基于TLR4/NF-κB信號通路探討葛根黃連黃芩湯治療潰瘍性結腸炎的作用機制

許瑤瑤，蔡巧燕，2，趙春雨，賈沛芝，王美玲，林 煒，2，張 鈴，2*

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122）

潰瘍性結腸炎是一種原因不明的以直腸、結腸黏膜非特異性炎癥、潰瘍形成為主的病變。臨床主要癥狀有腹痛、腹瀉、里急后重、黏液膿血便［1-3］。臨床研究表明，與普通人相比潰瘍性結腸炎患者患結腸癌的風險是普通人的6～8 倍［4］，因此早期干預對減緩結腸炎相關性結腸癌的發生至關重要。潰瘍性結腸炎在古代文獻中并無確切的病名，可與中 醫“泄 瀉”“痢 疾”“腸 風”“便 血”“休 息 痢”等 對應［5］。張仲景在《傷寒論·太陽病脈證并治》中提：“太陽病，桂枝證，醫反下之，利遂不止，脈促者，表未解也。喘而汗出者，葛根黃連黃芩湯主之。”［6］表明葛根黃連黃芩湯主治下利。目前已有大量文獻報道葛根黃連黃芩湯在臨床上被廣泛地用于腸道疾病的治療，例如潰瘍性結腸炎、腸易激綜合征、結直腸癌等［7-10］。Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是一種在腸道固有免疫中起重要作用的模式識別受體，通常在潰瘍性結腸炎的結腸組織中高表達［11］；當TLR4受到外源刺激時，可激活NF-κB 的磷酸化，促使其入核，而NF-κB 作為免疫調節過程中的重要轉錄因子，其活化可增加促炎細胞因子的表達，最終加劇潰瘍性結腸炎的發生、發展［12］。本研究擬從TLR4/NF-κB 信號通路探討葛根黃連黃芩湯對葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導的潰瘍性結腸炎小鼠的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 6 周齡SPF 級C57BL/6 雄性小鼠20 只，體質量（22±1）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005，在福建中醫藥大學實驗動物SPF 級動物實驗室適應性喂養1 周，實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2019-0007，飼養條件為溫度濕度恒定，每天給予光照12 h。本研究方案經福建中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（審批號：2W202201 1 2022197）。

1.2 實驗藥物 葛根黃連黃芩湯，組方：葛根24 g，黃連9 g，黃芩9 g，炙甘草6 g。4 味藥物飲片均購自河北安嘉藥業有限公司，藥材均已按國家中藥飲片炮制規范進行炮制。

1.3 實驗試劑 DSS（美國MPMatenals 公司，批號：216011 090）；Phospho-NF-κB p-P65 抗體（批號：3033S）、NF-κB P65 抗體（批號：8242S）均購自美國CST 公司；TLR4 抗體（批號：66350-1-Ig）、GAPDH抗體（批號：60004-1-Ig）、Vinculin 抗體（批號：66305-1-Ig）、Goat Anti-Mouse IgG（H+L）-HRP conjugate 抗體（批號：SA00001-1）、Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）-HRP conjugate 抗體（批號：SA00001-2）均購自武漢三鷹生物技術有限公司；蘇木素染色液（批號：G1140）、伊紅染色液（批號：G1100）均購自北京索萊寶科技有限公司；免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司，批號：Kit-0017）；便隱血（OB）試劑（珠海貝索生物技術有限公司，批號：BA-2020B）；HiScript 1st Strand cDNA Synthesis kit（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號：R211-02）；SYBR?Select Master Mix kit（美國Thermo Fisher Scientific 公司，批號：4472908）；ELISA 試劑盒小鼠白細胞介素-1β（IL-1β）（批號：MM-0040M1）、小鼠白細胞介素-6（IL-6）（批號：MM-0163M1）、小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（批號：MM-0132Ml）均購自江蘇酶免實業有限公司。

1.4 實驗儀器 低溫高速離心機（美國Sigma-Aldrich 公司）；酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；電泳儀、電泳槽、轉膜裝置、全自動凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司）；全自動石蠟切片機（德國徠卡儀器公司）；生物組織石蠟包埋機（湖北孝感亞光醫用電子技術有限公司）；光學顯微鏡（德國徠卡儀器公司）；熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；形態學顯微圖像采集與分析系統（廈門市麥克奧迪實業集團有限公司）。

