二氫楊梅素通過JAK2/STAT3 通路調控小膠質細胞活化對異氟醚所致成年小鼠早期認知功能障礙的影響

劉 偉 方 軍 張抗抗 （滕州市中心人民醫(yī)院麻醉科，滕州 277599）

異氟醚作為常用的吸入式麻醉劑，可通過誘導認知功能障礙相關的神經毒性或降低海馬乙酰膽堿水平引發(fā)術后認知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）［1］。POCD 的主要特征為患者在麻醉或手術后出現(xiàn)認知功能障礙，表現(xiàn)為思維、注意力、記憶等認知功能改變，提高患者的住院時間及病死率，其病理生理學機制至今仍然未知，因此有必要對異氟醚所致POCD 的發(fā)生及治療機制進行深入探究［2-3］。有研究發(fā)現(xiàn)，小膠質細胞活化介導的中樞神經炎癥是POCD 發(fā)生的主要原因之一，因此有效抑制小膠質細胞活化可能對POCD 的治療具有重要意義［4］。二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）具有抗炎及神經保護作用，已被多項研究證實可改善認知和運動能力，研究發(fā)現(xiàn)其在丙泊酚誘導的認知功能障礙大鼠中可通過調節(jié)小膠質細胞極化改善認知功能障礙［4-5］。蛋白酪氨酸激酶2/信號 轉 導 和 轉 錄 活 化 因 子3（Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3）通路是調控小膠質細胞活化的關鍵通路，抑制其激活可減輕小膠質細胞活化誘發(fā)的炎癥反應［6］。有報道稱，DMY 可通過抑制JAK2/STAT3 通路改善脂多糖誘導的小膠質細胞炎癥反應，但DMY是否可通過調控JAK2/STAT3 通路改善POCD 還未可知［7］。因此，本研究使用異氟醚處理小鼠，探究DMY 通過JAK2/STAT3通路調控小膠質細胞活化對異氟醚所致成年小鼠早期認知功能障礙的影響，以期為DMY在POCD中的治療機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 50 只SPF 級雄性C57BL/6 小鼠（20～25 g）購自南方醫(yī)科大學，許可證號：SCXK（粵）2016-0041，12 h/12 h 明暗交替、室內環(huán)境溫度（25±10） ℃，通風飼養(yǎng)7 d。

1.1.2 主要試劑與儀器 二氫楊梅素（YG10356，上海韻泰信息科技有限公司）；免疫組化試劑盒（PK-7800，北京博蕾德生物科技有限公司）；BCA 試劑盒、蛋白提取試劑盒（LCB004、MB2820，上海榕柏生物技術有限公司）；兔抗CD68 抗體（bs-0649R-2，上海恒斐生物科技有限公司）；HRP-IgG 抗體、兔抗精 氨 酸 酶（Arginase）、β-actin、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、兔抗離子鈣結合銜接分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）抗體（7074、93668、4970、4904、9145、3230、3771、13120、17198，Cell Signaling Technology）；IL-10、IL-1β 試劑盒（C9264、C9278，上海名勁生物科技有限公司）。GenoSens 2200 Touch 凝膠成像系統(tǒng)（上海勤翔科學儀器有限公司）；LONZA ELx808 酶標儀（北京澤平科技有限責任公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型構建 將50 只C57BL/6 小鼠隨機分為對照組（10只）和模型組（40只）。模型構建：將小鼠置于鋪有薄層鈣石灰的40 cm×35 cm×30 cm麻醉箱中，持續(xù)4 h 輸入異氟醚（1.4%，4 L/min），4 h后小鼠仰臥或側臥時間若超出60 s 即翻正反射消失，則造模成功［8］，成功率為100%；對照組小鼠不進行任何處理；造模成功后次日，將模型組小鼠以10只/組分為異氟醚組、DMY-L組（100 mg/kg DMY）、DMY-H 組（200 mg/kg DMY）、DMY-H+AG490 組（200 mg/kg DMY+JAK2抑制劑AG490 0.4 mg/kg）［4，9］。DMY-L 組、DMY-H 組、DMY-H+AG490 組小鼠灌胃相應劑量DMY 或AG490，對照組、異氟醚組灌胃等量生理鹽水，為時1周（1次/d）。

