葡萄糖酸鈉對三角褐指藻巖藻黃素與中性脂肪酸的影響

伏 靖 王何瑜 胡 媛 龔一富，

（1寧波大學海洋學院，浙江省海洋生物工程重點實驗室，浙江 寧波 315832；2寧波大學食品與藥品學院，浙江 寧波 315832）

三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）是一種生長迅速、適應能力強、脂質含量高且富含巖藻黃素的海洋單細胞模式硅藻，每年可提供全球20%的初級生產力［1］，在巖藻黃素生產和新能源方面具有重要地位［2］。巖藻黃素是一種內縮醛類胡蘿卜素，廣泛分布于海洋藻類、單倍體和菊科［3］，巖藻黃素在動物體內具有抗腫瘤［4］、抗炎癥［5］、抗氧化［6］、減肥［7］、抗瘧疾等效果［8］，在食品與藥品、化妝品和農業養殖等行業應用廣泛［9-10］。研究表明，巖藻黃素合成受相關酶基因控制，同時也受到光合作用的影響。八氫番茄紅素去飽和酶（pds）和番茄紅素β-環化酶（lcyb）是巖藻黃素合成的關鍵酶，對巖藻黃素積累具有校高的貢獻率［11］。光系統Ⅱ蛋白D1 基因（psbA）和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶大亞基基因（rbcL）參與微藻光系統Ⅱ過程，與微藻光呼吸和碳同化速率密切相關，有研究表明psbA基因和rbcL基因表達下降會抑制巖藻黃素的積累［12］。微藻脂類主要分為中性脂肪酸和極性脂肪酸兩大類，其中中性脂肪酸主要包括甘油三酯、固醇類和游離脂肪酸等，極性脂肪酸主要包括磷脂和糖脂。研究表明，甘油-3-磷酸酰基轉移酶基因（gpat）和Δ12脂肪酸去飽和酶基因（FAD2）是藻類脂肪酸合成的關鍵酶基因，其中甘油-3-磷酸酰基轉移酶基因被認為是甘油酯生物合成的關鍵限速酶基因［13］。目前，已有多種誘導物被應用到巖藻黃素和脂肪酸生產過程中，但使用碳源兼養三角褐指藻生產巖藻黃素和脂肪酸的方式還相對研究不足。

葡萄糖酸鈉（sodium gluconate）是一種價格低廉、性質穩定的有機酸鹽，化學式為C6H11NaO7，在工業、發酵、醫療等方面用途廣泛［14］。周景文等［15］研究發現，葡萄糖酸鈉可以調節生物體內NADH/NAD+比例和ATP 水平，加速糖酵解速率，提高丙酮酸產量。Zhang 等［16］研究表明，葡萄糖酸鈉通過提高枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）磷酸戊糖途徑來有效促進核黃素的產生。雖然葡萄糖酸鈉在工業、醫療和微生物發酵過程中已有研究，但是在藻類養殖過程中還鮮有報道。Pang等［17］研究表明，葡萄糖酸鈉可以促進雨生紅球藻的生物量積累。基于此，本研究將葡萄糖酸鈉應用到三角褐指藻培養過程中，研究葡萄糖酸鈉對三角褐指藻生長與次生代謝物的影響，以期提高三角褐指藻巖藻黃素和脂質含量，為規模化生產巖藻黃素提供前期研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三角褐指藻藻種來源于寧波大學植物資源開發重點實驗室，用f/2培養基培養。葡萄糖酸鈉（化學純）購自上海麥克林生化科技有限公司。植物RNA 提取試劑盒和ChamTMQ Universal SYBR?qPCR Master Mix kit購自諾唯贊生物科技股份有限公司。Prime Script RT Reagent Kit購自寶日醫生物技術（北京）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 藻類培養 將處于對數生長期的藻種按照1∶10的比例接種于滅菌后的f/2培養基中，培養光照強度設置為60 μmol·m-2·s-1，光周期設置為光照12 h/黑暗12 h，溫度控制在（25±1）℃，培養基pH 值控制在7.5 左右，培養周期為10 d。每天定時搖晃藻瓶3 次，防止藻細胞下沉。

1.2.2 葡萄糖酸鈉濃度設置 對照組使用f/2培養基培養三角褐指藻，試驗組在f/2培養基組分基礎上額外添加葡萄糖酸鈉作為補充碳源，設置葡萄糖酸鈉濃度為10、50、100、200、400和600 mmol·L-1，每組設置3重復。

1.2.3 三角褐指藻生長曲線測定 三角褐指藻生長曲線通過紫外分光光度法［18］進行測量，每24 h 取3 mL三角褐指藻藻液用UV-5200 型紫外可見分光光度計（METASH，上海）測定藻液在680 nm處的吸光值，然后根據標準曲線公式計算細胞密度，并根據細胞密度繪制葡萄糖酸鈉兼養下三角褐指藻的生長曲線。細胞密度計算公式如下：

