張躍欣，蘇博，趙墨，魏康康，周國平

南陽市中心醫院神經外科1、病理科2，河南 南陽 473000

腦膠質瘤是起源于顱內神經系統的惡性腫瘤，發生率高達50%左右，位居顱內惡性腫瘤的首位[1]。膠質瘤具有生長迅速、易侵襲轉移且術后復發率較高等特點[2]。膠質瘤治療手段較為局限，臨床上常規采用手術聯合放化療治療，但治療效果較差，術后復發率約為25%[3]。因此，早期明確腦膠質瘤的發病機制和治療靶點成為近年來的研究熱點。叉頭框C1(FOXC1)是叉頭框(forkhead box，FOX)家族成員之一，FOXC1主要參與細胞的增殖、分化及凋亡等生理過程[4]，近年來發現FOXC1異常表達與多種惡性腫瘤諸如乳腺癌、胰腺癌及肺癌等發病機制密切相關[5]，然而，目前鑒于FOXC1在人腦膠質瘤組織中的表達水平尚不完全清楚，本研究通過采用生物信息學分析TCGA 數據庫中腦膠質瘤組織中FOXC1 mRNA 的表達及其與預后的關系，并進一步采用獨立樣本進行FOXC1表達水平的驗證，以期為腦膠質瘤的治療靶點提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 數據庫來源 TCGA 數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/) 和TIMER 數 據 庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)。

1.2 研究方法

1.2.1 FOXC1在腦膠質瘤組織中的表達 TCGA數據庫中下載腦膠質瘤組織中的基因表達數據，其中包括701例腦膠質瘤組織及50例正常腦組織，樣本中FOXC1 mRNA表達水平采用Log2進行轉換。

1.2.2 臨床預后分析 下載并分析TCGA 數據庫中腦膠質瘤患者的預后資料，具體包括性別、年齡、組織學類型、WHO分型、IDH狀態、1p/19q 共缺失等臨床-病理資料。多因素COX回歸分析腦膠質瘤患者預后的影響因素，采用K-M 曲線分析腦膠質瘤組織中FOXC1表達和總體生存率的關系。

1.2.3 HNSCC 免疫浸潤細胞分析 腦膠質瘤組織中FOXC1 表達水平與免疫細胞浸潤程度的相關性采用TIMER數據庫進行分析。

1.2.4 獨立樣本驗證 獲取2022 年1～6 月于我院就診的20例腦膠質瘤和20 例腦外傷患者的石蠟切片，20 例腦膠質瘤患者男8 例，女12 例，平均年齡(54.12±6.12)歲；20例腦外傷患者男9例，女11例，平均年齡(55.23±7.66)歲，兩組性別及年齡比較差異無統計學意義(P＞0.05)。本研究經過我院醫學倫理委員會批準(YXLL2021-0045)。40 例標本進行脫蠟、水化等修復后浸入3%H2O2溶液，并在室溫中孵育30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1 次，采用山羊血清(10%濃度)封閉30 min，PBS洗滌1次加入一抗后繼續孵育6 h，PBS洗滌1次后再次加入二抗孵育2 h，最后采用蘇木精染色及中性樹膠封片。參考本課題組前期發表的文獻[6-7]，腦膠質瘤組織中FOXC1 陽性表達水平采用細胞染色強度及染色率計算，細胞染色強度分為無著色(0 分)、淡黃色(1分)、棕黃色(2分)和棕褐色(3分)，細胞染色率為0 (0 分)、0～25% (1 分)、26%～50% (2 分)、51%～75%(3 分)和76%～100%(4 分)。細胞染色強度得分×細胞染色率得分為腦膠質瘤組織中FOXC1表達水平，得分≤3分為FOXC1低度表達，3 分＜得分≤6分為FOXC1中度表達，6 分＜得分為FOXC1 高度表達。兔源性FOXC1 單克隆抗體、SP 免疫組化染色試劑盒及二抗(HRP 標記羊抗兔IgG)均購買于上海碧云天生物試劑有限公司(上海，中國)。

