甘露聚糖結合凝集素對脂多糖誘導的3T3-L1 脂肪細胞炎癥反應和胰島素抵抗的調節作用及機制①

李志欣 任智宏 雷一鳴 穆永慧 于莉莉 王明永 （新鄉醫學院醫學檢驗學院，新鄉453003）

肥胖是全世界最流行的疾病之一，近年來出現快速增長的趨勢，嚴重影響人類的健康水平［1］。防治肥胖已成為人類保衛健康的首要目標。肥胖作為一種慢性炎癥疾病得到了科學界的公認［2］。在肥胖狀態下，脂肪組織功能障礙可導致血清游離脂肪酸水平（free fatty acids，FFAs）異常升高，過量的游離脂肪酸通過干擾胰島素信號產生胰島素抵抗，是2 型糖尿病的主要特征［3］。另一方面過度的脂肪堆積引起脂肪組織中巨噬細胞浸潤，通過激活NF-κB通路釋放IL-6、TNF-α 等炎癥因子，導致肥胖炎癥進一步增強［4］。因此，有效調控炎癥和胰島素抵抗是控制肥胖進程的潛在手段。

近年來免疫代謝學的飛速發展為肥胖及相關疾病的防治提供了新思路和新手段［5］。被稱為天然免疫中關鍵模式識別受體的甘露聚糖結合凝集素（manna-binding lectin，MBL）是由肝細胞分泌的急性期蛋白，在天然免疫防御中發揮重要作用［6］。近年來新的研究發現MBL 對機體免疫穩態的調節也發揮重要作用［7-9］。還有研究表明MBL 與糖尿病和動脈粥樣硬化等代謝性疾病的發生發展也存在一定的聯系［10-11］。前期研究發現：在3T3-L1 脂肪細胞的誘導分化不同階段，MBL 均發揮負向調控作用，且這種調節作用與自噬密切相關［12-13］。提示MBL對肥胖的發生發展具有調控作用，但機制需要進一步探究。

本研究中，以3T3-L1 前體脂肪細胞為體外研究模型，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）為細胞刺激劑，研究表明，肥胖人群的LPS血清水平有一定程度的升高，在肥胖誘導慢性炎癥和胰島素抵抗中起關鍵作用［14］。系統探討MBL 對LPS 誘導的3T3-L1 脂肪細胞炎癥反應和胰島素抵抗的影響，旨在進一步探究MBL對肥胖的調節機制。

1 材料與方法

1.1 材料 3T3-L1 前體脂肪細胞株（普諾賽科技有限公司）；DMEM 培養基（Hyclone）；胎牛血清（Gibco）；胰島素、DMSO、油紅O 染液、PBS 粉末（索萊寶科技有限公司）； IBMX、地塞米松、LPS（Sigma）；MBL 蛋白（近岸蛋白質科技有限公司）；IL-6 ELISA 試 劑 盒、TNF-α ELISA 試 劑 盒（Thermo）；CCK-8 試劑（AbMole BioScience）；核質蛋白提取試劑盒（Thermo）；細胞組織快速裂解液（Abcam）；磷酸酶及蛋白酶抑制劑（羅氏）；GAPDH（康為CW0100 M）；IL-6、TNF-α、NF-κB p65、IκBα、P-IκBα ser32/36、P-IKK ser176/180、IKK、Akt、P-Akt、LaminB 1（Cell Signaling Technology， #12912、#11948、#8284、#4818、#9246、#2697、#2678、#9272、#9271、#12586）；TLR4（Santa sc-293072）；GLUT4、IRS、P-IRS try（亞科因生物技術有限公司）；ECL 檢測試劑盒（Millipore）；2-NBDG（懋康生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 3T3-L1 前體脂肪細胞培養和誘導 3T3-L1前體脂肪細胞采用含10%FBS 的DMEM 于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中進行培養，正常細胞形態為不規則的梭形貼壁細胞。將3T3-L1細胞接種于6孔板，當細胞密度至90%左右時，換液，細胞接觸抑制2 d，棄去培養基，加誘導液Ⅰ（0.75 mmol/L IBMX、1.0 μmol/L 地塞米松和1 mg/L 胰島素的含10%FBS的DMEM），2 d更換1次新鮮誘導液Ⅰ，至第6天，將誘導液Ⅰ更換為誘導液Ⅱ（10 mg/L 胰島素的含10%FBS 的 DMEM），2 d 更換1 次誘導液Ⅱ，直至第12天。

