一個水稻基部葉角增大與早熟突變體blief的鑒定及基因定位

曾生元 杜燦燦 胡慶峰 李 闖 景德道 林添資 孫立亭 龔紅兵

（江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所，江蘇 句容 212400）

我國人均耕地僅有0.1 hm2左右，不足世界平均水平的一半，因此常利用雙季稻、稻-麥等輪作方式來提高土地的單位面積產量。高產是水稻（Oryza sativaL.）育種的永恒主題［1］，通過改良水稻株葉形態以提升其光能利用效率或延長生育期以增加其光合作用時間來提高碳素同化量是水稻獲得高產的兩條主要途徑［2-3］，但過長的生育期往往對后茬作物存在不利影響。因此，協同優化水稻株型與生育期，對實現我國糧食周年豐產具有促進作用。

水稻株型是其植株根、莖、葉、穗等形態特征的綜合表現［4］。葉傾角是指葉片與莖稈之間的夾角，是水稻株型的重要組成部分，對于其自身的光能利用及自然環境中鄰近植物間的競爭至關重要［5］。目前已報道了多個調控水稻葉傾角的基因，大多與油菜素內酯（brassinosteroids，BR）、生長素（auxin，IAA）或其他激素引起的細胞增殖或膨大有關，且對株高等其他株型特征同樣存在顯著影響，如D2（Dwarf2）［6］、D4［7］、D11［8］、Brd1（Brassinosteroid-deficient dwarf1）［9］等基因主要與BR合成與信號轉導相關，LC1（LEAF INCLINATION1）［10］、LC3［11］、LC4［12］、LPA1（Loose Plant Architecture1）［13］等與IAA的合成及信號轉導相關，LC2參與了多種植物激素信號轉導［14］。與上述激素合成及信號轉導不同的是，ila1（increased leaf angle1）突變體表型是由MAPKKK（mitogen-activated protein kinase kinase kinases）家族C組成員ILA1基因的T-DNA插入突變引起［15］。

抽穗期決定著水稻的種植區域和季節適應性，其調控機制一直是分子生物學家和育種家關注和研究的熱點。自Hd1（Heading date1）被克隆以來，已有多個抽穗期（生育期）基因和數量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）得到了克隆［16］，初步闡明了以OsGI（GIGANTEA）-Hd1-Hd3a和Ghd7（Grains-Height-Date7）-Ehd1（Early Heading date1）-Hd3a兩條通路為核心的調控網絡，其中前者為植物中保守的成花信號傳導途徑，而Ghd7-Ehd1途徑為水稻自身所特有的通路［17-18］。

迄今已克隆了眾多水稻株型和生育期的相關基因，但水稻株型與生育期之間的信號交流、協調作用仍缺乏系統研究，需要發掘更多的突變體以進行功能分析和育種利用研究。鑒于此，本研究在發現一個水稻基部葉角度顯著增大的早熟突變體（basal leaves inclination and early flowering，blief）的基礎上，對其進行表型鑒定、遺傳分析、精細定位和候選基因分析，以期進一步解析調控水稻生育期與株型的遺傳網絡，以及為選育具有動態優良株型的品種提供種質資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料野生型（wild type，WT）品種鎮恢832，系江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所選育的一個雜交中秈兩用恢復系（植物品種權號：CNA20100442.0）。在2013 年利用60Co-γ 射線輻射鎮恢832 干種子的M2代株系中獲得blief突變體，經過2014—2016 年連續4 代自交種植，確認突變性狀能穩定遺傳。武育粳3 號為直立葉角度遲熟中粳稻品種。

1.2 試驗設計

所有材料正季句容于5月15日播種，6月15日移栽，自然長日照（natural long-day，NLD），光周期約為光照14 h/黑暗10 h；海南陵水于12月15日播種，1月12日移栽，自然短日照（natural short-day，NSD），光周期約為光照11 h/黑暗13 h，單本種植，株行距16.7 cm×25.0 cm。記錄野生型與突變體第1至第7葉位的葉角度、抽穗期，在成熟期隨機選取野生型與突變體各10株進行農藝性狀測定，包括株高、有效穗、穗長、結實率、千粒重、粒型及單株產量。

