富馬酸二甲酯調節巨噬細胞極化狀態對原發免疫性血小板減少癥小鼠的治療效果①

宋傳龍 焦紅杰 海力其古麗·努日丁 趙 莉 嚴 媚

（新疆醫科大學第一附屬醫院兒內一科，烏魯木齊 830054）

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是一種常見的獲得性自身免疫性疾病，其特征是抗血小板自身抗體介導的血小板生成減少和血小板破壞增加，導致血小板計數降低。ITP 患者出血表現出高度異質性，皮膚黏膜出血是最常見的臨床表現，嚴重時可出現內臟或顱內出血，危及患者生命［1-2］。近年來，國內外均對ITP 進行了大量研究，但其發病機制和病理生理學過程仍未完全闡明，在一定程度上限制了ITP 治療方法的開發。目前，大多數ITP 患者需要進行脾切除術或長期使用糖皮質激素、血小板生成素以及免疫抑制劑等進行治療，但一些患者治療無效、治療后復發等問題使上述方法未取得理想效果［3］。因此，尋找新型安全的ITP有效療法或藥物是當前研究的重點內容。

富馬酸二甲酯（dimethyl fumarate，DMF）是一種富馬酸甲酯，作為工業化學中常用的化合物，價格低廉且易于獲得，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、神經保護和免疫調節等特性，長期攝入不會產生嚴重的副作用，已被批準和注冊用于治療銀屑病和復發緩解型多發性硬化［4-5］。此外，DMF已顯示出調控細胞多種生物學過程和信號轉導的作用［6］。鑒于ITP 作為一種自身免疫性炎癥性疾病以及DMF 在治療免疫性疾病中的潛在作用，已有研究報道表明DMF 顯著抑制了抗血小板抗體誘導的血小板破壞，從而對ITP 小鼠起到了一定的改善作用，但該作用的具體機制尚未明確［7］。本研究通過誘導構建ITP 小鼠模型，進一步評估DMF 是否可以改善或抑制ITP 小鼠模型中血小板減少，測定血常規指標、細胞因子水平、臟器指數、脾臟與股骨內巨核細胞等變化情況，并探究ITP 小鼠巨噬細胞極化狀態，較為綜合地探討DMF 對ITP 的效果及作用機制，為臨床合理用藥提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 實驗用BALB/c 小鼠共60 只，雌雄各半，8周齡，體質量18～20 g，豚鼠共6只，雌雄各半，體質量220～250 g，均飼養于SPF 級動物飼養實驗室內，室溫為22～26 ℃，相對濕度45%～55%，光照周期12 h/12 h 明暗交替，期間自由飲食飲水，所用飼料、水及墊料均經高溫高壓消毒處理。本研究經新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會審核通過（倫理審批號：20211215-07）。

1.1.2 主要試劑 DMF、完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑購于美國Sigma 公司；IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-17 及TGF-β1 ELISA 測定試劑盒購于上海瑞齊生物技術公司；HE 染色試劑盒購于北京百奧萊博科技公司；免疫熒光染色試劑盒和DAPI 染液購于上海碧云天生物研究所；鼠抗CD68 單克隆抗體、鼠抗F4/80-PE 單克隆抗體、鼠抗CD86-PE 單克隆抗體、鼠抗CD206-FITC單克隆抗體及生物素標記的山羊抗兔IgG抗體購于英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 ITP 模型構建 參考文獻［8］制備豚鼠抗BALB/c 小鼠血小板血清（GP-APS），通過腹腔注射GP-APS 建立ITP 小鼠模型。將BALB/c 小鼠置于含乙醚的環境中麻醉，摘眼球取血，以乙二胺四乙酸二鈉抗凝，離心分離出血小板，利用0.9%氯化鈉稀釋；將分離的血小板分別與等量完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑混合，以此作為抗原，注射開始記為0 周，將含完全弗氏佐劑抗原注射于豚鼠足掌、背部、腹部及皮下，每次至少4 點，在第1、2、4 周，將含不完全弗氏佐劑抗原注射于相同部位，每次至少4 點。第5 周，通過豚鼠心臟采集全血，置于離心機以1 500 r/min 離心10 min，收集上清，即為GP-APS，檢測抗血清效價及最佳稀釋濃度，貯存于-20 ℃冰箱。小鼠適應性飼養1 周后，將GP-APS 置于56 ℃水浴鍋內孵育30 min，用0.9%氯化鈉按照1∶4 的比例稀釋GP-APS，取需要構建ITP模型的小鼠，于1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d，分別腹腔注射100 μl稀釋后的GP-APS，使小鼠血小板持續性降低。同時，對照組小鼠腹腔注射等體積0.9%氯化鈉，造模第2、4、6、8、10、12、14 天，采集小鼠靜脈血，全自動血液分析儀測定血小板數目。