1.2.2 大鼠行為學觀察

1.2.2.1 曠場實驗 處理結束后次日，將小鼠置于觀察箱（100 cm×100 cm）中，通過Smart 系統(tǒng)記錄5 min內其運動路程及站立次數(shù)，以評估小鼠自主活動能力；每只小鼠實驗結束后使用75%乙醇擦去觀察箱殘留氣味，避免干擾后續(xù)實驗。

1.2.2.2 新舊事物識別 記錄5 min 內小鼠對新舊物體的探索次數(shù)，指標越高表示其記憶能力越好。

1.2.2.3 水迷宮實驗 將自制的水迷宮水池（直徑：150 cm，高：50 cm，水深：25 cm）均等劃分為4 個象限，于距第一象限池壁35 cm處放置1個距離水面3 cm 的黑色圓形平臺（高：22 cm，直徑：12 cm），于第三象限將小鼠放入水中，引導至平臺停留20 s 后推入水中，再次尋找平臺，進行為時5 d 的訓練（4 次/d），全程使用計算機攝像系統(tǒng)觀察其運動軌跡，第6天移去平臺，記錄小鼠穿越平臺次數(shù)及進入水中至到達平臺的時間（逃避潛伏期），以評估其認知功能。

1.2.3 免疫組化法測定海馬組織Iba1 表達 行為學測試結束后每組選取5 只小鼠取其腦組織，分離海馬組織于多聚甲醛中過夜固定，常規(guī)石蠟包埋后進行連續(xù)切片（4 μm），使用過氧化氫孵育（10 min），消除內源性過氧化物酶，抗原修復后孵育血清進行封閉，0.5 h 后Iba1 一抗過夜孵育，次日使用生物素標記的二抗孵育（20 min），DAB顯色后脫水透明，進行封片，通過Image Pro Plus 6.0 觀察Iba1 棕黃色陽性細胞并計數(shù)（×400）。

1.2.4 ELISA 檢測小鼠海馬組織IL-10、IL-1β 水平 取剩余小鼠腦組織，剝離海馬組織，12 500 r/min離心20 min 后取其勻漿上清液，一部分根據(jù)IL-10、IL-1β ELISA 試劑盒于450 nm 處測定二者水平（n=5），剩余部分上清液進行Western blot實驗。

1.2.5 Western blot 檢測海馬組織CD68、iNOS、精氨酸酶蛋白及JAK2/STAT3 通路蛋白表達 從1.2.4 蛋白上清液中提取總蛋白，BCA 法檢測其濃度后取蛋白樣品進行100 ℃沸水浴變性（10 min），冷卻后以40 μg/孔進行10%SDS-PAGE凝膠電泳，切下目的條帶于低溫下轉至PVDF 膜，5%牛血清白蛋白 封 閉2 h，一 抗（兔 抗CD68、iNOS、Arginase、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2、β-actin抗體，1∶1 000）過夜孵育后，山羊抗兔HRP-IgG 二抗（1∶5 000）孵育1 h，滴加ECL 化學液顯影，蛋白凝膠成像儀成像，Image J 分析條帶灰度后計算CD68、iNOS、精氨酸酶、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2蛋白水平（n=5）。

1.3 統(tǒng)計學方法 SPSS23.0 軟件分析實驗所得數(shù)據(jù)后用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間數(shù)據(jù)兩兩比較采用LSD 檢驗；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DMY 對小鼠自主活動及新舊事物識別能力的影響 與對照組相比，異氟醚組小鼠站立次數(shù)及運動路程顯著減少（P＜0.05）；與異氟醚組相比，DMYL 組、DMY-H 組小鼠站立次數(shù)及運動路程顯著增加（P＜0.05）；與DMY-L 組相比，DMY-H 組小鼠站立次數(shù)及運動路程顯著增加（P＜0.05）；與DMY-H 組相比，DMY-H+AG490 組站立次數(shù)及運動路程顯著增加（P＜0.05），見表1。

表1 DMY 對小鼠自主活動及新舊事物識別能力的影響（±s，n=10）Tab.1 Effects of DMY on autonomous activity and recognition ability of new and old things in mice （±s，n=10）

表1 DMY 對小鼠自主活動及新舊事物識別能力的影響（±s，n=10）Tab.1 Effects of DMY on autonomous activity and recognition ability of new and old things in mice （±s，n=10）

Note：Compared with control group， 1） P＜0.05； compared with isoflurane group， 2） P＜0.05； compared with DMY-L group， 3） P＜0.05； compared with DMY-H group， 4） P＜0.05.