1.2.2 實驗分組及處理 收集3T3-L1 前脂肪細胞誘導過程中0 d、4 d、8 d、12 d的細胞，染色觀察細胞脂滴情況。設置空白對照組，模型組：使用LPS（1 μg/ml）刺激，蛋白處理組：在LPS（1 μg/ml）刺激前30 min 加入MBL（10 μg/ml）進行預處理，檢測細胞活力和炎癥的相關指標；另一實驗中，采用LPS（1 μg/ml）和不同濃度MBL 蛋白（0、1、10、20 μg/ml）干預分化成熟的脂肪細胞（12 d），檢測MBL 干預對細胞炎癥因子以及TLR4/NF-κB 信號通路的影響。在檢測細胞對葡萄糖的攝取實驗中，實驗組分為對照組、INS 處理組、LPS 處理組、LPS+INS 處理組以及LPS+INS+MBL（0、1、10、20 μg/ml）處理組，然后再選用10 μg/ml 的MBL 處理組檢測其通路蛋白的表達情況。

1.2.3 油紅O 染色 PBS 清洗細胞，4%多聚甲醛固定40 min，新配油紅O 工作液避光染色40 min，60%異丙醇去除未結合染料并用蒸餾水洗去，拍照記錄。

1.2.4 CCK-8 在96 孔板中，細胞以8 000 個/孔的密度鋪板。按照上述處理分組情況，設5個復孔，處理后每孔加10 μl CCK-8試劑，37 ℃孵育2.5 h，使用450 nm 波長測量細胞吸光度。細胞增殖率（%）=［（A實驗組-A空白組）/（A對照組-A空白組）］×100%。

1.2.5 ELISA 收集各組細胞上清，使用ELISA 試劑盒檢測上清中TNF-α 和IL-6 的含量（按照說明要求進行實驗）。

1.2.6 Western blot 取各組細胞，用總蛋白提取試劑盒和核質蛋白提取試劑盒裂解細胞，提蛋白，用BCA 法測定蛋白濃度，調整為統一濃度，變性。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉，奶粉或BSA 室溫封閉2 h，一抗4 ℃過夜，TBST 洗膜，二抗室溫2 h，采用增強化學發光法（ECL）顯色，曝光。

1.2.7 流式細胞術 各組使用2%無血清無糖培養基饑餓5 h，加入胰島素刺激20 min，再加入2-NBDG作用20 min后，收集細胞，流式細胞儀檢測熒光強度。

1.3 統計學方法 實驗數據采用GraphPad Prism 8.02 軟件進行統計分析。實驗結果以±s表示，所有實驗均至少進行3次實驗。采用單因素方差分析比較各組間的差異，以LSD 法比較任意兩組間的差異，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3T3-L1 前脂肪細胞12 d 可誘導分化為成熟脂肪細胞 油紅O染色結果顯示誘導分化前細胞呈梭形，未見明顯脂滴（圖1A）；誘導第4 天，細胞由梭形變圓，胞漿內出現了較多小脂滴（圖1B）；誘導至第8 天，細胞更大，多為圓形或橢圓形，胞漿內的脂滴也隨之變多且大，分布于核周，呈“戒環”樣（圖1C）；誘導至第12 天，90%以上胞漿中都含有亮紅色大脂滴，即為由小脂滴匯聚成的大脂滴，為成熟脂肪細胞（圖1D）。提示采用此種誘導方法在誘導至第12天可得到成熟脂肪細胞。

圖1 油紅O染色Fig.1 Oil red O staining

2.2 MBL 及LPS 干預不影響3T3-L1 脂肪細胞增殖活力 在3T3-L1 脂肪細胞分化過程中，10 μg/ml MBL 以及1 μg/ml LPS 對其增殖能力無明顯影響（圖2A）；且對成熟階段的細胞進行檢測發現：不同濃度的MBL（1、10、20 μg/ml）以及LPS（1 μg/ml）對細胞的存活無明顯影響（圖2B）。結果表明：在3T3-L1 脂肪細胞分化初期至成熟的過程中，不同濃度MBL及LPS對其增殖能力無明顯影響。

圖2 MBL與LPS對3T3-L1細胞增殖的影響Fig.2 Effect of MBL and LPS on proliferation of 3T3-L1 cells

2.3 MBL 抑制LPS 誘導的不同分化階段脂肪細胞炎癥因子分泌 為探討MBL 在3T3-L1 脂肪細胞分化過程中的抑炎作用，選擇0 d、4 d、8 d、12 d 4 個時間點，使用LPS 對細胞進行刺激，并加入MBL 進行干預。Western blot結果顯示：與對照組相比，LPS處理組的IL-6、TNF-α水平顯著升高，而MBL的加入顯著抑制了這一作用（圖3）。提示在3T3-L1脂肪細胞分化的不同階段，MBL 均可以抑制LPS誘導的IL-6、TNF-α表達。

