多組學分析射頻熱風聯合干燥對浙貝母代謝物的影響

朱 麟 凌建剛 趙 偉

（1寧波市農業科學研究院農產品加工研究所/國家蔬菜加工技術研發專業中心，浙江 寧波 315100；2江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

浙貝母（Fritillaria thunbergiiMiq.）系百合科、貝母屬中一種多年生草本植物，其鱗莖中富含貝母素甲、貝母素乙等數十種生物堿類功能成分，具有清熱潤肺、化痰止咳、抗炎抑菌、抗癌抗腫瘤等功效［1］，被列為“浙八味”之一，是潤肺止咳含片、止咳糖漿等眾多藥品、保健品的加工基料［2］。

干燥為浙貝母初加工的關鍵步驟，是其品質形成的重要環節［3］。浙貝母的干燥方法主要有自然晾曬、熱風（hot air，HA）干燥等，存在效率不高、品質下降快、品控難等問題［4］。為提升浙貝母干燥品質，學界開展了諸多技術嘗試，如紫外烘曬［5］、真空冷凍干燥［6］、微波干燥［3］等，這些方法在提高干燥效率或提高干燥品質等方面具有較好的效果，但仍難以滿足產業對既高效又高質干燥方法的需求。射頻熱風聯合（radio frequency combined hot air，RF-HA）干燥是近年來新興的一種干燥方式，結合了射頻電磁波（3 kHz～300 MHz）加熱的快速和高穿透性，與熱風干燥聯合使用均勻性好、干燥效率高、干燥品質好，且兼具殺菌、滅蟲等優點，在糧食［7-8］、堅果［9-10］等農產品干燥領域已有應用，但在浙貝母等中草藥干燥上的研究鮮見報道。

前期對于浙貝母干燥過程中的品質變化研究，多集中在已知的營養素和功能物質成分分析［11-12］，而對于其整體代謝物的研究較少。代謝組學分析主要依托高通量篩選技術，結合化學計量學的方法，可定量和定性分析生物體系內大量小分子（相對分子質量≤1 000）代謝物，是分析生物組分及生物間生理差異的重要手段［13-14］。但單一代謝組學存在局限性，如非靶向代謝組學雖可同時分析所有小分子代謝物，但只能獲得代謝物相對定量的結果；而靶向代謝靈敏度高，可以絕對定量，得到樣本中代謝物的濃度。因此，結合兩種或兩種以上組學的多組學研究在揭示生物體內復雜生化方面的作用突出，受到學界廣泛關注［15］。

鑒于此，本研究以新鮮浙貝母和HA干燥浙貝母為對照，分別采用超高液相色譜-質譜（ultra performance liquid chromatography mass spectrometry，UPLC-MS）和超高液相色譜-串聯質譜（ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技術，結合非靶向和生物堿靶向兩種代謝組學，分析RFHA干燥對浙貝母品質的影響，以期為浙貝母干燥工藝提升及RF-HA技術應用提供實踐參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮浙貝母（浙貝3號）于2022年5月采購于浙江省寧波市海曙區章水鎮；甲醇、乙腈（均為色譜純），美國Merck 公司；甲酸（色譜純）、2-氯-L-苯丙氨酸（98%），阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

HGJL-5RFS 食品射頻加工裝備，合肥哈工金浪裝備科技有限公司；101-2S 恒溫鼓風干燥箱，上海力辰儀器科技有限公司；ExionLC? AD 超高效液相色譜儀、Applied Biosystems 4500 QTRAP 型串聯質譜，美國SCIEX 公司；Vanquish U3000 液相色譜儀（使用Thermo Vanquish超高效液相系統）、Q-Exactive 120質譜儀（配備Thermo Orbitrap Exploris 120 質譜檢測器）、電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），美國賽默飛世爾科技公司；Scientz-100F 凍干機，寧波新芝生物科技股份有限公司；5305 真空濃縮儀，德國艾本德股份公司；MTV-100 多管漩渦混勻儀，杭州奧盛儀器有限公司；MB-96S 高通量組織研磨器，浙江美壁儀器有限公司；0.22 μm 聚四氟乙烯防水透氣濾膜，天津津騰實驗設備有限公司；SB-C18 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），美國Agilent 公司；ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm），美國Waters公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗處理 將新鮮采收的浙貝母清洗后，陰干表面水分（約12 h），用切片機切成3 mm 厚的薄片，將其平鋪于淺邊鏤空塑料筐中（單層，每筐約1.0 kg），留少量新鮮對照樣品（Fresh）；之后將分裝好的浙貝母帶筐放入烘干設備中，分別采用HA 和RF-HA 干燥將樣品水分含量降至12.5%～13.0%，其中HA 干燥溫度為55 ℃，干燥時間7.5 h；射頻參數為：板極間距8 cm、功率6 kW、熱風溫度55 ℃，干燥時間4.8 h。將3 組樣品立即用液氮凍樣，貯藏于-80 ℃冰箱速凍，待測。

