同位素稀釋-液相色譜-串聯質譜法測定蜂蜜中的葫蘆巴堿

李文麗 侯小超 孫會媛 黃學者 李 巖， 崔宗巖， 張進杰

（1燕山大學環境與化學工程學院，河北 秦皇島 066004；2秦皇島海關技術中心，河北 秦皇島 066004）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經充分釀造而成的天然甜味物質［1］。蜂蜜的種類繁多，受植物的來源和地域影響，其在成分、色澤、口感等方面都會有一定的差異，進而影響蜂蜜的品質和價格［2］。近年來，一些不法商家為了獲得更高的利潤，將低價蜂蜜摻入高價蜂蜜中進行售賣，嚴重損害了消費者的利益。油菜蜜作為我國年產量最大、最穩定的單花種蜂蜜［3］，成為了不法商家摻雜的首選，如將其摻入洋槐蜜、椴樹蜜等蜂蜜中出售［4］。目前，國內外常用的單花種蜂蜜的鑒別技術有花粉檢驗法［5］、DNA 標記物檢驗法［6-7］和化學標記物檢驗法［8-9］等。研究發現，油菜蜜中丁香酸甲酯含量遠高于其他蜜種［10］，可以作為油菜蜜鑒別的特征標記物。然而，有文獻報道麥盧卡蜂蜜中丁香酸甲酯含量也較高［11-12］，單獨采用丁香酸甲酯這一指標無法區分油菜蜜和麥盧卡蜂蜜。因此，亟需進一步發掘油菜蜜的特征化學成分，以實現油菜蜜的快速和準確鑒別。

葫蘆巴堿（trigonelline）是從豆科植物葫蘆巴的干燥種子中分離的一種具有生物活性的生物堿［13］，是一種天然的含氮有機物。秦皇島海關技術中心蜂產品檢測技術研發團隊研究發現，葫蘆巴堿在油菜蜜中的含量遠高于其他蜜種，可作為一種新的特征標志物用于油菜蜜的鑒別［14］。目前，葫蘆巴堿的測定方法主要有薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）［15］、高效液相色譜法（high-pressure liquid chromatography，HPLC）［16-17］、高效液相色譜-串聯質譜法（high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）［18-19］、毛細管電泳法（capillary electrophoresis，CE）［20］和核磁共振波譜法（nuclear magnetic resonance，NMR）［21-22］等。其中，高效液相色譜法是最常用的檢測方法，具有分離效率較高、操作簡單，適合大批量樣品檢測的優點。HPLC-MS/MS采用多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式進行測定，可以有效降低背景噪音，提高了目標物檢測的靈敏度和特異性。本研究團隊前期對蜂蜜樣品進行溶解稀釋后直接進行HPLC-MS/MS 檢測［14］，實現了蜂蜜中葫蘆巴堿的快速測定，但該研究由于沒有進行凈化操作，導致儀器容易受到污染，且高倍數稀釋降低了方法的靈敏度。因此，亟需建立一種蜂蜜中葫蘆巴堿檢測的新方法，以降低儀器損耗，提高方法靈敏度和準確度。

本研究采用固相萃取技術對蜂蜜中葫蘆巴堿進行富集和凈化，通過優化HPLC-MS/MS試驗條件，采用同位素內標法進行定量，以期實現蜂蜜中葫蘆巴堿的高靈敏和高準確度檢測，為油菜蜜鑒別提供新的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

研究所需油菜蜜、洋槐蜜、棗花蜜、椴樹蜜、荊條蜜、咖啡蜜和百花蜜等蜂蜜樣品均于2018—2021 年采集自我國云南、安徽、河北、吉林、新疆等地蜂場。

葫蘆巴堿（trigonelline，CAS號：535-83-1，上海源葉生物科技有限公司，純度≥99%）；葫蘆巴堿-d3（trigonellined3，上海甄準生物科技有限公司，純度≥98%）；甲醇、甲酸、乙酸銨均為色譜純［默克化工技術（上海）有限公司］，乙腈為色譜純（北京迪馬科技有限公司）。

