梭魚草葉片抗氧化酶、抗壞血酸-谷胱甘肽循環與乙二醛酶系統對鉛脅迫的響應

辛建攀,馬思思,田如男

(南京林業大學 風景園林學院,南京 210037)

城鎮化進程的不斷加快、工農業廢水及生活污水的不合理排放等人類活動導致水環境重金屬污染問題日益突出。在面向生態文明建設的國家重大需求下,重金屬污染環境綠色修復是環境治理與修復領域的技術前沿和重點發展方向[1],而植物修復技術被認為是解決環境重金屬污染問題的一種有前途的綠色技術。近年來,越來越多的觀賞植物如蘆竹(Arundodonax)[2]、馬藺(Irislacteavar.chinensis)[3]和美人蕉(Cannaindica)[4]已經成為修復植物材料的重要來源。觀賞植物在重金屬污染水體中生長,不但能夠美化環境,而且還可以富集重金屬,有利于實現“邊修復、邊美化”的雙重目標。

梭魚草(Pontderiacordata)是一種多年生大型濕地觀賞植物,地下根狀莖粗壯、根系發達、生物量大;頂生穗狀花序,小花藍紫色,具有較高的園林觀賞價值。本課題組前期研究表明,該植物是一種重金屬耐性植物,能夠將多數重金屬離子固定在根系,可作為重金屬污染濕地修復的候選植物材料[5-6]。與根系相比,植物葉片對重金屬脅迫更為敏感[7]。研究表明,重金屬脅迫能夠降低植物葉片面積與厚度,同時誘導葉片細胞中過量積累活性氧自由基(ROS),加劇膜質過氧化作用,妨礙葉綠素生物合成,使葉片出現褪綠、枯萎等毒害癥狀[5-6,8-9],這會在一定程度上降低濕地植物的園林觀賞價值。同時,葉片生理代謝活動受阻也會妨礙濕地植物根系對金屬離子的吸收和轉運[6]。因此,了解濕地植物葉片對重金屬脅迫的耐性機制對于重金屬污染水體的植物修復和景觀重建具有重要意義。

為了緩解ROS引起的氧化損傷,植物進化出了一套抗氧化防御系統。其中,酶類抗氧化系統主要由超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)等組成。非酶類抗氧化系統主要有抗壞血酸(AsA)、類胡蘿卜素(Car)、谷胱甘肽(GSH)及植物螯合肽(PCs)等。在重金屬脅迫條件下,這些物質直接或間接參與植物葉片細胞中ROS的清除,并能夠改善植物葉片細胞生理功能,從而增強植物葉片抗逆能力[10-11]。甲基乙二醛(MG)是植物光合作用、糖酵解、脂質過氧化及蛋白質糖基化的副產物,具有細胞毒性,通過氧化脅迫以破壞細胞超微結構[12-13]。乙二醛酶系統是植物體內重要的脫毒系統之一,主要由乙二醛酶Ⅰ(Gly I)和乙二醛酶Ⅱ(Gly Ⅱ)組成,不但能夠有效清除MG,而且可以調控GSH再生,維持細胞氧化還原平衡,在植物適應重金屬脅迫中具有關鍵作用[14]。因此,本研究以梭魚草為試驗材料,分析鉛(Pb2+)脅迫下梭魚草葉片丙二醛含量、抗氧化酶活性、抗氧化劑含量及乙二醛酶系統活性的變化規律,以明確其葉片細胞應對Pb2+脅迫的生理機制,從而為重金屬污染濕地的“邊修復、邊美化”治理提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 供試材料與處理

試驗在南京林業大學國家級園林實驗教學示范中心溫室內完成。于5月份選取長勢一致、生長狀況良好的梭魚草植株(株高40～50 cm),清洗干凈后于2 L 1/2 Hoagland營養液的塑料桶中進行為期7 d的適應性培養,期間實時補充營養液至初始體積。待適應性培養結束后,將植株轉移至Pb2+濃度為0(CK),5.0,10.0,15.0 mg/L的1/2 Hoagland營養液中,每5 d對其進行更換。每一濃度水平各處理12株,重復3次。標記處理前為第0 天,并于第14,21 天時取葉片鮮樣用于測定各項生理指標。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 丙二醛和葉綠素含量

丙二醛(MDA)含量參照郝建軍等[15]的方法測定;葉綠素含量參照李合生[16]的方法測定。

1.2.2 抗氧化酶活性

取0.3 g新鮮葉片于50 mmol/L預冷的磷酸緩沖液(PBS)(pH 7.8,含1%的PVP)中研磨成勻漿,在4 ℃、12 000g下離心20 min,上清液即為待測酶液。超氧化物歧化酶(SOD)活性參照王晶英等[17]的方法測定,過氧化氫酶(CAT)活性參照陳建軍等[18]的方法測定。