1.3 統計學方法 采用R 軟件(4.2.2)分析資料。腦膠質瘤組織和正常組織中FOXC1 mRNA 表達數據不符合正態分布，兩組間比較采用U檢驗，腦膠質瘤患者預后的危險因素采用COX 回歸分析，FOXC1 mRNA 表達水平與患者生存率的關系采用K-M 曲線分析，Spearman 分析FOXC1 mRNA 表達水平與免疫細胞浸潤程度的相關性。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FOXC1 在腦膠質瘤組織中的表達 701 例腦膠質瘤組織和50 例正常腦組織中FOXC1 mRNA表達水平分別為1.87(1.54，2.16)和1.61(1.14，1.92)，與正常腦組織比較，腦膠質瘤組織中FOXC1 mRNA表達水平顯著升高，差異具有顯著統計學意義(U=23.12，P＜0.01)。

2.2 FOXC1表達和腦膠質瘤患者預后的關系 經K-M 曲線分析結果顯示，腦膠質瘤中FOXC1 高表達和低表達中位生存時間分別為933 d 和2 835 d，腦膠質瘤中FOXC1高表達生存率顯著降低(HR=1.76，95%CI：1.25～2.49，P=0.001)，見圖1。

圖1 腦膠質瘤組織中FOXC1 mRNA表達和患者生存率關系的K-M曲線Figure 1 Association between FOXC1 mRNA expression and survival rate in glioma by K-M curves analysis

2.3 腦膠質患者預后的影響因素 經多因素COX 回歸分析證實，年齡(＞40 周歲)、WHO 分級(G3)、IDH 狀態(突變型)、1p/19q 共缺失(非共缺失)和FOXC1 表達(高表達)均是腦膠質瘤患者預后的獨立影響因素(P＜0.05)，見表1。

表1 腦膠質瘤患者預后影響因素的多因素Cox回歸分析Table 1 Multivariate Cox regression analysis of prognostic factors in patients with glioma

2.4 腦膠質瘤組織中FOXC1 mRNA表達和免疫細胞浸潤程度的相關性 經Spearman 相關性分析結果顯示，腦膠質瘤組織中FOXC1 mRNA表達和中性粒細胞(r=0.433，P＜0.001)、巨噬細胞(r=0.400，P＜0.001)、嗜酸性細胞(r=0.365，P＜0.001)等細胞浸潤程度呈顯著正相關，與Tgd 細胞(r=-0.115，P＜0.05)、TFH 細胞(r=-0.158，P＜0.001)及pDC 細胞(r=-0.207，P＜0.001)浸潤程度呈顯著負相關，見圖2。

圖2 腦膠質瘤組織中FOXC1 mRNA 表達和免疫細胞浸潤程度的相關性Figure 2 Correlation between FOXC1 mRNA expression and the degree of immune cell infiltration in glioma tissue

2.5 腦膠質瘤組織及正常組織中FOXC1 mRNA表達的免疫組化驗證 進一步采用獨立樣本驗證腦膠質瘤組織中FOXC1 mRNA 的表達水平，納入20 例腦膠質瘤組織和20例健康腦外傷的腦組織，采用免疫組化探討發現，20 例腦膠質瘤組織中FOXC1 高度陽性表達14 例，中度陽性表達6 例，正常腦組織中FOXC1均無表達，差異有顯著統計學意義(χ2=15.000，P＜0.001)，見圖3。

圖3 膠質瘤組織中FOXC1高度陽性表達(比例尺=100 mm)Figure 3 FOXC1 was highly expressed in glioma tissue(scale=100 mm)

3 討論

腦內膠質細胞異常增殖形成腦膠質瘤，星形細胞瘤是最為常見的病理類型之一，腦膠質瘤易浸潤生長，邊界不清，手術難以完全切除，且對放化療不敏感，研究發現手術聯合放化療的患者術后1 年和2 年生存率約為78%和60%[8]，且病理分級越高，患者中位生存時間越短[9]。目前關于腦膠質瘤的具體發病機制尚不清楚，深入探討腦膠質瘤的致病機制和治療靶點對提升患者臨床預后具有重要的價值。