分別稱取適量上述標準物質，用甲醇配制成濃度為1 mg·mL-1的標準儲備液，置于冰箱2～8 ℃條件下避光保存。用80%甲醇逐級稀釋成濃度為1 μg·mL-1的標準溶液待用。

1.2 主要儀器與設備

Acquity-Quattro Premier XE高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀，配有Masslynx 4.0數據處理軟件（美國Waters公司）；ACQUITY UPLC BEH HILIC（親水作用色譜，Hydrophilic interaction chromatography）色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美國Waters公司）；Milli-Q超純水制備儀（美國Merck Millipore公司）；TURBOVAPLV氮氣旋流濃縮儀、VOATEX-2渦旋混勻儀器（瑞典Biotage公司）；Oasia MCX固相萃取柱（60 mg，3 mL，美國Waters公司）。

1.3 樣品前處理

稱取試樣2.0 g（精確到0.01 g）置于燒杯中，加入20 mL 0.1%甲酸水溶液充分溶解，轉移至50 mL 容量瓶中，用0.1%甲酸水溶液定容，混勻后備用。對咖啡蜜和油菜蜜樣品，取上述溶液1 mL于10 mL容量瓶中，用0.1%甲酸水溶液稀釋、定容和混勻后備用。取上述備用液1.0 mL 加入100 μL 內標溶液（1 μg·mL-1）混勻后進行固相萃取凈化。

混合型陽離子交換固相萃取柱（mixed-mode cation exchanger spe column，MCX）依次用3 mL甲醇、3 mL水活化。將添加了內標物的樣品溶液上樣至小柱，分別用3 mL 水、3 mL 甲醇溶液淋洗，抽干。然后加入3 mL 2%氨水甲醇溶液對目標物進行洗脫，洗脫液在50 ℃條件下用氮氣吹干。殘渣中加入1 mL 80%甲醇水溶液，渦旋混合溶解，用0.22 μm 微孔濾膜過濾后，供HPLC-MS/MS測定。

1.4 儀器條件

色譜條件：ACQUITY UPLC BEH HILIC 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相A： 乙腈，流動相B： 5 mmol·L-1乙酸銨水溶液；流速0.3 mL·min-1；柱溫40 ℃；進樣體積2.0 μL；梯度洗脫條件：0.0～0.5 min，10% B；0.5～1.5 min，10%～50% B；1.5～3.5 min，50%B；3.5～4.0 min，50%～10% B；4.0～6.0 min，10% B。

質譜條件：離子源：電噴霧離子（electric spray ion，ESI）源；掃描模式：正離子模式；檢測方式：多反應監測（MRM）；電噴霧電壓：+3 kV；離子源溫度：120 ℃。葫蘆巴堿及葫蘆巴堿-d3的MRM參數見表1。

表1 葫蘆巴堿及葫蘆巴堿-d3的MRM參數Table 1 MRM parameters of trigonelline and trigonelline-d3

2 結果與分析

2.1 儀器條件的選擇和優化

2.1.1 色譜條件的選擇和優化 HILIC是以硅膠或衍生硅膠等極性填料作為固定相，高比例有機溶劑和低比例水溶液為流動相的色譜模式［23］，對強極性化合物具有良好的保留效果。葫蘆巴堿分子中同時存在正負電荷基團，極性較強，在HILIC 色譜柱上的峰形尖銳，分離效果良好［24］，故本研究以此作為分析柱，進一步優化了流動相條件。

HPLC 分析中常用的有機相為甲醇或乙腈，本研究分別以甲醇和乙腈作為有機相，同時對不同水相（5 mmol·L-1乙酸銨溶液、0.1%甲酸水溶液）的色譜分離效果進行考察。結果表明，采用甲醇作為有機相時，目標物均峰形展寬，拖尾嚴重（圖1-A、B）。而當乙腈作為有機相，目標物的峰形和靈敏度均較好。進一步對比發現，水相為5 mmol·L-1乙酸銨溶液（圖1-C）時，目標物響應明顯高于0.1%甲酸水溶液（圖1-D），故本研究采用乙腈-5 mmol·L-1乙酸銨溶液作為流動相。