1.2.2 實驗分組與給藥 實驗分為對照組、ITP組、DMF 低劑量組和DMF 高劑量組，每組15 只小鼠。ITP 組、DMF 低劑量組和DMF 高劑量組的小鼠均構建ITP 模型。建模成功后，DMF 低劑量組和DMF 高劑量組小鼠分別按10 mg/kg、20 mg/kg 劑量灌胃DMF 進行處理，1 次/d，連續14 d。對照組和ITP 組同時以等量0.9%氯化鈉灌胃，1 次/d，連續14 d。

1.2.3 外周血血常規測定 給藥結束后，各組小鼠均通過腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉后，剪尾收集外周血，采用全自動動物血液分析儀檢

測小鼠血小板（PLT）、紅細胞（RBC）、白細胞（WBC）以及血紅蛋白（Hb）水平。

1.2.4 ELISA 法 心臟采血法收集各組小鼠外周血，室溫靜置2 h，4 000 r/min 離心5 min，收集上清，ELISA 法測定血清內細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-17及TGF-β1的水平變化，嚴格按照試劑盒說明書進行。用酶標儀在450 nm 處檢測OD 值，繪制標準曲線，計算各細胞因子含量。

1.2.5 臟器指數測定 實驗后，電子天平稱取各組小鼠體質量，取血結束后處死小鼠，無菌環境下剝離胸腺組織和脾臟組織，稱量胸腺組織與脾臟組織的質量，計算脾臟指數與胸腺指數。計算公式為：胸腺指數=胸腺質量（mg）/體質量（g）；脾臟指數=脾臟質量（mg）/體質量（g）。

1.2.6 HE 染色 處死各組小鼠，剝離脾臟組織與右側股骨組織，清洗干凈后，4%多聚甲醛固定。將股骨組織置于10%硝酸中脫鈣處理2 h。將固定好的脾臟組織與脫鈣固定的骨髓組織進行常規石蠟包埋，切成厚度約為4 μm的組織切片，脫蠟脫水，蘇木精染液染色5 min，1%鹽酸乙醇分化數秒，伊紅染液染色30 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察組織內巨核細胞，攝取圖像，計數每個載玻片的5 個隨機不同區域內巨核細胞數目，計算平均值。

1.2.7 免疫熒光染色 取制備的對照組、ITP 組和DMF 高劑量組小鼠脾臟組織石蠟切片，通過二甲苯脫蠟與梯度乙醇脫水后，浸入檸檬酸溶液中置于微波爐高溫加熱修復抗原12 min，冷卻后用PBS洗滌，加入0.3% TritonX-100 置于37°C 下孵育15 min，使用5%山羊血清室溫封閉1 h，將稀釋后的CD68 和CD86或CD206（1∶500）滴在切片上進行標記，4 ℃孵育過夜；第2 天，PBS 洗滌切片后，加入稀釋后的TRITC 標記山羊抗兔IgG（1∶500），室溫避光孵育1 h，PBS 洗滌后，加入DAPI 復染細胞核10 min，使用抗猝滅劑封片，在熒光顯微鏡下觀察，每張切片隨機選擇5 個不同視野攝取圖像，計數標記的陽性細胞與總細胞，計算陽性表達水平，結果取平均值。

1.2.8 流式細胞術 將對照組、ITP組和DMF高劑量組小鼠的外周血置于經抗凝處理的試管內，在離心機中以4 000 r/min 離心10 min，留沉淀，并加入PBS 稀釋混勻，根據單核細胞分離液試劑盒說明書進行操作，分離獲得單核細胞，接種于6 孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養箱培養，每隔2 d換液1次，收集培養1 周的細胞。取培養的單核細胞，PBS 洗滌，加入PE 標記的流式抗體F4/80、CD86 或FITC 標記的流式抗體CD206，混合均勻，置于4 ℃孵育30 min，PBS 洗滌后離心，加入適量的PBS 重懸，將獲得的細胞懸液上流式細胞儀進行檢測，記錄各標記陽性細胞所占比例。