另取0.3 g新鮮葉片置于50 mmol/L Tris-HCl[pH 7.0,含20%(W/V)甘油、1.0 mmol/L 抗壞血酸(ASA)、1.0 mmol/L DTT、1.0 mmol/L乙二胺四乙酸、1.0 mmol/L 還原型谷胱甘肽(GSH)、5.0 mmol/L MgCl2]提取液中,冰浴研磨,以4 ℃、10 000g離心20 min[19],上清液即為待測酶液。抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的測定參照Nakano等[20]的方法并略作修改;脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)活性的測定參照Nakano等[15]的方法;谷胱甘肽還原酶(GR)活性的測定參照Halliwell等[21]的方法。

1.2.3 非酶抗氧化劑含量

非蛋白巰基總肽(NPT)含量的測定參照Rama等[22]的方法,GSH含量的測定參照陳建勛和王曉峰[18]的方法,植物螯合肽(PCs)含量為NPT含量與GSH含量的差值[23];AsA含量的測定參照Kampfenkel等[24]的方法,脫氫抗壞血酸(DHA)含量為總AsA含量與AsA含量的差值。

1.2.4 乙二醛酶系統活性

甲基乙二醛(MG)含量的測定參照Wild等[25]的方法;乙二醛酶I(GlyI)活性的測定參照Hossain等[26]的方法;乙二醛酶Ⅱ(GlyⅡ)活性的測定參照Principato等[27]的方法。

1.3 數據處理

使用XLSX 2020軟件(WPS office,China)進行數據處理和制圖;采用SPSS 19.0軟件對數據進行方差分析,用LSD法和Duncan法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 鉛脅迫對梭魚草葉片MDA和葉綠素含量的影響

圖1,A顯示,在脅迫處理第14天時,與對照(0 mg/L Pb2+)相比,梭魚草葉片MDA含量在5.0,10.0 mg/L Pb2+處理下均無顯著變化,僅在15.0 mg/L Pb2+處理下顯著增加73.78%;在處理第21天時,與對照相比,梭魚草葉片MDA含量在5.0 mg/L Pb2+處理下也無顯著變化,在10.0,15.0 mg/L Pb2+處理下分別顯著增加65.65%和69.64%。然而,第21天梭魚草葉片MDA含量僅在10 mg/L Pb2+處理下顯著高于第14 天。

不同小寫字母表示處理濃度及時間之間在0.05水平有顯著差異。下同。

同時,如圖1,B-D所示,梭魚草葉片葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)和總葉綠素(Chl T)含量在脅迫處理第14天和第21天時均隨著Pb2+脅迫濃度的增加先升后降,并均在5.0 mg/L Pb2+處理時達到最大值。其中,在處理第14天時,葉綠素含量在各脅迫處理間及其與同期對照間均無顯著差異;在處理第21天時,Chl a、Chl b和Chl T含量在各脅迫處理下仍與同期對照無顯著差異,但在15.0 mg/L Pb2+處理下均顯著低于5.0 mg/L Pb2+處理。另外,在相同濃度Pb2+處理下,葉綠素含量在第14天與第21天之間均無顯著差異。以上結果說明,梭魚草葉片對5 mg/L Pb2+處理具有較強的耐受性,而當Pb2+濃度繼續增加時,梭魚草葉片會表現出明顯的毒害作用。

2.2 鉛脅迫對梭魚草葉片抗氧化酶活性的影響

首先,圖2,A、D、F顯示,在第14 天時,與對照相比,梭魚草葉片CAT、APX和DHAR活性在各濃度鉛脅迫處理下均無顯著變化;在處理第21 天時,與對照相比,梭魚草葉片CAT和APX活性在5.0,10.0 mg/L Pb2+處理下仍無顯著變化,CAT活性在15.0 mg/L Pb2+處理下顯著下降31.75%,而其APX活性此時顯著增加1.19倍;葉片DHAR活性在各濃度鉛脅迫處理下均比對照顯著下降。在相同濃度Pb2+處理下,葉片CAT、APX活性在第14 天與第21 天之間均無顯著差異,而其DHAR活性在處理第21 天比第14天顯著下降31.15%～62.29%。

圖2 不同濃度Pb2+處理下梭魚草葉片抗氧化酶活性的變化

其次,圖2,B,C顯示,在脅迫處理第14 天時,梭魚草葉片POD和SOD活性均比對照不同程度提高,并均在15.0 mg/L Pb2+處理時達到最大值,且與對照和其他處理差異顯著,但在5.0,10.0 mg/L Pb2+處理之間均無顯著差異。在脅迫處理第21 天時,梭魚草葉片POD和SOD活性均隨處理濃度增加呈逐漸上升趨勢,并在15.0 mg/L Pb2+處理下達到最大值;SOD活性在各處理及對照間均無顯著差異,葉片POD活性在5.0 mg/L Pb2+處理下與對照無顯著差異,在10.0,15.0 mg/L Pb2+處理下比對照分別顯著增加3.03,4.85倍。在相同濃度Pb2+處理下,各濃度處理SOD活性在第14天與第21天之間均無顯著差異(對照除外);與第14天相比,第21天的POD活性在5.0 mg/L Pb2+處理下顯著下降58.01%,而在10 mg/L Pb2+處理顯著增加2.94倍,在其余處理下無顯著差異。