圖1 不同流動相條件下葫蘆巴堿（1 μg·mL-1）的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of Trigonelline （1 μg·mL-1） under different mobile phase conditions

2.1.2 質譜條件的選擇和優化 配制500 ng·mL-1葫蘆巴堿和100 ng·mL-1葫蘆巴堿-d3 標準溶液，采用針泵直接進樣，以10 μL·min-1流速分別注入離子源，用正離子模式進行一級質譜掃描得到葫蘆巴堿和葫蘆巴堿-d3 的母離子；再進行二級質譜掃描，選擇質荷比（m/z）較大、強度較高且穩定的離子作為子離子，并對錐孔電壓和碰撞能量進行優化。最終2 種物質的質譜優化參數見表1，各目標物的MRM色譜圖見圖2。

圖2 葫蘆巴堿（500 ng·mL-1）和葫蘆巴堿-d3（100 ng·mL-1）的MRM色譜圖Fig.2 MRM Chromatograms of Trigonelline （500 ng·mL-1） and Trigonelline-d3 （100 ng·mL-1）

2.2 樣品前處理優化

2.2.1 固相萃取柱的選擇 MCX 是將磺酸基鍵合在高度交聯的聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物（polystyrene/divinylbenzene，PS/DVB）表面得到的混合型強陽離子交換吸附劑，具有反相和陽離子交換雙重保留性能，對堿性化合物具有良好的保留能力［25］。葫蘆巴堿是一種生物堿，因此本研究選用MCX固相萃取柱。

2.2.2 提取溶劑的優化 本研究選取某油菜蜜作為代表性樣品進行前處理條件優化。基于MCX 柱吸附生物堿的機理，一般采用酸性上樣、堿性洗脫的模式，因而提取液的酸度可能影響葫蘆巴堿在MCX 柱上的吸附。研究考察了不同體積分數的甲酸水溶液對目標物萃取的影響，結果見圖3-A。

圖3 不同提取或洗脫條件下目標物的響應Fig.3 Intensity of the target substance under different extraction or elution conditions

由于蜂蜜水溶液本身的酸性特征，不加甲酸即可實現目標物在MCX 固相萃取柱上的良好吸附，加入0.1%、0.5%和1.0%的甲酸，目標物響應無明顯差異，而甲酸濃度為1.0%時其重復性稍差。考慮到加入一定量甲酸有利于提取體系穩定，可以適用于不同酸度的蜂蜜樣品，試驗選擇0.1%的甲酸水溶液作為提取溶劑。

2.2.3 淋洗條件的優化 固相萃取（solid-phase extraction，SPE）過程中采用合適的溶劑淋洗固相萃取柱可以去除干擾物質，試驗研究了不同體積的水和甲醇淋洗條件對目標物的影響，測試結果表明，用3 mL水和3 mL 甲醇淋洗時，目標物不會被淋洗下來，而蜂蜜中的糖分等干擾物質可以被有效去除，因而試驗選用淋洗條件為3 mL水和3 mL甲醇。

2.2.4 洗脫條件的優化 氨水甲醇是MCX 固相萃取柱的常用洗脫試劑，本研究評估了不同濃度（0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%）的氨水甲醇溶液對蜂蜜中葫蘆巴堿的洗脫效果。結果表明（圖3-B），氨水甲醇濃度由0.1%增加到1.0%時，目標物的洗脫效率明顯增加，為1.0%～5.0%，隨著氨水濃度的增加，目標物響應基本一致，本研究選擇穩定的中間點，即2%氨水甲醇（V/V）作為洗脫溶劑。

在此基礎上，進一步考察了洗脫溶劑用量對目標物洗脫效率的影響。結果表明，3 mL 的洗脫溶劑即可使得目標物完全洗脫，因此，本研究選擇3 mL 為洗脫溶劑用量。

2.3 定量方法選擇

針對復雜樣品基質的檢測，HPLC-MS/MS 常存在基質效應，采用同位素內標法定量可降低或消除基質效應，提高方法的準確性和精密度［26］。本研究選用葫蘆巴堿-d3 作為同位素內標，其性質與目標物相似，在前處理過程中的損失和受基質影響程度相近，可以有效降低或消除基質效應，提高定量結果的準確性。