參照吳旺嬪等［19］的方法測定種子的萌發特性：選取健康飽滿的水稻種子，先用60 ℃溫水沖洗3～4 次，在25 ℃的人工氣候箱浸種24 h 后，將水稻種子均勻擺放在發芽盒中培養，每盒播種100粒，光強為10 000 lx，光周期為光照14 h/黑暗10 h，相對濕度為70%，視情況補充蒸餾水，浸種后第3天測定發芽勢，第10天隨機選取10株測定植株芽長、根長及鮮重。

1.3 分子標記和總DNA 的提取

水稻葉片總DNA 的提取采用十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）法進行。

簡單序列重復（simple sequence repeat，SSR）標記根據McCouch 等［20］構建的SSR 連鎖圖獲得，插入缺失（insertion-deletion，InDel）、衍生型酶切擴增多態性序列（derived cleaved amplified polymorphism sequences，dCAPS）標記運用Primer 5.0 軟件自行設計。所有SSR、InDel、dCAPS標記均由南京金斯瑞生物技術有限公司合成。

用于一般標記檢測的PCR反應體系和反應條件參照林添資等［21］的方法，PCR 反應產物經8%垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳后0.1%硝酸銀染色觀測。

dCAPS 標記的檢測方法：PCR 擴增采用50 μL體系：模板DNA 3.0 μL，10×PCR 的緩沖液4.0 μL，2 mmol·L-1的dNTP 2.0 μL，0.3 μmol·L-1的上下游引物各2.0 μL，Taq 酶1.0 U，加ddH2O 補足50 μL，擴增程序參考文獻［21］。反應產物首先取10 μL經3%瓊脂糖電泳檢測，溴化乙錠染色后在凝膠成像儀觀察確認擴增片段的正確后，參照Mbol 酶（NEB，北京）說明書將擴增產物37 ℃酶切30 min，連同酶切前擴增產物作為對照采用3%瓊脂糖電泳，溴化乙錠染色后在凝膠成像儀上拍照。

1.4 遺傳分析及基因定位

1.4.1 遺傳分析群體 2016 年正季以突變體與野生型親本正交，同時以野生型親本與突變體反交，種植相應的F1群體，自交獲得F2群體，根據F1及F2群體的性狀及性狀分離比例進行遺傳統計分析。

1.4.2 定位群體 2016 年正季用突變體與粳稻親本武育粳3 號雜交，2017 年正季從F2群體中選取15 株正常植株和284 株純合隱性植株（基部葉角度大、極端早熟個體）構成初定位群體，分單株取葉片提取DNA 用于初步定位。由于blief/武育粳3號F2群體生育期分離大，存在矛盾單株的問題，2017 年海南開始利用初定位兩側標記篩選含目標區段的雜合個體，與受體親本武育粳3 號回交2 次以純化背景，2019 年在BC2F2群體中獲得背景較為單一的437個極端隱性個體。

1.4.3 基因定位 F2定位群體中各隨機選取15 個正常植株及突變株分別混合作為正常和突變基因池，利用江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所中心實驗室（本實驗室）已有的分子標記，采用集團分離分析法（bulked segregant analysis，BSA）法篩選連鎖標記，確定BLIEF基因所在染色體，之后進一步擴大群體、加密標記，采用圖位克隆法對BLIEF基因進行精細定位。

1.5 生物信息學與基因測序

參照Rice Genome Annotation Project（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）網站對目標區段內基因的功能進行預測分析。

依據日本晴的基因組序列設計引物，利用PrimeSTAR?長片段高保真酶（TaKaRa，北京），分別擴增突變體和野生型品種基因組DNA，每個片段在1 200～2 600 bp之間，PCR產物回收采用GK2045試劑盒（上海捷瑞），按說明書操作，回收產物連到pMD18-T 載體（TaKaRa，北京）上進行測序，測序結果用Vector NTI 9.0及Cluster W軟件比對分析。序列測定在南京擎科生物有限公司完成。

1.6 候選基因突變位點的驗證

根據測序結果，發現突變體與野生型存在兩個單堿基核苷酸（single nucleotide polymorphism，SNP）差異，遂根據dCAPs-finder 2.0 網站（http：//helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html）分析序列，利用Primer 5.0 軟件設計dCAPs標記進行檢測驗證。

1.7 水稻總RNA 提取及實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)

在苗期選取野生型和突變體第三葉葉片組織，采用植物RNA 小量提取試劑盒（天根北京）提取總RNA。反轉錄用Prime Script RT regent Kit 試劑盒（TakaRa，北京）進行，以反轉錄的cDNA作為模板，采用SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（TaKaRa，北京），在7500 Real-time PCR系統（Applied Biosystems，美國）上按說明書進行qRTPCR 分析，采用2-ΔΔCt方法分析基因的相對表達量，每個樣本重復3次。