FOXC1 近年來被證實與多種惡性腫瘤的發病機制密切相關，一項Meta 分析研究結果證實，在各種癌癥中，FOXC1蛋白高表達與患者較差的生存結局顯著相關，尤其是在乳腺癌患者中，且FOXC1 蛋白表達可作為多種癌癥患者不良預后的生物學標志物[10]。羅倩等[11]采用免疫組化證實FOXC1 在胰腺癌組織中顯著高表達，且FOXC1 高表達組中位生存時間顯著低于FOXC1 低表達組。此外，李立明等[12]發現肺癌A549細胞株中FOXC1 蛋白及mRNA 水平顯著上調，沉默FOXC1 后能顯著降低A549 細胞株的增殖和侵襲能力。彭聰等[13]進一步發現干擾FOXC1 后能顯著逆轉非小細胞肺癌對化療藥物吉非替尼的耐藥性。目前關于FOXC1 在人體腦膠質瘤組織中的表達水平的相關性研究較少，本研究通過采用生物信息學數據證實腦膠質瘤組織中FOXC1 mRNA 表達水平顯著升高，FOXC1 高表達組生存率較低，且COX 多因素回歸分析進一步證實FOXC1 表達(高表達)是腦膠質瘤患者預后的獨立影響因素，因此，本研究結果均提示FOXC1 可作為腦膠質瘤患者預后的一項生物學標志物。李元元等[14]發現腦膠質瘤U251 細胞中FOXC1 mRNA 和蛋白表達水平均顯著升高，且FOXC1 沉默后能顯著抑制腦膠質瘤細胞的增殖并促進其凋亡，在機制上可能與調控Notch通路有關，此外，在缺氧條件下，FOXC1 也受到缺氧誘導因子HIF 的調控，HIF-2a可上調FOXC1的表達而促進腦膠質瘤的局部侵襲[15]；另一方面，膠質母細胞瘤中FOXC1高表達與術后高復發率和腦膠質瘤對替莫唑胺耐藥有關，當細胞中FOXC1 表達下調后可顯著增加替莫唑胺誘導下的腫瘤細胞凋亡水平[16]。

腫瘤微環境異常在惡性腫瘤的發病機制中同樣扮演了重要作用，免疫細胞是腫瘤微環境的重要組成部分[17]。本研究發現腦膠質瘤組織中FOXC1 表達與中性粒細胞浸潤程度呈現顯著正相關性，外周血中性粒細胞數量可鑒別低級別和高級別腦膠質瘤，外周血中性粒細胞數量在高級別腦膠質瘤患者中相對較高[18]。活化的中性粒細胞釋放的DNA 組蛋白和蛋白質組成的網狀結構被稱為中性粒細胞胞外誘捕網(NETs)，NETs 可激活多種信號通路促進腦膠質瘤的發生發展[19]。Zha 等[20]發現，與低級別腦膠質瘤比較，高級別腦膠質瘤組織中中性粒細胞浸潤和NETs形成較為顯著，NETs過度產生可促進腦膠質瘤細胞的惡性生物學行為，NETs 可通過活化NF-κB 信號通路并促進膠質母細胞瘤中IL-8 的大量分泌，隨后，IL-8可招募中性粒細胞并進一步促進腦膠質瘤的進展。除中性粒細胞外，本研究同樣發現FOXC1與巨噬細胞浸潤程度呈現顯著正相關性，與Tgd 細胞、TFH 細胞(r=-0.158，P＜0.001)及pDC細胞呈現顯著負相關性，提示在腦膠質瘤中，FOXC1可通過調節多種免疫細胞的浸潤程度而參與腦膠質瘤的發生發展。為進一步驗證FOXC1在腦膠質瘤中的表達，我們采用免疫組化法發現FOXC1 在腦膠質瘤組織中多數呈現高度陽性表達，而在正常腦組織均無表達，這結果也間接證實本研究中生物信息學的數據結果。

綜上所述，腦膠質瘤中FOXC1 顯著高表達，FOXC1 可作為影響腦膠質瘤患者預后的一項生物學標志物，然而，FOXC1 如何參與調控腦膠質瘤發生發展的具體機制仍是我們下一步研究的方向。