式中，y代表細胞密度（106個·mL-1），x代表吸光值，R2=0.99。

1.2.4 三角褐指藻比生長速率測定 用葡萄糖酸鈉

兼養三角褐指藻后，根據公式計算每天的比生長速率（μ），并根據μ 繪制葡萄糖酸鈉兼養下三角褐指藻的比生長速率曲線。μ的計算公式如下：

1.2.5 三角褐指藻次生代謝物測定 三角褐指藻的巖藻黃素與葉綠素a 按照徐潤潔等［19］的方法，通過有機溶劑浸提法進行提取。從各樣本中取100 mL 藻液，4 ℃、5 000 r·min-1條件下離心10 min，移棄上清，將藻泥在-80 ℃冰箱中凍存24 h后冷凍干燥24 h，凍干藻泥研磨成粉，稱取0.1 g藻粉加入4 mL無水乙醇，在60 ℃條件下避光浸提2 次，每次1 h，浸提完成后4 ℃、5 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液于紫外可見分光光度計檢測在445 nm 處的吸光值，然后根據公式（3）計算巖藻黃素產量：

式中，Pfuc的單位為mg·L-1，A445表示浸提液在445 nm處的吸光值，N表示稀釋倍數，V表示粗提液體積（mL），A1%1cm表示巖藻黃素濃度為1 g·L-1時上清液在光徑為1 cm時的光吸收值，即1 600。

從各樣本中取10 mL藻液，4 ℃、5 000 r·min-1離心10 min，用ddH2O 洗滌2 次后加入10 mL 無水乙醇避光浸提24 h，然后使用紫外可見分光光度計檢測各樣本在652和665 nm處的吸光值，然后根據公式（4）計算葉綠素a含量：

式中，Cchla的單位為μg·L-1，A665表示浸提液在665 nm處的吸光值，A652表示浸提液在652 nm處的吸光值。

參照韋鳳娟等［20］的方法，通過尼羅紅染色法［21］測量中性脂肪酸的相對含量。從各樣本中取1.25 mL藻液，加入13 μL二甲基亞砜（Dimethy sulfoxide，DMSO）于離心管中，微波處理40 s 后加入39 μL 尼羅紅染液，混勻后50 ℃水浴染色5 min，孵育結束后用的Varioskan LUX 型酶標儀（賽默飛，美國）測量各樣本在激發波長為480 nm 時，發射波長為580 nm 處的吸光值，然后通過計算得出各樣本之間總脂肪酸的相對含量。

1.2.6 實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）檢測基因表達水平 葡萄糖酸鈉處理對數生長期的三角褐指藻24 h 后，4 ℃、5 000 r·min-1條件下離心10 min，移棄上清液。采用植物RNA 提取試劑盒提取樣本總RNA，獲得的總RNA 采用Takara Prime Script RT Reagent Kit 進行反轉錄成cDNA。在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）找到三角褐指藻巖藻黃素合成相關的lcyb與pds，與光合作用相關的rbcL與psbA，與脂類合成的gpat與FAD2全基因組序列，使用Primer 5.0 設計lcyb、pds、rbcL、psbA、gpat和FAD2基因的引物（表1），以β-actin為內參基因，引物由杭州有康生物技術有限公司合成。qRT-PCR 反應體系共20 μL：正、反向引物各0.4 μL、2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL、ddH2O 6.4 μL、模板2 μL。程序在實時熒光定量PCR 儀（賽默飛世爾，新加坡）上進行，擴增反應程序條件為：94 ℃預變性30 s，94 ℃變性10 s，50 ℃退火10 s，共40個循環。基因相對表達量數據以β-actin作為內參基因，采用2-ΔΔCT法［22］計算得出。

表1 目標基因引物Table1 Primers of target genes

1.2.7 數據分析 使用Excel 2019對數據進行處理，使用SPSS 26 進行數據的顯著性進行Person 相關性分析，將P＜0.05認定為差異顯著，將P＜0.01認定為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖酸鈉對三角褐指藻生長的影響