1.3 統計學分析 使用SPSS23.0統計學軟件分析實驗數據，以GraphPad Prism 8.30 軟件繪制統計圖。計量資料均以±s表示。兩組數據比較采用t檢驗，多組重復測量數據比較采用單因素方差分析，組內兩兩數據比較采用LSD-t法，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠外周血血常規比較 造模開始后，統計對照組和ITP 組不同時間點外周血PLT 數量，結果顯示，與對照組比較，ITP 組小鼠PLT 數量呈下降趨勢，同一時間點差異均具有統計學意義（P＜0.05），說明造模成功，見圖1。各組小鼠外周血PLT、RBC、WBC 及Hb 檢測結果顯示，與對照組比較，ITP 組小鼠PLT、RBC 及Hb 明顯下降，WBC 明顯升高（P＜0.05）；與ITP 組比較，DMF 低劑量組小鼠PLT 明顯升高，WBC 明顯下降（P＜0.05），而RBC 與Hb 變化差異無統計學意義（P＞0.05）；與ITP 組比較，DMF高劑量組小鼠PLT、RBC及Hb均明顯升高，WBC明顯下降（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠外周血血常規比較（±s，n=15）Tab.1 Comparison of peripheral blood routine of mice in each group （±s， n=15）

表1 各組小鼠外周血血常規比較（±s，n=15）Tab.1 Comparison of peripheral blood routine of mice in each group （±s， n=15）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with ITP group， 2）P＜0.05.

Groups Control ITP DMF-low dose DMF-high dose PLT/（×109 L-1）897.08±62.91 425.72±34.161）613.49±42.832）RBC/（×1012 L-1）9.70±0.51 6.01±0.481）Hb/（g·L-1）156.38±12.23 99.32±8.161）6.40±0.52 WBC/（×109 L-1）6.13±0.54 11.22±0.861）9.76±0.812）99.68±8.02 735.96±52.022）8.84±0.672）8.94±0.642）114.69±10.152）

圖1 造模后不同時間點小鼠外周血PLT計數情況Fig.1 PLT counts in peripheral blood of mice at different time points after modeling

2.2 各組小鼠血清細胞因子水平比較 ELISA 測定各組小鼠血清細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-17 及TGF-β1 水平，檢測結果顯示，與對照組比較，ITP 組血清中IFN-γ、IL-2 與IL-17 均明顯升高，TGF-β1、IL-4 與IL-10 則明顯下降（P＜0.05）；相較于ITP 組，DMF 低劑量組和DMF 高劑量組的血清中IFN-γ、IL-2 與IL-17 均明顯下降，TGF-β1、IL-4 以及IL-10明顯升高（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組小鼠血清細胞因子水平比較Fig.2 Comparison of serum cytokine levels of mice in each group

2.3 各組小鼠臟器指數比較 在實驗后測定各組小鼠脾臟指數與胸腺指數，檢測結果顯示，ITP 組脾臟指數較對照組脾臟指數明顯升高（P＜0.05）；與ITP 組比較，DMF 低、高劑量組脾臟指數均明顯降低（P＜0.05）。而各組小鼠的胸腺指數之間差異均無統計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 各組小鼠脾臟指數與胸腺指數比較Fig.3 Comparison of spleen index and thymus index of mice in each group

2.4 各組小鼠脾臟組織和股骨組織HE 染色結果HE 染色觀察各組小鼠脾臟組織和股骨組織內巨核細胞數目變化，結果如圖4所示，對照組脾臟組織和股骨組織結構完整，未見明顯異常；ITP 組小鼠脾臟組織形態紊亂，股骨和脾臟紅髓中巨核細胞數目明顯增多，且胞體異常增大，形態不規則；DMF 低、高劑量組小鼠中巨核細胞增多現象較ITP 組小鼠有所改善，形態結構也趨于正常。

圖4 HE 染色觀察各組小鼠脾臟與股骨內巨核細胞數目Fig.4 HE staining to observe numbers of megakaryocytes in spleen and femur tissues of mice in each group