Standing times/time 67.20±8.33 43.08±4.301）50.40±5.052）57.63±4.122）3）64.90±5.244）Groups Control Isoflurane DMY-L DMY-H DMY-H+AG490 Movement distance/cm 2 120.35±225.40 864.12±109.821）1 226.70±122.172）1 673.12±140.392）3）2 070.85±153.224）

2.2 DMY 對小鼠認知功能的影響 與對照組相比，異氟醚組小鼠穿越平臺次數(shù)顯著減少，逃避潛伏期顯著增加（P＜0.05）；與異氟醚組相比，DMY-L組、DMY-H 組小鼠穿越平臺次數(shù)顯著增加，逃避潛伏期顯著減少（P＜0.05）；與DMY-L 組相比，DMY-H組小鼠穿越平臺次數(shù)顯著增加，逃避潛伏期顯著減少（P＜0.05）；與DMY-H 組相比，DMY-H+AG490 組穿越平臺次數(shù)顯著增加，逃避潛伏期顯著減少（P＜0.05），見表2。

表2 DMY對小鼠認知功能的影響（±s，n=10）Tab.2 Effects of DMY on cognitive function in mice（±s，n=10）

表2 DMY對小鼠認知功能的影響（±s，n=10）Tab.2 Effects of DMY on cognitive function in mice（±s，n=10）

Note：Compared with control group， 1） P＜0.05； compared with isoflurane group， 2） P＜0.05； compared with DMY-L group， 3） P＜0.05； compared with DMY-H group， 4） P＜0.05.

Escape latency/s 14.10±1.12 27.86±2.501）22.73±1.372）18.66±1.112）3）15.40±1.204）Groups Control Isoflurane DMY-L DMY-H DMY-H+AG490 Times of crossing platform/time 8.93±1.02 2.01±0.571）4.80±0.612）6.61±0.752）3）8.70±0.634）

2.3 DMY 對小鼠海馬組織Iba1表達的影響 與對照組相比，異氟醚組小鼠海馬組織Iba1 陽性細胞數(shù)顯著增加（P＜0.05）；與異氟醚組相比，DMY-L 組、DMY-H 組Iba1 陽性細胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）；與DMY-L組相比，DMY-H組Iba1陽性細胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）；與DMY-H組相比，DMY-H+AG490組Iba1陽性細胞數(shù)顯著減少（P＜0.05），見表3、圖1。

圖1 DMY對小鼠海馬組織Iba1表達的影響（×200）Fig.1 Effect of DMY on Iba1 expression in mouse hippocampus （×200）

表3 DMY對小鼠海馬組織Iba1表達的影響（±s，n=5）Tab.3 Effect of DMY on Iba1 expression in mouse hippocampus （±s，n=5）

表3 DMY對小鼠海馬組織Iba1表達的影響（±s，n=5）Tab.3 Effect of DMY on Iba1 expression in mouse hippocampus （±s，n=5）

Note：Compared with control group， 1） P＜0.05； compared with isoflurane group， 2） P＜0.05； compared with DMY-L group， 3） P＜0.05； compared with DMY-H group， 4） P＜0.05.

Number of positive cells/individual 7.82±1.33 98.40±8.271）65.24±6.392）40.52±5.032）3）19.06±3.274）Groups Control Isoflurane DMY-L DMY-H DMY-H+AG490

2.4 DMY 對小鼠海馬組織IL-10、IL-1β 水平的影響 與對照組相比，異氟醚組小鼠海馬組織IL-10水平顯著降低，IL-1β 水平顯著升高（P＜0.05）；與異氟醚組相比，DMY-L組、DMY-H組IL-10水平顯著升高，IL-1β 水平顯著降低（P＜0.05）；與DMY-L 組相比，DMY-H 組IL-10 水平顯著升高，IL-1β 水平顯著降低（P＜0.05）；與DMY-H 組相比，DMY-H+AG490組IL-10 水平顯著升高，IL-1β 水平顯著降低（P＜0.05），見表4。

表4 DMY 對小鼠海馬組織IL-10、IL-1β 水平的影響（±s，n=5）Tab.4 Effect of DMY on levels of IL-10 and IL-1β in hippocampus of mouse （±s，n=5）

表4 DMY 對小鼠海馬組織IL-10、IL-1β 水平的影響（±s，n=5）Tab.4 Effect of DMY on levels of IL-10 and IL-1β in hippocampus of mouse （±s，n=5）

Note：Compared with control group， 1） P＜0.05； compared with isoflurane group， 2） P＜0.05； compared with DMY-L group， 3）P＜0.05； compared with DMY-H group， 4）P＜0.05.