1.3.2 檢測樣品前處理 從-80 ℃冰箱取出試驗樣品，采用凍干機真空冷凍干燥（冷阱溫度-50 ℃，64 h）；再利用研磨儀研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末狀；稱取50 mg 樣本粉末，加入1 200 μL 在-20 ℃條件下預冷的70%甲醇水內標提取液，每30 min 渦旋1 次，每次持續30 s，共渦旋6 次；離心（12 000 r·min-1，3 min）后，吸取上清液，經微孔濾膜過濾后，保存于進樣瓶中，備用。

1.3.3 色譜、質譜采集條件

1.3.3.1 非靶代謝分析條件 液相條件：使用T3 色譜柱，進樣量2 μL，0.25 mL·min-1流速，40 ℃柱溫；乙腈（添加0.1%甲酸）為A 相，超純水（添加0.1%甲酸）為B相；洗脫梯度：B相比例，0 min為2%，9 min內線性增加到50%，12 min 內線性增加到98%，并維持1.5 min；在13.5～14 min，降低至2%，并平衡至20 min。

質譜條件：ESI 正、負離子噴霧電壓分別為3.50、-2.50 kV，鞘氣壓力30 arb，輔助壓力10 arb，毛細管溫度325 ℃；一級全掃描分辨率60 000，一級離子掃描范圍質荷比（m/z）100～1 000，二級分辨率15 000。

1.3.3.2 生物堿靶向代謝分析采集條件 液相條件：使用SB-C18 色譜柱，流速0.35 mL·min-1，柱溫40 ℃，進樣量4 μL；超純水（加入0.1%的甲酸）為A 相，乙腈（加入0.1%的甲酸）為B相；洗脫梯度：B相比例，0 min為5%，9.00 min 內線性增加到95%，并維持1 min，10.00～11.10 min線性降至5%，并平衡至14 min。

質譜條件：參照羅利利等［13］的方法，其中ESI溫度550 ℃；離子噴霧正負電壓分別為5 500、-4 500 V；離子源氣體Ⅰ，氣體Ⅱ和氣簾氣分別設置為50、60和25 psi。

1.4 數據分析及處理

質譜數據采用Analyst 1.6.3 軟件處理；數據歸一化（unit variance scaling，UV）處理、主成分分析（principal component analysis，PCA）以及正交-偏最小二乘判別分析（orthogonal projections to latent structures discriminant analysis，OPLS-DA）采用R 3.6.3 軟件的內置prcomp 函數統計；聚類分析等熱圖通過R 軟件Complex Heatmap 包繪制；生物堿含量變化柱形圖采用Origin 2018軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 PCA及OPLS-DA分析結果

采用PCA 對3 種處理（Fresh、HA、RF-HA）浙貝母進行差異分析，結果見圖1。3組樣品在PCA 圖上的相對坐標點分離明顯、無交叉重疊，說明3 個處理組的代謝物間差異顯著（P＜0.05），且RF-HA 組相較于HA 組離Fresh 組更近，說明RF-HA 對浙貝母干燥代謝物成分的影響更小。

圖1 不同處理浙貝母樣本PCA模型得分Fig.1 PCA score plot of Fritillaria thunbergii Miq.with different treatments

OPLS-DA 是一種有監督模型識別功能的分析方法［13］，通過對主成分（principal component，PC）適當旋轉，并去除不變量的影響，實現不同組間差異代謝物的篩選。圖2 為不同處理浙貝母的OPLS-DA 得分，進一步看出各處理樣品間分離程度大，差異顯著（P＜0.05）。對該模型進行樣本置換檢驗，R2Y=0.998，對模型預測能力Q2=0.95，且在置換檢驗圖（圖3）中，隨著置換保留度值的上升，R2和Q2值增加，回歸線呈上升趨勢，所有Q2點均低于R2點，Q2點的回歸線與縱坐標交叉點小于0，均說明置換檢驗過關，模型具有很好的穩定性和預測性。