此外,圖2,E顯示,在脅迫處理第14 天時,梭魚草葉片GR活性隨著脅迫濃度呈下降趨勢,并在15.0 mg/L Pb2+處理下達到最小值,而在5.0,10.0,15.0 mg/L 3個Pb2+處理之間均無顯著差異,但三者均比對照顯著降低;在脅迫處理第21天時,各濃度Pb2+處理下梭魚草葉片GR活性均與對照相比無顯著差異。在相同濃度Pb2+處理下,梭魚草葉片GR活性在第14天與第21天之間無顯著差異(對照除外)。以上結果說明,高濃度(15.0 mg/L)Pb2+處理下,POD、SOD、APX在緩解梭魚草葉片細胞氧化損傷中發揮了重要作用。

2.3 鉛脅迫對梭魚草葉片抗氧化物質含量的影響

首先,圖3,A、E顯示,隨著鉛脅迫濃度的增加,梭魚草葉片AsA和PCs含量均呈逐漸上升趨勢,并均在15.0 mg/L Pb2+處理下達到最大值。其中,在脅迫處理第14天和第21天時,葉片AsA和PCs含量在5.0,10.0 mg/L Pb2+處理下均與對照之間均無顯著差異,AsA含量在15.0 mg/L Pb2+處理下分別比對照顯著增加145.81%和161.00%,PCs含量則分別顯著增加135.08%和456.13%;在相同濃度Pb2+處理下,AsA含量在處理第14天與第21天之間均無顯著差異,PCs含量在15.0 mg/L Pb2+處理第21天時比第14天顯著增加62.21%,在其余濃度處理下兩時期間無顯著差異。

同時,從圖3,C、D來看,在處理第14 天時,葉片GSH和NPT含量在5.0,10.0 mg/L Pb2+處理下與對照之間均無顯著差異,在15.0 mg/L Pb2+處理下分別比對照顯著增加73.89%、92.48%;在脅迫處理第21 天時,梭魚草葉片GSH、NPT含量在5.0 mg/L Pb2+處理下仍與對照之間均無顯著差異,在10.0,15.0mg/L Pb2+處理下均比對照顯著增加;在相同濃度Pb2+處理下,第21天葉片GSH、NPT含量僅在15.0 mg/L Pb2+處理時比第14 天顯著增加,增幅分別為32.51%和43.53%。

另外,由圖3,B可知,在脅迫處理第14天時,梭魚草葉片DHA含量隨著Pb2+濃度的增加先降后升,并在10.0 mg/L Pb2+處理下達到最小值,但各脅迫濃度間均無顯著差異,且僅10.0 mg/L Pb2+處理與對照有顯著差異,降幅為33.68%;在脅迫處理第21天時,梭魚草葉片DHA含量隨著脅迫濃度增加呈逐漸下降趨勢,但各濃度處理均與對照之間均無顯著差異;在相同濃度Pb2+處理下,梭魚草葉片DHA含量在第14天與第21天之間均無顯著差異。以上結果說明,梭魚草葉片AsA和非蛋白巰基在其應對高濃度Pb2+脅迫中發揮了重要的解毒作用。

2.4 鉛脅迫對梭魚草葉片MG含量及Gly Ⅰ、Gly Ⅱ活性的影響

首先,圖4,A顯示,在脅迫處理第14天時,梭魚草葉片MG含量在5.0,10.0,15.0 mg/L Pb2+處理下均與對照無顯著差異;在脅迫處理第21天時,梭魚草葉片MG含量隨著脅迫濃度增加呈逐漸上升趨勢,并在15.0 mg/L Pb2+處理下達到最大值,各處理比對照顯著增加31.41%～71.73%;在相同濃度Pb2+處理下,各濃度Pb2+處理第21 天時葉片MG含量均比第14天顯著增加,增幅在74.99%～78.07%之間。

其次,從圖4,B可知,在脅迫處理第14天和第21天時,與對照相比,梭魚草葉片GlyI活性在5.0,10.0 mg/L Pb2+處理下均無顯著變化,在15.0 mg/L Pb2+處理下分別比對照顯著增加135.38%和117.91%;在相同濃度Pb2+處理下,GlyI活性在第14天與第21天之間均無顯著差異。