不同濃度葡萄糖酸鈉處理三角褐指藻后（圖1-A），三角褐指藻細胞密度呈現先升高后降低的趨勢，在200 mmol·L-1時三角褐指藻細胞密度達到最大值，為8.95×106個·mL-1，其次為100 mmol·L-1組，細胞密度為8.82×106個·mL-1，均極顯著高于對照組的5.13×106個·mL-1，分別是對照組的1.75 和1.72 倍（P＜0.01）。研究表明400 mmol·L-1的葡萄糖酸酸鈉依然對三角褐指藻細胞密度具有促進作用，當濃度達到600 mmol·L-1時，三角褐指藻細胞密度極顯著低于對照組（P＜0.01）。葡萄糖酸鈉濃度在0～200 mmol·L-1時（圖1-B），三角褐指藻最大比生長速率（μ）在第3天達到峰值，然后迅速降低，其中μ 最大值出現在200 mmol·L-1，為0.59。當葡萄糖酸鈉濃度高于200 mmol·L-1時，三角褐指藻比生長速率可在較長時間保持相對穩定。

圖1 葡萄糖酸鈉對三角褐指藻細胞密度（A）與比生長速率（B）的影響Fig.1 Effect of sodium gluconate on cell density （A） and specific growth rate （B） of P. tricornutum

2.2 葡萄糖酸鈉對三角褐指藻巖藻黃素與葉綠素a的影響

不同濃度葡萄糖酸鈉處理三角褐指藻后，隨著葡萄糖酸鈉濃度升高，三角褐指藻巖藻黃素產量（圖2-A）和葉綠素a（圖2-B）含量呈現先升高后降低趨勢，在10～200 mmol·L-1濃度內，三角褐指藻巖藻黃素產量均顯著或極顯著高于對照組（P＜0.05、P＜0.01），葉綠素a含量極顯著高于對照組（P＜0.01），表明10～200 mmol·L-1葡萄糖酸鈉有助于積累巖藻黃素和葉綠素a。葡萄糖酸鈉濃度為200 mmol·L-1濃度時，巖藻黃素產量最高，為0.36 mg·L-1，極顯著高于對照組0.20 mg·L-1（P＜0.01），是對照組的1.79 倍。葡萄糖酸鈉濃度為100 mmol·L-1時，葉綠素a 含量最高，為對照組的1.67倍。當葡萄糖酸鈉濃度大于200 mmol·L-1時，三角褐指藻細胞巖藻黃素產量和葉綠素a 含量極顯著低于對照組（P＜0.01）。

2.3 葡萄糖酸鈉對三角褐指藻中性脂肪酸含量的影響

不同濃度葡萄糖酸鈉處理三角褐指藻后，中性脂肪酸含量呈現逐漸提高的趨勢（圖3），各處理組中性脂肪酸含量均極顯著高于對照組（P＜0.01），600 mmol·L-1組中性脂肪酸含量最高，達到2.51 mg·g-1，極顯著高于對照組的0.15 mg·g-1（P＜0.01）。

圖3 葡萄糖酸鈉對三角褐指藻中性脂肪酸的影響Fig.3 Effect of sodium gluconate on neutral fatty acids in P. tricornutum

2.4 葡萄糖酸鈉對三角褐指藻基因表達的影響

研究不同濃度葡萄糖酸鈉對三角褐指藻巖藻黃素合成相關基因表達，結果表明，隨著葡萄糖酸鈉濃度的增加，lcyb（圖4-A）和pds（圖4-B）基因表達呈現先升高后降低的趨勢，并在葡萄糖酸鈉濃度為50 mmol·L-1時，lcyb與pds基因的相對表達量顯著高于對照組（P＜0.05），分別為對照組的2.30 和2.35 倍。葡萄糖酸鈉濃度在10～200 mmol·L-1時，對三角褐指藻lcyb和pds基因均具有促進作用，當葡萄糖酸鈉濃度高于200 mmol·L-1時，促進了pds基因的表達，而抑制了lcyb基因的表達。

圖4 葡萄糖酸鈉對三角褐指藻關鍵基因表達的影響Fig.4 Effects of sodium gluconate on the expression of key genes in P. tricornutum

研究不同濃度葡萄糖酸鈉對三角褐指藻光合作用相關基因psbA（圖4-C）和rbcL（圖4-D）基因表達的影響，結果表明，隨著葡萄糖酸鈉濃度的增加，psbA基因表達量逐漸降低，而rbcL基因表達量逐漸升高。當葡萄糖酸鈉濃度大于200 mmol·L-1時，試驗組rbcL基因表達量顯著或極顯著高于對照組（P＜0.05、P＜0.01），表明高濃度葡萄糖酸鈉可以促進rbcL基因的表達隨著葡萄糖酸鈉濃度的升高，psbA表達量呈下降趨勢，并且濃度均極顯著極于對照組（P＜0.01）。

研究不同濃度葡萄糖酸鈉對三角褐指藻中心脂肪酸合成相關的gpat（圖4-E）和FAD2（圖4-F）基因表達的影響，結果表明，隨著葡萄糖酸鈉濃度的增加，gpat基因表達呈現先升高后降低的趨勢，在葡萄糖酸鈉濃度為50 mmol·L-1時，gpat基因的相對表達量最高，極顯著高于對照組（P＜0.01），為對照組的3.56倍。FAD2基因表達量與葡萄糖酸鈉濃度成正比，表明葡萄糖酸鈉可能通過促進FAD2和gpat基因的表達來促進中性脂肪酸積累。