2.5 各組小鼠脾臟組織內巨噬細胞極化情況比較 免疫熒光染色檢測各組小鼠脾臟組織內巨噬細胞表型表達，結果如圖5所示，與對照組比較，ITP組脾臟組織內CD68+CD86+陽性表達率升高，CD68+CD206+陽性表達率降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與ITP 組比較，DMF 組脾臟組織內CD68+CD86+陽性表達率降低，CD68+CD206+陽性表達率升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.6 各組小鼠外周血巨噬細胞極化情況比較 流式細胞術檢測結果顯示，相較于對照組，ITP 組外周血F4/80+CD86+標記細胞比例明顯升高，F4/80+CD206+標記細胞比例則明顯降低，差異具有統計學意 義（P＜0.05）；而相 較于ITP 組，DMF 組F4/80+CD86+標記細胞比例明顯降低，F4/80+CD206+標記細胞比例則明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖6。

圖6 流式細胞術檢測各組小鼠外周血巨噬細胞極化情況Fig.6 Flow cytometry to detect polarization of peripheral blood macrophages in mice in each group

3 討論

ITP 的發生發展和發病機制非常復雜，涉及多種因素，一方面，自身抗體免疫球蛋白G以血小板糖蛋白為靶標形成抗原抗體復合物時，通過Fc受體被脾網狀內皮系統中的巨噬細胞所吞噬；另一方面，除血小板自身抗體外，細胞免疫功能障礙也在ITP的發病中起關鍵作用，包括T 細胞、B 細胞和抗原呈遞細胞，作為免疫應答調節細胞，T 細胞或相關細胞因子的分化以及功能障礙均與ITP 密切相關［9］。嚴重的ITP 及其并發癥也是引起患者死亡的主要原因，此外，ITP 患者通常表現為預后不良［3］。盡管血小板輸注是一種常用的臨床治療方法，但該方式并不是ITP 的有效治療方法，此外，手術切除脾、糖皮質激素、免疫抑制劑等單獨或聯合應用于ITP 均未獲得理想效果。

DMF 作為富馬酸酯組合而成的藥物，其臨床特點是副作用相當輕微，這使得其成為一種潛在的耐受性良好藥物，目前，已有大量研究指出DMF 在多種疾病中發揮調控作用，例如，DMF 通過抑制神經膠質細胞中NOS、IL-1β和IL-6等炎癥細胞因子的表達來發揮抗炎作用［10］；DMF 不僅能誘導結腸癌的細胞凋亡和壞死性凋亡［11］，還能夠通過激活SOCS3/JAK1/STAT3信號通路抑制肝細胞癌細胞增殖、血管生成以及自噬，從而起到一定的抗腫瘤作用［12］；此外，DMF 還被廣泛用作抗氧化劑和抗炎劑，用于治療多種自身免疫性疾病，例如，DMF 通過激活多發性硬化中的核因子Nrf2 通路發揮抗炎作用，還可以通過抑制NF-κB 通路調節固有性免疫反應和適應性免疫反應［13］?？紤]到ITP 也是一種自身免疫性疾病，而國內外關于DMF 在ITP 中的作用研究報道相對較少。因此，本研究通過腹腔注射GP-APS 構建ITP 小鼠模型后給予DMF，以評估DMF 對ITP 小鼠模型的改善效果及作用機制，實驗結果表明，經GPAPS 誘導后小鼠外周血血小板數量明顯降低，而DMF 治療后顯著抑制了GP-APS 誘導的小血小板減少與RBC、Hb 水平降低，并抑制了WBC 水平升高，提示DMF可能是一種治療ITP的新方法。