2 結果與分析

2.1 突變體的表型特征

與野生型品種鎮恢832 相比：突變體種子芽勢更強、萌發速度更快（表1、圖1-A），前6 張葉片角度顯著或極顯著增大，第7張葉片角度恢復正常（圖1-B、C 和圖2）；正季自然長日照條件下抽穗期提前10 d，冬季自然短日照條件下提前6 d（圖3），由此將突變體命名為blief。其他主要農藝性狀中，blief的株高顯著降低，單株有效穗數、每穗粒數有所降低，粒寬及千粒重顯著增加，單株產量降低但均未達到顯著水平（表2）。

圖1 野生型與blief突變體不同時期的植株形態比較Fig.1 The morphological differences between wild type and blief at different growing stage

圖2 野生型與blief葉片角度Fig.2 The leaves angle of wild type and blief

圖3 野生型與blief在自然長日照（NLD）和短日照（NSD）的生育期比較Fig.3 The heading date of wild type and blief under different environmental conditions

表1 野生型與blief種子萌發特性的比較Table 1 Germination characteristics of wild type and blief

表2 野生型與blief主要農藝性狀的比較Table 2 Agronomic traits of wild type and blief

2.2 突變性狀的遺傳分析

突變體blief經4 代自交確定突變性狀可穩定遺傳，blief與野生型親本鎮恢832 正反交的F1植株均表現正常，F2可區分為差異明顯的正常植株和突變株兩種類型，經卡方（χ2）測驗，其分離比例均符合孟德爾3∶1的分離比（表3），表明該突變性狀受一對隱性核基因控制。

表3 突變體blief的遺傳分析Table 3 Genetic analysis of blief

表4 本研究所用的部分標記信息Table 4 Part of markers employed in this study

2.3 基因定位

2017 年利用本實驗室已有的551 對SSR、InDel 標記，篩選得到在兩親本間表現出多態的178 對標記。隨機選取正常株和極端突變株各15 個構建正常和突變基因池，先用均勻分布于水稻12條染色體上的112對多態SSR標記篩選，發現位于水稻第3染色體上的SSR標記RM6291、RM282 與BLIEF基因連鎖。進一步利用區間內的已有標記，檢測F2取得的所有284 株隱性個體，但由于blief/武育粳3號F2群體生育期分離很大，在選取極端早熟個體時不準確，導致出現了10 株矛盾個體，根據對應的分子標記帶型數據，只能初步確定BLIEF基因位于InDel 標記In3-13 與SSR 標記RM282之間，這兩個標記間的物理距離約4.4 Mb。

為了精細定位BLIEF基因，同年利用擴大區間的兩側標記RM6291與RM282重新從F1開始篩選含目標區段的雜合個體，與受體親本武育粳3號回交，得到背景較為單一的BC2F2群體，在BC2F2群體中獲得437 個基部大葉角早熟極端個體。同時在In3-14 與RM282 之間開發標記，獲得15對多態性InDel標記，利用這17個標記對437 個BC2F2定位群體進行擴增，分子標記BL3-24 和BL3-27 各檢測到1 個重組單株，而BL3-25未檢測到重組單株，據此將BLIEF基因限定在BL3-24和BL3-27之間，參照日本晴基因組序列的物理距離約為51 kb（圖4-A）。

圖4 BLIEF基因的圖位克隆Fig.4 Map-based cloning of BLIEF gene

圖5 野生型和blief部分株型、生育期調控基因的表達水平Fig.5 Relative expression levels of genes involved in planttype and flowering time between WT and blief

2.4 候選基因的初步確定

參照Rice Annotation Project Database 網站注釋，發現定位區間內存在7 個開放式閱讀框（open reading frame，ORF），其中Os03g0309100編碼水稻B類光敏色素OsPhyB基因（表5）。參考已有報道，該基因在水稻激素及生育期調控遺傳網絡中存在的重要作用［22-25］，因此選定其為本突變體的候選基因。