2 實驗方法

2.1 藥物制備 按照8∶3∶3∶2 的比例取4 種中藥飲片葛根、黃芩、黃連、炙甘草。先將藥物浸泡于8 倍量超純水中30 min，再回流提取，提取時間為1 h。等提取結束后，用紗布過濾藥液，再次加入等體積量的超純水，煎煮時間為1 h。結束后，再次加入等量的超純水量，煎煮1 h。等待3 次提取結束后，將藥液旋蒸濃縮為1 g/mL 葛根黃連黃芩湯藥液，用于后續實驗。

2.2 造模和分組 將20 只C57BL/6 小鼠按照隨機數字表法分為空白組、中藥組、模型組、模型＋中藥組，每組5 只。適應性喂養7 d 后開始造模。模型組和模型＋中藥組連續7 d 給予2.5% DSS 水自由飲用（注：每隔1 d 配制新鮮的2.5% DSS 水），7 d 后換蒸餾水飲用4 d。造模11 d，中藥組及模型＋中藥組給予葛根黃連黃芩湯，灌胃劑量為2 g/（kg·d）。空白組及模型組給予生理鹽水灌胃。

2.3 觀察指標

2.3.1 4組小鼠體質量及疾病活動指數評分計算 實驗期間每天記錄小鼠體質量，同時采用疾病活動指數（disease activity index，DAI）評分法觀察4 組小鼠體質量、糞便黏稠度、糞便潛血的變化。① 質量減輕評分：0≤體質量下降百分比＜1%，評0 分；1%≤體質量下降百分比＜5%，評1 分；5%≤體質量下降百分比＜10%，評2 分；10%≤體質量下降百分比＜15%，評3 分；體質量下降百分比≥15%，評4 分。② 糞便黏稠度評分：正常大便成形，評0 分；大便松散，評2 分；腹瀉，評4 分。③ 糞便潛血評分：肉眼可見無血便，評0 分；隱血陽性，評2 分；顯性出血，評4 分。

DAI＝（體質量減輕評分＋糞便黏稠度評分＋糞便潛血評分）/3

2.3.2 4 組小鼠結腸組織整體性狀觀察及長度測量 實驗結束后，隔天取材。采用脫頸法處死小鼠，取4 組小鼠結腸組織，平鋪于一次性濾紙上，觀察4 組小鼠結腸組織性狀的差異，同時做好標記并測量4 組小鼠結腸組織的長度，取材過程中將小鼠結腸組織進行拍照，測量從盲腸到肛門這一段結腸的長度，隨后將其收集保存。

2.3.3 4 組小鼠結腸組織病理學形態觀察 結腸組織從肛門位置起剪為3 段，所有結腸取靠近肛門端一段約0.5～0.8 cm 長度組織放于4%多聚甲醛溶液中固定，其余2 段組織將放入離心管中并立即放入液氮，隨后轉移到-80 ℃超低溫冰箱用于Western blot 和qPCR 實驗。采用梯度脫水法包埋組織，將結腸組織石蠟包埋塊切成厚度為4 μm 的切片，進行HE 染色，在光學顯微鏡下進行拍照。

2.3.4 Western blot 檢測4 組小鼠結腸組織中TLR4、p-P65、P65 蛋白表達量 結腸組織裂解后離心收集蛋白，并使用BCA 法進行濃度測量。經變性、電泳、轉膜、封閉后分別加入相應抗體TLR4、p-P65、P65（1∶1 000），搖床上4 ℃孵育過夜。一抗回收，將條帶置于二抗GAPDH、Vinculin（1∶5 000）中室溫孵育1.5 h。洗滌后，加入ECL 顯影液，用全自動化學發光成像系統（ChemiDoc XRS System）進行顯影，最后使用Image J 軟件進行灰度值分析。

2.3.5 免疫組化法分析4 組小鼠結腸組織中p-P65的蛋白定位及陽性表達率 將結腸石蠟塊切成厚度為4 μm 的切片，脫蠟后進行抗原修復，然后按照免疫組化試劑盒說明書進行操作。DAB 染色，蘇木素染核，樹脂封片并拍照，采用Image J 軟件分析系統對棕色顆粒（陽性表達）進行半定量分析。