圖2 不同處理浙貝母樣本OPLS-DA模型得分Fig.2 OPLS-DA score plot of Fritillaria thunbergii Miq.with different treatments

2.2 差異代謝物分析結果

通過UPLC-MS 平臺對樣品的初生和次生代謝物進行鑒定。一共鑒定出483 種差異代謝物，主要包括氨基酸及其衍生物（61 種）、羧酸及其衍生物（83 種）、脂肪酰基類化合物（51種）、有機氧及氮化合物（45種）、類固醇及其衍生物（20種）、核苷酸及其衍生物（19種）、黃酮及異黃酮類（15 種）以及生物堿、吡啶、吡咯啉、喹啉等類物質。為更清楚地了解不同處理對浙貝母中代謝物變化規律的影響，依據各差異代謝物相對含量作差異代謝物層次聚類熱圖，結果見圖4。代謝物可以聚類為兩大簇，第一簇物質在新鮮狀態時含量較高，在經過兩種干燥處理時，其含量下降；第二簇物質隨著干燥的進行含量上升；RF-HA 組和HA 組總體變化趨勢類似，但RF-HA 在第一簇物質含量下降及第二簇物質含量上升等方面的變化程度明顯弱于HA組。

圖4 不同處理浙貝母差異代謝物層次聚類熱圖Fig.4 Hierarchical clustering heat map of Fritillaria thunbergii Miq.with different treatments

根據統計檢驗計算P值，采用OPLS-DA 降維法計算變量投影重要度（variable importance in projection，VIP），計算組間差異倍數，衡量各代謝物組分含量對樣本分類判別的影響強度和解釋能力，輔助標志代謝物的篩選［16］。當P＜0.05和VIP＞1時，認為代謝物分子具有統計學意義。經鑒定，各組處理浙貝母差異代謝物統計情況見圖5，其中RF-HA與Fresh總共差異代謝物為221種（105種上調，116種下調），Fresh 與HA 總共差異代謝物為246 種（141 種上調，105 種下調），RF-HA 與HA總共差異代謝物為168種（122種上調，46種下調）。可見，RF-HA 與HA 處理間存在顯著代謝物差異，RFHA相對于HA，代謝物上調更多，相對更接近新鮮樣品。

圖5 不同處理浙貝母樣本差異代謝物統計Fig.5 Statistical chart of differential metabolites of Fritillaria thunbergii Miq.with different treatments

取RF-HA與HA組、Fresh與RF-HA組、Fresh與HA組以及Fresh、RF-HA、HA三組間的代謝差異物，繪制韋恩圖。由圖6 可知，不同處理間差異代謝物組成的相似性和重疊情況，其中有70個差異代謝物為三組處理共有，說明處理間代謝差異較大，與PCA分析結果一致。

圖6 不同處理浙貝母樣本差異代謝物韋恩圖Fig.6 Venn diagram of differential metabolites of Fritillaria thunbergii Miq.with different treatments

2.3 不同處理對浙貝母生物堿類成分的影響

浙貝母的主要活性成分是生物堿［1］。通過UPLCMS/MS平臺靶向代謝組技術對樣品生物堿類初生和次生代謝物進行鑒定，一共鑒定出64 種顯著差異代謝物（P＜0.05），其成分及不同處理對其MS 強度影響見表1。可以看出，RF-HA 和HA 兩種干燥方式對浙貝母生物堿成分均具有較大影響，其中貝母素甲、貝母素乙、貝母素辛等40類物質含量下降，蕨內酰胺、藜蘆堿等15 種物質含量升高；RF-HA 和HA 處理之間也存在較大差異，RH-HA組總體上更接近Fresh組，表現為貝母素甲、貝母素乙、鄂貝啶堿、西貝母堿苷等多數物質含量變化更小。

表1 不同處理對浙貝母生物堿類成分的影響Table 1 Effects of alkaloids changes of Fritillaria thunbergii Miq.with different treatments