表5 定位區間內的基因功能預測Table 5 Genes annotation in mapping region of BLIEF

參考基因組日本晴序列，設計了4 對引物分別擴增突變體和野生型Os03g0309100基因的基因組序列（表4）。比對結果發現，突變體與野生型在Os03g0309100基因在第一個外顯子內存在2 個SNP 差異，即由TG 突變為GT，導致了突變體基因轉錄提前終止?；谶@一序列差異，結合dCAPS-finder 2.0 網站的分析，開發了一對dCAPS 標記Phy-dCAPs1，用Phy-dCAPs1 分別擴增野生型與突變體，產物再用內切酶Mbo1 酶切，發現突變體可以切開，而野生型無法切開，從而驗證了測序結果的準確性（圖4-B、C）。

2.5 相關基因的表達分析

利用qRT-PCR 檢測野生型及blief苗期葉片組織中部分株型及生育期基因的表達量。結果顯示突變體中的OsPhyB基因表達量極低，說明突變體基因轉錄提前終止導致其功能喪失，進一步證明OsPhyB可能是BLIEF的候選基因。突變體中其他3 個株型基因IPA1（Ideal plant architecture1）、Brd1、D11的表達水平極顯著上調，其中IPA1上調幅度最大；OsGI（GI）-Hd1-Hd3a通路的主要基因：突變體中OsGI、OsPhyB的表達量均極顯著降低、Hd3a的表達量極顯著上調；Ehd1途徑中的Ehd1及成花素基因RFT1表達量極顯著上升，成花素基因OsMADS14、OsMADS15表達量一降一升。

3 討論

為了使水稻在全生育期充分捕獲和利用太陽光能，近年來有學者提出了“動態理想株型”的概念，要求水稻植株前期叢生快長，分蘗角度、葉片角度前期較大（有一定角度披垂）而后期恢復直立，呈動態變化，從而有效改善群體結構和受光姿態，提高光能利用率而增加產量［26-28］。本研究在中秈恢復系鎮恢832 的輻射后代中獲得了一個基部葉角度顯著增大但后期能恢復直立的突變體blief，突變體萌發速度更快，生育期顯著變短，植株生長量有一定的降低但單株產量沒有顯著下降，在一定程度上符合動態理想株型的特征。

本研究遺傳分析結果表明，blief受一對隱性核基因控制，進一步采用圖位克隆技術將BLIEF基因精細定位于第3 染色體短臂InDel 標記BL3-24 和BL3-27之間的51 kb 區間內。基因測序及功能標記檢測結果表明，blief中OsPhyB基因的基因序列發生了堿基替換，導致其轉錄提前終止，結合基因定量表達結果，表明BLIEF為OsPhyB的一個功能缺失的等位基因。已有的研究發現，OsPhyB可負調控BR 的激素信號傳導，從而調控水稻株型特別是葉傾角的形成［22-23］；此外，OsPhyB還在Hd1、Ehd1生育期通路中起調控作用，PhyB 蛋白可抑制成花因子Hd3a、早花基因Ehd1促進因子OsCOL4 的表達，從而在長日照條件下抑制水稻開花［24-25］。最新研究發現，OsPhyB基因在水稻生物（如紋枯病）與非生物脅迫（干旱、冷害）響應等方面起重要作用［29-31］。本研究選取了株型及生育期部分基因，對其表達情況進行了檢測，結果表明blief中除OsPhyB的表達量極低外，大多株型基因的表達量出現不同程度的上調，其中IPA1、Brd1、D11的表達水平極顯著上調，說明PhyB 很可能作用于IPA1、Brd1、D11 上游。生育期基因方面，本研究突變體中Hd1的促進因子OsGI的表達量均顯著下降，而Hd1的表達量未發生顯著變化，大多促進水稻抽穗的基因，如Ehd1及成花素基因Hd3a、RFT1表達量顯著上調，這與blief突變體在不同環境條件下生育期均顯著提前一致。綜上，本研究結果進一步驗證了OsPhyB基因功能的多效性，其功能缺失可導致水稻基部葉片角度變大、生育期提前以及諸多產量性狀發生改變，對該基因的進一步研究將有助于加深對人們水稻株型、生育期及抗逆性遺傳網絡的理解。

4 結論

與野生型鎮恢832 相比，本研究blief突變體芽勢更強，基部葉片角度顯著變大、后逐漸恢復正常，在不同環境條件下的抽穗期均顯著提前，且產量性狀發生了顯著變化。BLIEF基因精細定位于第3 染色體短臂InDel 標記BL3-24 和BL3-27 之間，物理距離為51 kb，基因測序、功能標記檢測和基因定量表達分析結果表明，BLIEF為OsPhyB的一個無功能的等位基因，blief中多個生育期、株型調控相關基因的表達發生顯著變化。