圖3 3T3-L1脂肪細胞全分化過程中IL-6、TNF-α蛋白表達水平及灰度分析Fig.3 Expression levels and gray level analysis of IL-6，TNF-α during differentiation of 3T3-L1 preadipocytes

2.4 MBL 以濃度依賴方式降低LPS 誘導的脂肪細胞炎癥因子分泌 選擇分化至12 d 的脂肪細胞進行分析，加入LPS對成熟的脂肪細胞進行刺激，不同濃度MBL 干預。ELISA 及Western blot 結果顯示：與空白對照組相比，LPS 可誘導脂肪細胞增加IL-6、TNF-α 分泌，而MBL 干預以濃度依賴的方式抑制IL-6 和TNF-α 分泌（圖4）。初步推測MBL 在3T3-L1脂肪細胞分化全過程直至成熟均具有抑炎作用，且濃度越高，抑制作用越明顯。

圖4 成熟脂肪細胞IL-6 和TNF-α 的因子分泌、蛋白表達水平及灰度分析Fig.4 Cytokine secretion， protein expression and gray scale analysis of IL-6 and TNF-α in mature adipocytes

2.5 MBL 抑制LPS 誘導的TLR4/NF-κB 信號通路活化 使用LPS 對成熟的脂肪細胞進行刺激，并加入不同濃度的MBL 進行干預。Western blot 結果顯示，MBL 可抑制LPS 誘導的TLR4 高表達，從而抑制下游的IKK、IκB 磷酸化，進而阻滯NF-κB p65 入核表達，且MBL 濃度越高抑制作用越明顯（圖5）。提示，MBL 可能通過TLR4/NF-κB 信號通路調控炎癥，并呈濃度依賴關系。

圖5 成熟脂肪細胞TLR4/NF-κB 信號通路蛋白表達水平及灰度分析Fig.5 Expression levels and gray level analysis of TLR4/NF-κB signaling pathway in mature adipocytes

2.6 MBL 可以減輕LPS 誘導的脂肪細胞對葡萄糖的攝取損傷 LPS 可抑制胰島素刺激IRS-1 try 和Akt 的磷酸化并使細胞對葡萄糖的攝取產生抑制作用［15］。為了探討MBL 是否能調節胰島素抵抗，檢測MBL 對成熟脂肪細胞攝取葡萄糖的影響。流式細胞術檢測各組2-NBDG 的熒光強度：MBL+INS+LPS處理組相較于INS+LPS 處理組，提高了對2-NBDG的攝取，即MBL 的干預可以修復LPS 對細胞攝取葡萄糖的損傷，以濃度依賴的方式提高細胞對葡萄糖的攝取能力（圖6）。

圖6 成熟脂肪細胞葡萄糖攝取情況Fig.6 Glucose uptake in mature adipocytes

2.7 MBL 可以解除LPS 對IRS-1/Akt 信號通路的抑制 MBL+INS+LPS 處理組與INS+LPS 處理組相比，MBL 干 預 增 加 了IRS try 和Akt 的 磷 酸 化，并 使GLUT4的表達增強（圖7）。提示MBL可以通過減弱LPS 對3T3-L1 細胞中胰島素信號通路IRS-1/Akt 的抑制，進而激活GLUT4 的膜移位，增強細胞對葡萄糖攝取的能力。

圖7 成熟脂肪細胞胰島素通路蛋白表達及灰度分析Fig.7 Expression levels and gray level analysis of insulin pathway proteins in mature adipocytes

3 討論

肥胖是能量攝入和消耗失衡的結果［16］。越來越多的研究結果表明，肥胖與慢性低度炎癥相關，是胰島素抵抗等多種代謝性疾病的重要病因機制［3］。有研究發現免疫因素在代謝性疾病中扮演著重要角色，故人們開始注重天然免疫與既往認為的非感染性疾病如肥胖相關代謝性疾病之間的關系［13］。Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）能夠識別病原相關分子模式，其活化能夠引起多蛋白質的信號轉導級聯反應，產生炎癥因子，激活獲得性免疫應答。研究表明，TLR4信號通路與肥胖慢性炎癥有關，其配體LPS 被認為是引發脂肪組織炎癥的早期關鍵因子［17-18］。

前期研究課題組發現MBL 預處理可降低成脂分化相關因子如PPAR、CEBPα mRNA 和蛋白質表達，降低3T3-L1 細胞分化過程中的脂滴積累，抑制細胞的成脂分化，且這種抑制作用與自噬密不可分［12-13］。由于肥胖與炎癥、胰島素抵抗等病理性的改變密切相關 ，初步推測MBL可能與脂肪組織內炎癥及胰島素抵抗有關。因此深入研究MBL 與炎癥和胰島素抵抗的關系，可為防治肥胖提供新方向。