圖7 為不同處理下浙貝母中貝母素甲、貝母素乙、貝母素甲氮氧化合物、貝母素乙氮氧化合物4種主要功能物質［17］MS強度變化趨勢。4種生物堿含量在RF-HA和HA 干燥后均呈現降低趨勢，其值分別從1.10×106、3.57×106、1.71×106、8.83×106下降至8.41×105、1.80×106、1.23×106、4.52×106和6.01×105、1.48×106、9.65×105、2.65×106，相對于HA干燥，RF-HA處理可以顯著減少4種活性成分MS強度的下降（P＜0.05），使其相比于Fresh MS強度，降幅分別減少21.77、15.58、8.91、21.12個百分點，對于浙貝母品質保持具有積極效果。

圖7 不同處理對浙貝母中代表性生物堿類物質含量的影響Fig.7 Effects of different treatments on representative alkaloid content of Fritillaria thunbergii Miq.

3 討論

浙貝母等植物源類中草藥產品，采后貯藏易發生霉爛、蟲蛀及品質劣變等，干燥是保持其商品性及藥效的重要環節，但傳統曬干、熱風干燥等方法普遍存在品質下降、藥效損失嚴重等［18］問題。本研究采用射頻熱風聯合干燥處理浙貝母，并結合非靶和生物堿靶向代謝組學技術分析其代謝物的變化規律，結果表明，相對于HA，RF-HA干燥可以更好地減少代謝物變化，貝母素甲、貝母素乙、貝母素甲氮氧化合物、貝母素乙氮氧化合物等生物堿類活性物質降低更少，對于其品質保持具有積極效果，這與該聯合干燥技術在糧食［7-8］、堅果［9-10］、水產品［19］等農產品干燥方面的積極效果相一致。其作用機制，可能是射頻主要依靠電磁波驅動物料中的帶電離子持續振蕩產生熱量［20］，熱量由內到外擴散，縮短了熱傳導的過程，升溫迅速［21］，也加速水分向外擴散［22］，同時，射頻輔助熱風干燥可以克服射頻加熱不均勻等局限［23］，減少了干燥對物料品質及代謝物的影響。

浙貝母中含有豐富的黃酮、皂苷、多糖等物質成分［24］，但現有研究表明，其鎮咳祛痰、鎮痛抗菌、抗腫瘤等功效主要由生物堿類物質決定［25］，《中華人民共和國藥典（一部）》［17］也規定，浙貝母品質控制項目為貝母素甲和貝母素乙等生物堿類物質成分含量。因此，本研究重點關注不同干燥處理下生物堿類物質含量的變化趨勢。通過試驗共鑒定出64 種生物堿類差異代謝物，在不同干燥過程中，其含量變化趨勢不一，其中貝母素甲、貝母素乙等多數代謝物MS 強度呈現下降趨勢，與前期報道結論一致［26］；但也存在蕨內酰胺、藜蘆堿等15 種物質含量升高的情況，這可能是由不同生物堿間發生水解、氧化等反應導致的成分轉化所致［27］。

相對于HA，RF-HA 組生物堿類代謝物總體上更接近Fresh，但藜蘆定堿、貝母辛堿、黃金素A、葫蘆巴堿等成分卻呈現相反的變化趨勢，這可能是其自身結構或對于射頻電磁波的反應機制不同造成的，因為射頻干燥存在非熱作用機制［28-29］，但該觀點存在爭議［30］，需要后續研究深入探索。

綜合來看，RF-HA干燥會使新鮮浙貝母52.49%的差異代謝物下調表達，低于HA 處理57.32%的下調比例，該比例與當歸［31］等藥材下調比例較接近。而李澤娜等［32］在與分析杜仲干燥代謝物變化時，發現相對于新鮮杜仲，超過80%的代謝物表達上調，說明不同中藥材成分不同，干燥過程中代謝物變化存在較大差異，這是由于干燥過程中各類生理物質發生了酶水解、氧化、裂解［33］、次生代謝［34］等一系列復雜變化。因此，對于不同物料的干燥研究，要根據其自身特點制訂工藝。

4 結論

本研究通過非靶向代謝組學和生物堿靶向代謝組學聯合分析的方法，比較了RF-HA、HA 干燥對浙貝母代謝物及生物堿類物質變化的影響。結果表明，相對于HA，RF-HA干燥可以顯著減少浙貝母干燥過程中的代謝物變化（P＜0.05），顯著減少貝母素甲、貝母素乙、貝母素甲氮氧化合物、貝母素乙氮氧化合物等活性成分含量下降（P＜0.05），可以更好地維持其特有品質。