2.4 方法學評價

2.4.1 方法線性、檢出限和定量限 以80%甲醇-水溶液作為溶劑配制葫蘆巴堿濃度分別為10、20、50、100、200、500 ng·mL-1的系列標準工作液，同位素內標濃度為100 ng·mL-1，HPLC-MS/MS 進行測定，以目標物的質量濃度x為橫坐標，以標準品與同位素內標物峰面積比值y為縱坐標，繪制葫蘆巴堿的標準溶液工作曲線，得到化合物的線性范圍、線性方程以及相關系數。結果表明（表2），葫蘆巴堿的線性相關系數（R2）=0.999 9，儀器檢出限為3 ng·mL-1，定量限為10 ng·mL-1。按照稀釋倍數1∶25計算。方法定量限為0.25 mg·kg-1。由于油菜蜜和咖啡蜜中葫蘆巴堿含量較高，稀釋倍數為1∶250，對應的方法定量限為2.5 mg·kg-1。

表2 葫蘆巴堿的線性、檢出限和定量限Table 2 The linearity，detection limit and quantitation limit of trigonelline

2.4.2 回收率和精密度 采用添加回收試驗對方法的準確度進行考察，由于實際樣品中均檢出葫蘆巴堿，因此研究采用成分相近的果葡糖漿作為空白樣品進行低、中、高水平的加標回收試驗。此外，進一步選擇洋槐蜜、棗花蜜、椴樹蜜、荊條蜜、百花蜜、咖啡蜜、油菜蜜7個蜜種的樣品，根據其本底含量，進行適量濃度的添加試驗。

對空白樣品，在0.25、0.50 和2.50 mg·kg-13 個添加濃度下，每個濃度平行測定6 次，按上述方法進行前處理和儀器檢測，計算回收率與相對標準偏差。結果如表3 所示，方法的平均回收率為97.8%～101.8%，相對標準偏差（relative standard deviations，RSDs）范圍為0.5%～4.3%。

表3 空白樣品中葫蘆巴堿的添加回收率和精密度數據（n=6）Table 3 Recoveries and precisions of trigonelline in blank samples （n=6）

代表性樣品按照上述方法進行處理和測定，并依據其含量水平進行適量濃度添加，每個添加濃度平行測定4次，其回收率和相對標準偏差見表4。結果表明，實際樣品中葫蘆巴堿的平均回收率為87.3%～106.3%，RSD范圍為0.9%～6.7%。說明本方法的回收率和精密度良好，適用于蜂蜜中葫蘆巴堿的測定。

表4 代表性樣品中葫蘆巴堿的添加回收率和精密度數據（n=4）Table 4 Recoveries and precisions of trigonelline in representative samples （n=4）

2.5 實際樣品檢測

采用建立的方法對14種不同蜜源植物共274批樣品中的葫蘆巴堿進行測定，包括油菜蜜60 批、咖啡蜜8 批、洋槐蜜30 批、荊條蜜30 批、椴樹蜜30 批、荔枝蜜30批、棗花蜜30批、蕎麥蜜8批、百花蜜8批、葵花蜜8批、苕子蜜8 批、紫云英蜜8 批、橡膠蜜8 批、龍眼蜜8 批。結果表明，葫蘆巴堿在所有樣品中均有檢出，各蜜種樣品中葫蘆巴堿的含量見圖4，某代表性油菜蜜樣品中葫蘆巴堿和葫蘆巴堿-d3 的MRM 色譜圖見圖5。葫蘆巴堿在油菜蜜和咖啡蜜中的含量遠高于其他蜜種，平均含量分別為77.8 和55.5 mg·kg-1，最高含量為91.7和58.3 mg·kg-1；本研究咖啡蜜中葫蘆巴堿含量的檢測結果與Elisabetta 等［27］的結果基本一致。而葫蘆巴堿在洋槐蜜、荊條蜜、椴樹蜜、棗花蜜等12種蜂蜜樣品中的含量均低于10 mg·kg-1；因此依據葫蘆巴堿的含量可以區分油菜蜜或咖啡蜜與其他蜜種，但對于油菜蜜和咖啡蜜的進一步鑒別，還需要結合花粉分析或其他技術手段進行。