IL-10/（μg·L-1）22.77±2.30 10.34±0.981）13.90±1.032）17.92±1.522）3）21.74±2.104）Groups Control Isoflurane DMY-L DMY-H DMY-H+AG490 IL-1β/（μg·L-1）5.65±0.61 11.51±0.891）9.58±0.462）7.18±0.442）3）6.03±0.384）

2.5 DMY 對小鼠海馬組織CD68、iNOS、精氨酸酶表達的影響 與對照組相比，異氟醚組小鼠海馬組織精氨酸酶表達顯著減少，CD68、iNOS 表達顯著增加（P＜0.05）；與異氟醚組相比，DMY-L 組、DMY-H組精氨酸酶表達顯著增加，CD68、iNOS 表達顯著減少（P＜0.05）；與DMY-L 組相比，DMY-H 組精氨酸酶表達顯著增加，CD68、iNOS 表達顯著減少（P＜0.05）；與DMY-H 組相比，DMY-H+AG490 組精氨酸酶表達顯著增加，CD68、iNOS 表達顯著減少（P＜0.05），見表5、圖2。

圖2 DMY 對小鼠海馬組織CD68、iNOS、精氨酸酶表達的影響Fig.2 Effect of DMY on expressions of CD68， iNOS and Arginase in mouse hippocampus

表5 DMY 對小鼠海馬組織CD68、iNOS、Arginase 表達的影響（±s，n=5）Tab.5 Effect of DMY on expressions of CD68， iNOS and Arginase in mouse hippocampus （±s， n=5）

表5 DMY 對小鼠海馬組織CD68、iNOS、Arginase 表達的影響（±s，n=5）Tab.5 Effect of DMY on expressions of CD68， iNOS and Arginase in mouse hippocampus （±s， n=5）

Note：Compared with control group， 1） P＜0.05； compared with isoflurane group， 2） P＜0.05； compared with DMY-L group， 3） P＜0.05； compared with DMY-H group， 4） P＜0.05.

CD68/β-actin 0.65±0.08 1.73±0.221）1.36±0.152）1.01±0.102）3）0.74±0.084）Groups Control Isoflurane DMY-L DMY-H DMY-H+AG490 iNOS/β-actin 0.41±0.06 1.60±0.201）1.19±0.142）0.87±0.092）3）0.60±0.064）Arginase/β-actin 1.83±0.31 0.40±0.071）0.71±0.102）1.12±0.132）3）1.63±0.234）

2.6 DMY 對小鼠海馬組織JAK2/STAT3 通路蛋白表達的影響 與對照組相比，異氟醚組小鼠海馬組織p-STAT3/STAT3 及p-JAK2/JAK2 表達顯著增加（P＜0.05）；與異氟醚組相比，DMY-L 組、DMY-H 組p-STAT3/STAT3 及p-JAK2/JAK2 表達顯著減少（P＜0.05）；與DMY-L 組相比，DMY-H 組p-STAT3/STAT3及p-JAK2/JAK2 表達顯著減少（P＜0.05）；與DMY-H組 相 比，DMY-H+AG490 組p-STAT3/STAT3 及p-JAK2/JAK2表達顯著減少（P＜0.05），見表6、圖3。

圖3 DMY 對小鼠海馬組織JAK2/STAT3 通路蛋白表達的影響Fig.3 Effect of DMY on JAK2/STAT3 pathway protein expression in mouse hippocampus

表6 DMY 對小鼠海馬組織JAK2/STAT3 通路蛋白表達的影響（±s，n=5）Tab.6 Effect of DMY on JAK2/STAT3 pathway protein expression in mouse hippocampus （±s，n=5）

表6 DMY 對小鼠海馬組織JAK2/STAT3 通路蛋白表達的影響（±s，n=5）Tab.6 Effect of DMY on JAK2/STAT3 pathway protein expression in mouse hippocampus （±s，n=5）

Note：Compared with control group， 1） P＜0.05； compared with isoflurane group， 2） P＜0.05； compared with DMY-L group， 3）P＜0.05； compared with DMY-H group， 4）P＜0.05.