2.3.6 qPCR 法檢測4 組小鼠結腸炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 的表達水平 提取4 組結腸組織總RNA，用NanoDrop2000 超微量分析儀測定RNA 濃度。利用 HiScript 1st Strand cDNA Synthesis kit 將總RNA 逆轉錄為cDNA。采用SYBR?Select Master Mix kit 和IL-1β、IL-6、TNF-α 引物進行擴增，以GAPDH 作為內參，采用2-ΔΔCt方法計算4 組結腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.3.7 ELISA 法檢測4 組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量 從-80 ℃冰箱中取出4 組血清，試劑盒置于室溫下平衡30 min。按要求加樣、溫育、洗滌、顯色、終止，利用全自動酶標儀檢測450 nm 下的OD 值，以標準曲線計算樣品中小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 的濃度，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

2.4 統計學方法 采用SPSS 25.0 統計軟件處理。計量資料符合正態分布以（±s）表示，2 組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結 果

3.1 4組小鼠體質量及DAI 評分的比較 空白組和中藥組在實驗期間，體質量呈現逐步上升趨勢，且2 組間差異無統計學意義（P＞0.05）；與空白組比較，模型組小鼠體質量從第9 天起顯著下降（P＜0.05）；經葛根黃連黃芩湯干預后，在第11 天模型＋中藥組小鼠體質量較模型組則有所增加（P＜0.05）。在DAI 評分方面，空白組和中藥組間差異無統計學意義（P＞0.05）；模型組小鼠的評分從第6 天起則顯著高于空白組（P＜0.05）；與模型組比較，模型＋中藥組的DAI 評分從第9 天起顯著降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 4 組小鼠體質量及DAI 評分的比較

3.2 4組小鼠結腸組織整體性狀及長度比較 空白組及中藥組小鼠結腸組織黏膜表面光滑，無充血、水腫，無糜爛及潰瘍形成；模型組小鼠結腸組織的腸壁增厚，黏膜呈彌漫性充血、水腫，廣泛糜爛；而模型＋中藥組小鼠結腸組織的損傷程度則明顯改善。4 組結腸組織長度統計分析顯示：空白組及中藥組小鼠結腸組織長度差異無統計學意義（P＞0.05）；與空白組比較，模型組的結腸組織長度明顯縮短（P＜0.05）；與模型組比較，模型＋中藥組的結腸長度則顯著增加（P＜0.05）。見圖2。

圖2 4 組小鼠結腸組織整體性狀及長度的比較

3.3 4組小鼠結腸組織病理學形態 空白組和中藥組小鼠結腸黏膜較為完整，杯狀細胞排列整齊，無炎癥細胞浸潤；與空白組對比，模型組黏膜糜爛嚴重，杯狀細胞排列紊亂；與模型組對比，模型＋中藥組黏膜糜爛程度明顯減輕，正常杯狀細胞也明顯增多，且炎癥浸潤明顯減少。見圖3。

圖3 4 組小鼠結腸組織HE 染色圖（×200）

3.4 4組小鼠結腸組織中TLR4、p-P65 及P65 的蛋白表達量比較 空白組與中藥組間的TLR4 的蛋白表達量、p-P65/P65 差異無統計學意義（P＞0.05）；與空白組比較，模型組中的TLR4、p-P65/P65 的蛋白表達量則顯著升高（P＜0.05）；經葛根黃連黃芩湯干預后，模型＋中藥組中的TLR4、p-P65/P65 的蛋白表達量較模型組顯著減少（P＜0.05）。見圖4。

圖4 4 組小鼠結腸組織中TLR4、p-P65 及P65 蛋白表達量比較

3.5 4組小鼠結腸組織中p-P65 的蛋白定位及相對表達量比較 當TLR4 受到外源刺激時，P65 被磷酸化后，能入核作為轉錄因子，調控下游促炎因子的表達。為了進一步驗證p-P65 的入核，采用免疫組化法檢測該蛋白定位及蛋白表達量。空白組與中藥組間小鼠結腸組織中p-P65 的陽性表達率差異無統計學意義（P＞0.05）；與空白組比較，模型組小鼠結腸組織中p-P65 的陽性表達率顯著升高（P＜0.05），且入核數量增加；與模型組比較，模型＋中藥組小鼠結腸組織中p-P65 的陽性表達率顯著降低（P＜0.05），且入核數量減少。見圖5。