圖4 不同蜜種蜂蜜中葫蘆巴堿的含量Fig.4 Content of trigonelline in different types of honey sample

圖5 某油菜蜜樣品中葫蘆巴堿（100 ng·mL-1）和葫蘆巴堿-d3（100 ng·mL-1）的MRM色譜圖Fig.5 MRM chromatograms of trigonelline and trigonelline-d3 （100 ng·mL-1） in a rape honey sample

3 討論

目前，葫蘆巴堿含量的檢測主要集中在采用超聲波提取的苦蕎麥［28］、咖啡［29］及中草藥［30］等植物源樣品中，而蜂蜜中葫蘆巴堿的檢測研究僅有少量報道。Elisabetta 等［27］采用NMR 法測定了蜂蜜中的葫蘆巴堿含量，但該方法所用儀器昂貴，且靈敏度低于色譜質譜方法；Nguyen 等［31］選用毒性較強的氯仿提取越南咖啡蜜中的葫蘆巴堿，提取時間為12 h，前處理耗時較久。蜂蜜基質較為復雜，對蜂蜜中葫蘆巴堿的測定需要去除其中大量的糖類、有機酸、蛋白質等干擾物質。考慮到葫蘆巴堿是一種堿性化合物，已有文獻報道了采用陽離子交換（MCX）固相萃取技術測定蜂蜜中苦參堿類生物堿［32］和吡咯里西啶生物堿［33］。參考類似機理，本研究選用MCX 固相萃取技術，對前處理過程中提取溶劑、淋洗條件和洗脫條件進行了優化，試驗采用0.1%甲酸水溶液作為提取試劑，操作安全且整個前處理過程只需1.5 h即可完成，實現了蜂蜜中葫蘆巴堿含量的快速檢測。經MCX 柱固相萃取后，蜂蜜中葫蘆巴堿的平均回收率為87.3%～109.7%，因此，本研究采用固相萃取技術實現了蜂蜜中葫蘆巴堿的高效富集和有效凈化。

對于蜂蜜等復雜基質中目標物的LC-MS/MS 定量分析，采用同位素內標法可以有效提高定量結果的準確度［34］。本研究采用葫蘆巴堿-d3作為同位素內標對葫蘆巴堿進行定量，葫蘆巴堿-d3 與葫蘆巴堿結構相似，在色譜柱上的保留時間、峰形等都基本一致，質譜的碎裂途徑也基本一致。與先前建立的外標法［14］相比，本研究方法具有更高的靈敏度，定量限由之前的1.0 mg·kg-1降低至0.25 mg·kg-1，同時有效降低了基質效應的影響，提高了方法的準確度。

前言所述丁香酸甲酯作為鑒別油菜蜜的特征標志物有一定的不足之處，即無法有效區分油菜蜜與麥盧卡蜂蜜。而本研究建立的蜂蜜中葫蘆巴堿檢測方法可作為丁香酸甲酯的補充或替代方法，用來區分油菜蜜和其他蜜種。但該方法也有一定的局限性，即單獨采用葫蘆巴堿這一指標不能有效區分油菜蜜和咖啡蜜。而將二者結合應用，可有效地提高油菜蜜鑒別的準確性和可靠性。

4 結論

本研究采用固相萃取富集和凈化，結合高效液相色譜-串聯質譜技術，建立了蜂蜜中葫蘆巴堿的定性定量測定方法。試驗對固相萃取前處理條件進行了優化，結合同位素內標法對葫蘆巴堿進行準確定量，結果表明，在10～500 ng·mL-1范圍，葫蘆巴堿的含量與峰面積呈良好的線性關系，其平均回收率范圍為87.3%～106.3%，RSD不高于6.7%，方法定量限為0.25 mg·kg-1。該方法靈敏度高、準確度好，符合方法學要求，適用于蜂蜜中葫蘆巴堿含量的測定。本研究建立的分析方法和實際樣品檢測結果可以為油菜蜜的鑒別和品質評價、蜂蜜摻雜鑒別等提供技術和數據支撐。