3 討論

三角褐指藻能利用光能和CO2進行光合作用，也能在額外補充碳源的情況進行兼養生長。劉曉娟［23］研究發現，葡萄糖、果糖、乙酸鈉、甘油等均對三角褐指藻生長起促進作用，王珊等［24］進一步研究發現甘油能顯著提高三角褐指藻巖藻黃素含量。丁曉婷等［25］使用甘露糖作為有機碳源兼養三角褐指藻后顯著提高三角褐指藻生物量，并且發現甘露糖能促進巖藻黃素和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）含量的積累。本研究使用不同濃度葡萄糖酸鈉兼養三角褐指藻過程中，發現采用200 mmol·L-1葡萄糖酸鈉可以顯著提高三角褐指藻生物量，是對照組的1.75 倍，與Pang等［17］的研究結果一致。推測是因為葡萄糖酸鈉與作為能源物質的葡萄糖具有類似的結構，進入磷酸戊糖途徑，作為能源物質支持三角褐指藻的生長［26-27］。在生理指標方面，葡萄糖酸鈉有助于三角褐指藻葉綠素a和中性脂肪酸含量積累，能顯著提高巖藻黃素產量。前人研究表明，與葡萄糖相比，葡萄糖酸鈉作為碳源具有利用率高和培養基pH 值穩定等優點［28］。本研究采用葡萄糖酸鈉兼養三角褐指藻后顯著提高了三角褐指藻的生物量，為微藻培養與提供了一條有效途徑。

本研究對不同濃度葡萄糖酸鈉誘導下三角褐指藻的lcyb、pds、psbA、rbcL、FAD2與gpat基因定量發現，與巖藻黃素合成有關的lcyb和pds表達量與巖藻黃素含量趨勢一致，均呈現先促進后抑制的情況，表明葡萄糖酸鈉可以通過促進lcyb和pds表達來提高巖藻黃素含量。Zhu等［29］使用硫酸鈰銨提高三角褐指藻巖藻黃素含量的研究中，發現lcyb和pds對三角褐指藻巖藻黃素合成的貢獻率最大，推測lcyb和pds可能是三角褐指藻體內巖藻黃素合成的關鍵基因。葡萄糖酸鈉處理三角褐指藻后與光合作用相關的psbA出現下降的趨勢，表明隨著葡萄糖酸鈉的濃度的增加三角褐指藻的光合作用受到抑制，推測藻種還處于恢復期，未達到植物生長的最佳狀態，影響了psbA的表達［30］。前人研究表明，FAD2參與不飽和脂肪酸的合成過程。Wen 等［31］研究表明，提高FAD2的表達量可以增加食用花生油油酸含量，推測FAD2是油脂合成的關鍵基因之一。尹航等［13］研究表明，gpat的表達量與三角褐指藻總脂肪酸含量呈正相關。汪翔［32］通過對GPAT1和AGPAT1雙節點過表達，發現GPAT1和AGPAT1聯合作用會促進TAG 明顯積累。葉冠華［33］通過將兩個甘油-3-磷酸酰基轉移酶基因（GPAT1、GPAT2）轉入野生型萊茵衣藻體內，發現當GPAT1、GPAT2基因表達量分別提高2.4和1.4倍后，TAG產量分別提高了40%和34%。本研究中FAD2與gpat在兼養過程中表達增加，兩個基因在各個濃度梯度下表達量整體高于對照組，說明葡萄糖酸鈉作為碳源可以通過促進FAD2與gpat基因的表達，進而促進中心脂肪酸含量的積累。

4 結論

研究表明，葡萄糖酸鈉能提高三角褐指藻細胞密度，葡萄糖酸鈉濃度為200 mmol·L-1時效果最好。葡萄糖酸鈉處理以后，在低中濃度（10～200 mmol·L-1）條件下三角褐指藻比生長速率在第3 天時達到最大，然后迅速降低，高濃度（400～600 mmol·L-1）葡萄糖酸鈉可以使三角褐指藻保持相對穩定的比生長速率。葡萄糖酸鈉可以在低中濃度下能提高三角褐指藻葉綠素a含量和巖藻黃素產量，高濃度條件下反之。三角褐指藻中性脂肪酸含量隨葡萄糖酸鈉濃度提高而增加。qRT-PCR 結果表明，葡萄糖酸鈉通過促進lcyb、pds、FAD2和gpat基因的表達來提高三角褐指藻巖藻黃素含量和中性脂肪酸含量。