圖5 4 組小鼠結腸組織中p-P65 的陽性表達比較（×400）

3.6 4組小鼠結腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達水平比較 qPCR 結果顯示：空白組與中藥組間IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）；與空白組比較，模型組中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，模型＋中藥組中的IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達水平則顯著降低（P＜0.05）。見圖6。

圖6 4 組小鼠結腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達水平比較

3.7 4組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量比較見表2。

表2 4 組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量比較（±s）

表2 4 組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

TNF-α/（ng/L）433.31±42.13 426.43±60.89 630.25±69.361）427.87±40.812）組別空白組中藥組模型組模型＋中藥組n4 4 4 4 IL-1β/（ng/L）79.70±7.85 82.72±3.01 102.37±12.781）81.24±4.112）IL-6/（pg/mL）44.64±3.44 44.65±7.70 67.62±13.041）47.43±4.892）

4 討 論

潰瘍性結腸炎是一種以局部組織損傷、腸道菌群失調、結腸炎癥為特征的疾病［13-14］。潰瘍性結腸炎主要表現為結腸中異常的炎癥反應以及免疫微環境內穩態的失調［15］。西醫對潰瘍性結腸炎還不能起到完全治愈的效果，且易引起胃腸道反應的毒副作用。中醫藥對于治療炎癥性疾病具有較大的優勢，通過多個藥物活性成分和多靶點來進行預防治療，具有協同作用，且不良反應小。本次研究發現，葛根黃連黃芩湯可以顯著改善DSS 誘導的潰瘍性結腸炎小鼠的結腸充血水腫情況，促進結腸黏膜的修復，從而減輕小鼠腹瀉、便血等癥狀，證明了葛根黃連黃芩湯對潰瘍性結腸炎具有保護作用。

葛根黃連黃芩湯由葛根、黃芩、黃連、炙甘草4 味藥物組成，具有解熱、抗菌、抗炎、抗病毒、解痙、抑制胃腸運動、抗缺氧、抗心律失常、增強機體免疫功能等藥理作用［16］。現代藥理研究發現，葛根黃連黃芩湯主要化學成分包括葛根素、黃芩苷、小檗堿、甘草酸等，上述成分均能發揮抗炎和免疫調節等作用［17-20］。葛根素能顯著抑制內皮細胞中NF-κB 磷酸化和細胞上清中TNF-α 的分泌，從而抑制炎癥反應的加劇［21］。黃芩苷、甘草酸在炎癥反應中也能起到很好的抑制作用［22-23］。小檗堿是一種能從多種植物中分離得到的生物堿，抗炎作用顯著［24］。以上研究均可作為葛根芩連湯治療潰瘍性結腸炎提供理論依據及物質基礎。

在經典的DSS 急性和慢性結腸炎小鼠模型中TLR4 基因表達增加［25］，而NF-κB 是炎癥性疾病的關鍵調節劑［26-27］，異常炎癥導致腸道內促炎和抗炎細胞因子之間的動態平衡被打破，進而對結腸組織造成不可逆轉的病理性損害。本研究結果表明，DSS 誘導的潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織中p65 被磷酸化后激活，且入核數量增加，隨之結腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達水平顯著升高，提示經DSS誘導后小鼠結腸組織中發生了明顯的炎癥反應。在葛根黃連黃芩湯干預后能顯著抑制DSS 誘導的潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織中P65 磷酸化及入核、以及促炎細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA 表達水平。這些結果均表明葛根黃連黃芩湯可能通過抑制TLR4/NF-κB 信號通路，進而降低DSS 誘導的潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織中的炎癥反應，從而減輕結腸損傷。但葛根黃連黃芩湯含有多種中藥活性成分，但對潰瘍性結腸炎免疫調節的機制、通路、具體作用靶點仍未明確。因此，今后需要從這些方面進行深入探討，以期為葛根黃連黃芩湯的臨床應用提供實驗依據。