ITP 是由細胞免疫和體液免疫共同參與的免疫功能異常所引發的，迄今為止，研究者普遍認識到自身反應性B 淋巴細胞功能失調在ITP 發病機制中發揮作用，輔助性T（Th）細胞及其分泌性細胞因子也在ITP的發生發展過程中起著關鍵作用［14］。Th細胞可分為Th1、Th2 和Th17 細胞，Th1 細胞主要通過產生IFN-γ、IL-2與IL-17誘導細胞免疫，這些促炎細胞因子通過激活巨噬細胞、淋巴細胞和其他炎癥細胞參與炎癥反應；相比之下，Th2 細胞通過分泌抗炎細胞因子，如TGF-β1、IL-4 以及IL-10，參與巨噬細胞失活和體液免疫反應的調控作用［15-16］。已知DMF通過調節免疫細胞功能從而對多種自身免疫性疾病具有治療作用。本研究檢測結果顯示，ITP 小鼠血清中IFN-γ、IL-2與IL-17均明顯升高，TGF-β1、IL-4與IL-10 則明顯下降，而經過DMF 低、高劑量作用的ITP 小鼠，其血清中IFN-γ、IL-2 與IL-17 均明顯下降，TGF-β1、IL-4 以及IL-10 明顯升高。骨髓巨核細胞異常增生伴成熟障礙也是ITP 的主要特點之一，巨核細胞作為血小板的前體細胞，從骨髓的骨內壁龕向脈管系統遷移，將前血小板延伸到血竇，通過循環血液逐漸將其分解為血小板［17］。本研究結果也顯示，ITP 小鼠股骨組織和脾臟組織中巨核細胞數目異常增多且形態不規則，而DMF 作用后能夠改善這種異常現象。

巨噬細胞作為一種免疫細胞，以促炎經典激活巨噬細胞（M1型）或抗炎替代激活巨噬細胞（M2型）的兩種形式存在，M1 型巨噬細胞發揮促炎、抗腫瘤和抗微生物功能，釋放高水平的促炎細胞因子，如IL-1β、TNF-α、IL-6 和iNOS；M2 型巨噬細胞通過釋放抗炎細胞因子，如TGF-β、IL-10 發揮抗炎及免疫抑制作用，具有促血管生成和促纖維化特性，并能夠促進腫瘤進展［18］。既往研究表明，巨噬細胞在ITP 中起著關鍵作用，既可以作為效應細胞吞噬血小板，也可以作為抗原呈遞細胞，刺激自身抗體對抗血小板的產生，并且已在ITP 中檢測到M1/M2 比例失衡，M1型巨噬細胞的大量存在導致促炎細胞因子的釋放增加［19］。此外，CHANG 等［20］研究表明抑制miR-155-5p 的表達可以促進PD1/PDL1 通路介導的巨噬細胞向M2 型極化，從而達到緩解ITP 的作用。因此，抑制巨噬細胞向M1 型極化和促進巨噬細胞向M2 型極化可能是治療ITP 的途徑之一。以往研究表明，DMF 可以通過抑制巨噬細胞和中性粒細胞的異常激活減輕炎癥反應［21］。脾臟不僅是由血源性病原體、死亡或凋亡細胞等外來或自身抗原刺激機體引起免疫應答的淋巴器官，還是重要的巨噬細胞儲存器官，脾臟內巨噬細胞主要包括紅髓內的紅髓巨噬細胞、邊緣區嗜金屬巨噬細胞、邊緣區巨噬細胞以及白髓內著色小體巨噬細胞，均是脾臟內主要的吞噬細胞和功能細胞［22］。此外，外周血中的細胞是參與機體穩態調節和骨代謝的重要組成，其中，單核細胞來源于骨髓干細胞，在骨髓中經前單核細胞分化發育為單核細胞，然后釋放到外周血中，經過血液循環移行到各個組織中，進而分化成為巨噬細胞［23］。本研究檢測結果顯示，ITP 小鼠脾臟組織內以CD68+CD86+標記的M1 型巨噬細胞陽性表達率升高，以CD68+CD206+標記的M2 型巨噬細胞陽性表達率降低，外周血F4/80+CD86+比例明顯升高，F4/80+CD206+細胞比例明顯降低，說明ITP 小鼠發生了M1 型巨噬細胞與M2 型巨噬細胞比率失衡的現象，而DMF 作用的ITP 小鼠脾臟組織內CD68+CD86+陽性表達率降低，CD68+CD206+陽性表達率升高，此外，外周血F4/80+CD86+細胞比例也降低，而F4/80+CD206+細胞比例也表現出明顯的升高現象，由此推測，DMF 可能通過調控巨噬細胞極化從而改善ITP。

綜上所述，DMF 能夠抑制ITP 小鼠血小板數量的降低，調節血常規指標，降低脾臟指數和骨髓巨核細胞異常的現象，從而改善ITP，研究結果提示該作用機制可能與抑制巨噬細胞向M1 型極化并促進向M2 型極化相關，為進一步了解ITP 發病機制及DMF治療ITP的研究提供實驗基礎。