另外,從圖4,C來看,在脅迫處理第14 天時,梭魚草葉片GlyⅡ活性先降后升,在5.0,10.0 mg/L Pb2+處理下分別比對照顯著降低38.91%和58.82%,在15.0 mg/L Pb2+處理下與對照無顯著差異;在脅迫處理第21天時,各濃度Pb2+處理下梭魚草葉片GlyⅡ活性均顯著低于對照,但各濃度Pb2+處理之間均無顯著差異;在相同濃度Pb2+處理下,GlyⅡ活性在第14天與第21天之間均無顯著差異。以上結果說明,梭魚草葉片乙二醛酶系統無法緩解高濃度Pb2+脅迫誘發的羰基脅迫。

3 討 論

本研究中,在5.0 mg/L Pb2+處理第14天和第21天時,梭魚草葉片MDA、葉綠素和非酶抗氧化劑含量及抗氧化酶活性均無顯著變化,在較低濃度重金屬處理下的玉蟬花(Irisensata)[23]和魚腥草(Houttuyniacasdata)[29]上也得到了相似結果。此時,梭魚草植株可以正常生長,且葉片形態基本正常,意味著梭魚草葉片細胞中Pb2+并未過量積累。這可能是因為多數Pb2+被固定在根系,抑制了Pb2+由根系向葉片的轉運[30]。同時,也有研究認為,當介質中Pb2+濃度較低時,多數Pb2+被固定于葉片細胞壁和液泡中,這將有利于降低細胞器中自由態Pb2+濃度,從而避免Pb2+脅迫誘導的ROS過量積累[31]。

作為一種非營養型金屬離子,Pb2+在植物細胞中過量積累會誘發細胞膜中不飽和脂肪酸的脂質過氧化,導致MDA大量積累。MDA是表征逆境條件下植物受害程度的重要指標,其含量高低反映了細胞膜脂的過氧化程度。在本研究中,15.0 mg/L Pb2+處理使梭魚草葉片MDA含量顯著增加,與重金屬脅迫下卷毛委陵菜(Potentillasericea)[32]和多年生黑麥草(Loliumperenne)[33]葉片中MDA含量的變化規律相一致,表明此時梭魚草葉片細胞脂膜結構與功能已受到較嚴重破壞,從而會妨礙其正常的生理代謝活動。另外,有研究表明,重金屬脅迫誘導的膜脂過氧化作用會降低植物葉綠素含量[34],這在本研究中也到了證明。本研究發現,15.0 mg/L Pb2+處理第21 天時梭魚草葉片Chl a含量顯著下降。相似結果在重金屬脅迫下的煙草(Nicotianatabacum)[35]和草地早熟禾(Poapratensis)[36]等多種植物中也有報道。這可能是因為Pb2+一方面能夠取代葉綠體中Mg2+、Mn2+等離子,從而抑制葉綠素生物合成過程[37];另一方面Pb2+能直接誘導光合色素降解,破壞葉綠體結構[38]。

乙二醛酶系統主要由Gly Ⅰ、Gly Ⅱ組成,兩者共同催化MG解毒。MG是一種細胞毒性化合物,重金屬脅迫能夠誘發細胞MG過量積累,產生羰基脅迫,從而導致蛋白質和核酸等生物大分子受損,加速脂質過氧化作用[46]。研究表明,植物在逆境條件下可以通過上調Gly Ⅰ、Gly Ⅱ活性以提高MG的解毒能力[47]。本研究中,不同濃度Pb2+處理第21 天時,梭魚草葉片細胞MG含量明顯增加,這與重金屬脅迫下番茄的表現[48]相似,這意味著此時梭魚草葉片細胞遭受了過量Pb2+誘發的氧化脅迫,可由MDA含量的增加得到印證;同時,雖然15.0 mg/L Pb2+處理至第21 天時Gly Ⅰ活性顯著增加,但是Gly Ⅱ活性卻明顯下降。這種結果在重金屬脅迫下的菜心(Brassicaparachinensis)[49]上也得到了證實,表明乙二醛酶系統此時已經不能有效減緩羰基脅迫誘導的脂質過氧化作用。

4 結 論

在低濃度(5.0 mg/L)Pb2+處理下,梭魚草表現出良好的鉛脅迫耐受性,葉片細胞未發生明顯膜脂過氧化,葉綠素含量與抗氧化系統活性相對穩定。在較高濃度Pb2+脅迫處理下,梭魚草葉片細胞抗氧化酶(POD、SOD、APX)活性被激活,抗氧化劑(AsA)與非蛋白巰基化合物(GSH、PCs和NPT)大量合成以螯合細胞中過量Pb2+,在減緩葉片細胞氧化損傷中發揮了重要的解毒作用,而此時Gly I與Gly Ⅱ活性無法協調以完成對MG的解毒作用。