p-JAK2/JAK2 0.53±0.06 1.88±0.281）1.38±0.172）0.71±0.102）3）0.30±0.09 Groups Control Isoflurane DMY-L DMY-H DMY-H+AG490 p-STAT3/STAT3 0.39±0.05 1.62±0.211）1.20±0.152）0.89±0.102）3）0.54±0.074）

3 討論

大量研究表明，吸入性麻醉劑異氟醚可通過濃度及時間依賴性方式影響動物的學習和記憶能力［1，8］。POCD是一種手術并發(fā)癥，研究發(fā)現(xiàn)，由麻醉引發(fā)的神經炎癥是POCD 發(fā)生的主要原因［10-11］。小膠質細胞作為中樞神經系統(tǒng)的重要免疫細胞，在正常狀態(tài)下處于非活化狀態(tài)，一旦受到炎癥刺激就會被顯著激活，進一步促進炎癥因子表達，擴大炎癥反應，導致POCD［10］。因此，本研究通過使小鼠吸入異氟醚成功構建異氟醚麻醉模型，以探究有效抑制小膠質細胞活化對異氟醚所致POCD治療的影響。

小膠質細胞在炎癥狀態(tài)下可分化為M1型及M2型，M1 型小膠質細胞可促進IL-1β 等炎癥因子表達，而M2 型 則 促 進IL-10 等 抗 炎 因 子 表 達［10-12］。DMY 可穿過血腦屏障，調節(jié)炎癥反應，發(fā)揮神經保護功效，有報道稱，DMY 在APP/PS1 轉基因小鼠中可通過抑制小膠質細胞激活起到神經保護作用［13］。DMY 可通過激活AMP 依賴的蛋白激酶［adenosine 5'-monophosphate （AMP）-activated protein kinase，AMPK］途徑抑制炎癥、氧化應激及細胞凋亡，從而改善鉛誘導的小鼠認知功能障礙［14］。還有研究表明，DMY 可通過促進小膠質細胞M1向M2型轉化改善丙泊酚誘導的大鼠認知功能障礙［4］。本研究結果表明，DMY 可有效改善異氟醚所致成年小鼠運動、記憶等認知功能障礙。M1型和M2型小膠質細胞的標志分子分別為iNOS 和精氨酸酶［4］。CD68 作為一種溶酶體蛋白，是活化的小膠質細胞標志物，在細胞活化后表達顯著增加［15］。本研究還發(fā)現(xiàn)，與異氟醚組相比，DMY 可顯著增加IL-10 及精氨酸酶表達，減少小膠質細胞標志物Iba1 陽性細胞數(shù)及IL-1β、CD68、iNOS 表達，表明DMY 可有效抑制小膠質細胞活化，并促進其由M1 型向M2 型轉化，減輕炎癥損傷。

多項研究表明JAK2/STAT3 參與小膠質細胞的活化［6，16］。STAT3 在小膠質細胞對各種刺激的應答中具有重要調節(jié)作用，其激活可促進促炎因子表達［17］。Kappa 阿 片 受 體 激 動 劑 通 過 抑 制JAK2/STAT3 通路改善大鼠體外循環(huán)POCD［18］。伐尼克蘭通過抑制JAK2/STAT3通路減少老年雄性C57BL/6N小鼠剖腹手術后的神經炎癥反應、DNA 損傷及術后認 知 障 礙［19］。高 遷 移 率 族 蛋 白B1（high mobility group protein box 1，HMGB1）分泌到胞外可刺激炎癥介質釋放，加劇炎癥反應，而DMY 可通過抑制JAK2/STAT3 通路抑制脂多糖誘導的小膠質細胞HMGB1 釋放，從而抑制炎癥反應［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，DMY 可有效抑制異氟醚所致成年小鼠海馬組織JAK2/STAT3通路激活，還發(fā)現(xiàn)STAT3抑制劑AG490可進一步增強DMY 對異氟醚所致成年小鼠認知功能障礙的改善作用，該結果表明，DMY 對異氟醚所致成年小鼠認知功能障礙的改善可能與其抑制JAK2/STAT3通路激活有關。

綜上所述，DMY 可能通過抑制JAK2/STAT3 通路抑制小膠質細胞活化，促進其M1/M2 型轉化，從而改善異氟醚所致成年小鼠早期認知功能障礙。本研究不僅為DMY 在POCD 中的治療機制研究提供參考，還為POCD 治療新型藥物的探究提供了方向。但由于模型數(shù)量限制，本研究未對DMY 在POCD 中的其他可能機制進行探究，課題組將在未來的研究中進一步補充。