由于3T3-L1 細胞是研究肥胖常用的體外細胞模型，LPS 誘導的TLR4信號通路可能是脂肪細胞相關炎癥的關鍵因素［18-19］。故以3T3-L1細胞為體外研究模型，LPS為細胞刺激劑，探討MBL對脂肪細胞炎癥和胰島素抵抗的調節及機制。在脂肪細胞誘導過程中，MBL 預處理顯著抑制了LPS 誘導的促炎因子TNF-α和IL-6的分泌。提示在脂肪細胞從開始分化到誘導成熟的過程中，MBL 對于細胞炎癥因子分泌的抑制作用是一直存在的。為進一步分析MBL對脂肪細胞炎癥的調節作用，選取成熟脂肪細胞（12 d），以不同濃度MBL 進行干預，Western blot 及ELISA 檢測IL-6、TNF-α 炎癥因子表達，結果顯示MBL 以濃度依賴方式對炎癥因子的分泌進行抑制。TLR4/NF-κB是經典的炎癥信號通路。當TLR4處于一個高表達狀態時可刺激下游的IKK、IκB 磷酸化，使NF-κB由質入核表達分泌炎癥因子如：IL-6、TNF-α，導致機體產生炎癥。因此又進一步分析了MBL 對這條信號通路的調控作用，Western blot 結果顯示MBL 預處理可以阻止LPS 誘導的TLR4/NF-κB 信號通路的激活，且呈濃度依賴性。提示MBL 可通過TLR4/NF-κB通路抑制肥胖相關炎癥。

肥胖是導致胰島素抵抗和代謝并發癥，如2 型糖尿病的主要因素［3］。胰島素主要通過刺激骨骼肌、脂肪組織和肝臟等組織的各種生理反應來維持血糖穩態。胰島素在細胞外可與胰島素受體（insulin receptor，IR）的α 亞基結合啟動胰島素信號通路［20］。參與這一途徑的信號分子包括IR、IRS-1、PI3K、PDK1、Akt、AS160 和 葡 萄 糖 轉 運 體4（GLUT4）。胰島素作用的最終目標是激活GLUT4的膜移位和增加葡萄糖攝?。?1］。在肥胖狀態下，IRS-1 ser 磷酸化能使Akt 活性受到抑制，進而導致胰島素信號通路受損，發生胰島素抵抗［22］。2-NBDG是一種帶有熒光的葡萄糖探針，流式細胞術通過檢測細胞熒光強度評價細胞對葡萄糖攝取能力，進一步判斷是否存在胰島素抵抗。使用不同濃度 MBL預處理3T3-L1 成熟脂肪細胞，采用流式細胞術和Western blot 兩種方法驗證MBL 是否影響3T3-L1 成熟脂肪細胞攝取葡萄糖。結果顯示，MBL 可以通過解除LPS 對IRS-1 酪氨酸基和Akt 磷酸化的抑制作用，在一定程度上修復LPS 誘導的3T3-L1 成熟脂肪細胞攝取葡萄糖能力的損傷。提示，MBL 可能具有改善胰島素抵抗的作用。

HOTAMISLIGIL 等［23］首次發現炎癥因子TNF-α可以誘導胰島素抵抗的發生，而且IL-6 也可以誘導胰島素抵抗的發生；TNF-α 和IL-6 可以通過調節IRS/Akt 信號通路調節胰島素敏感性［24］。本研究表明MBL 可以抑制TLR4/NF-κB 信號通路分泌的炎癥因子TNF-α和IL-6，因此，MBL可以通過抑制炎癥緩解胰島素抵抗。

除TNF-α 等炎癥因子之外，無疑還有其他信號也可促進胰島素抵抗并介導T2D 發展。研究表明，肥胖不僅可以激活IKKβ 導致NF-κB 易位，使許多標志物和潛在炎癥介質的表達增加導致胰島素抵抗；還可以激活JNK 導致IRS-1 絲氨酸位點的磷酸化，通過胰島素受體/IRS-1軸負向調節正常信號，導致胰島素抵抗［25］。這說明，胰島素抵抗的發生與炎癥密不可分。本研究發現，MBL 不僅可以抑制炎癥，還可進一步緩解胰島素抵抗，更證明了兩者的關聯性。

綜上所述，通過研究MBL 對LPS 誘導的3T3-L1細胞的影響，證實MBL 不僅可抑制LPS 誘導的炎癥反應，而且能夠改善胰島素抵抗，為后續臨床開發能夠干預肥胖的免疫分子提供可靠的體外實驗數據。推測天然免疫分子MBL 可能改善高脂誘導的炎癥和胰島素抵抗，具有預防肥胖并發癥的潛力。