一株分離自牦牛乳中的副干酪乳桿菌ZZ102對潰瘍性結腸炎的緩解作用研究

侯保秋，董怡文，劉方

（1.鄭州大學第五附屬醫院，鄭州 450052；2.西藏民族大學，陜西咸陽 712000）

0 引言

炎癥性腸病（IBD）是一種以非特異性為特征的慢性自身免疫性疾病[1]，主要包括克羅恩?。–D）和潰瘍性結腸炎(UC)[2-3]，其發病機制尚不清楚，臨床癥狀表現為持續性的腹瀉，腹部疼痛，發熱，嘔吐等[4-5]。IBD的發病率和流行范圍日益增加，我國是亞洲發病率最高的國家之一，已有超過150 萬的人群患有此病[6-7]。目前，有多種方法可應用于腸道炎癥的治療，其中常規藥物治療被廣泛應用，但長期服藥會給機體帶來不可避免的副作用[8]。因此，需尋求安全可靠且無副作用的治療方式來緩解腸道炎癥[9]。益生菌制劑輔助治療是一種安全可靠的方式，可以通過改善腸道屏障、調節機體免疫反應等方面緩解炎癥性腸病[10-12]，最常見的益生菌制劑有乳酸桿菌和雙歧桿菌[13-15]。Liu 等[16]使用植物乳桿菌23-1 對肥胖小鼠進行干預，結果表明干預后可有效緩解肥胖引起的氧化應激和炎癥反應。Kaur 等[17]評估了含有鼠李糖乳桿菌MTCC-5897 的乳清對DSS 誘導小鼠潰瘍性結腸炎的潛在保護作用，結果表明經乳清干預后，腸道中促炎因子水平顯著降低，抗炎因子水平顯著提高，推測其可以有效預防結腸炎誘導的炎癥。因此，本研究以副干酪乳桿菌L.paracasei ZZ102 為研究對象，通過灌胃不同劑量來探究對結腸炎小鼠腸道炎癥的緩解作用。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞及試驗小鼠

11 株菌株均為實驗室保藏的分離自牦牛乳中的乳酸桿菌，具體信息如表1 所示。所用細胞為Caco-2細胞（人克隆結腸癌細胞），購于中國科學院上海生命科學研究所。試驗動物為48 只雄性C57BL/6 小鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。

表1 試驗菌株相關信息

1.2 試劑

MRS 瓊脂培養基、MRS 肉湯培養基，青島高科技工業園海博生物技術有限公司；氯化鈉，天津市東麗區天大化學試劑廠；PBS 緩沖液，北京索來寶生物科技有限公司；胰酶，Hyclone 公司；DMEM 高糖培養液，吉諾生物醫藥技術有限公司；葡聚糖硫酸鈉，美國MP Biomedical 公司；美沙拉嗪，杭州巴洛特生物科技有限公司；MPO 檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；各細胞因子檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器與設備

電子天平，瑞士Mettler Toledo 有限公司；超凈工作臺，北京東聯哈爾儀器有限公司；CO2培養箱，上海力申科學儀器有限公司；酶標儀，美國Molecular Devices 公司；高速冷凍離心機，德國Sigma 有限公司；恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；Quick Drop 測定儀，美國Bio-rad 公司。

1.4 菌株的活化與保藏

取凍存管中的菌液，以5%的接種量于MRS 肉湯中，37 ℃培養18～24 h，獲得一代菌液。取一代菌液進行三區劃線，37 ℃培養48～72 h 后挑取單菌落至MRS 肉湯中繼續培養18～24 h。將最終菌液與80%（V/V）滅菌后的甘油以3∶1 的比例混勻，-80 ℃保藏備用。

1.5 乳酸菌的篩選

1.5.1 細胞的培養

將Caco-2 細胞從液氮中取出，迅速放置于37 ℃水浴鍋解凍，之后接種于DMEM 高糖培養液中，于CO2細胞培養箱中培養數日，次日更換細胞培養液，當有80%左右的細胞貼壁且鋪滿細胞培養瓶底部時即可進行傳代，傳至3 代平鋪于細胞培養瓶的單層細胞進行后續研究。

1.5.2 乳酸菌與細胞共培養

將菌液離心后收集菌體，然后重懸于DMEM 高糖培養液中。將細胞（每孔106個）接種于六孔板中，待細胞培養至極化狀態后，將重懸于DMEM 高糖培養液的乳酸菌與細胞共同培養2 h 后進行后續研究（細胞培養液需在乳酸菌加入前的24 h 更換為不含抗生素的培養基）。

1.5.3 黏附率測定

乳酸菌與細胞共培養后，用滅菌后的PBS 進行洗滌，并用胰酶消化收集的細胞，然后使用無菌生理鹽水稀釋到合適濃度后進行涂布，于37 ℃培養48 h 后進行菌落計數。黏附率公式如下：

黏附率=黏附后的菌落數/黏附前的菌落數×100

1.6 試驗動物分組

試驗動物選用6～8 周、雄性C57BL/6 小鼠，體重為（20±2）g，動物倫理審核編號KY2021004。48 只小鼠基礎飼料、飲用水喂養一周后被隨機分為6 組（n=8只/組）：Control（對照組）、DSS（DSS 組）、DSS+106L.paracasei ZZ102（低劑量組）、DSS+107L.paracasei ZZ102（中劑量組）、DSS+108L.paracasei ZZ102（高劑量組）以及DSS+美沙拉嗪（藥物組）。從第8 d 起直至結束，每天上午同一時間，低、中、高劑量組分別灌胃106、107和108CFU/mL 的L.paracasei ZZ102 菌懸液200 μL，藥物組小鼠灌胃10 mg/mL 的美沙拉嗪200 μL，其余兩組灌胃相同量的生理鹽水。從第15 天開始，除對照組飲用正常純凈水外，其他組小鼠的飲用水均加入3%（W/V）的DSS 溶液，構建結腸炎小鼠的模型。動物試驗的具體分組情況如表2 所示。

表2 動物試驗的基本情況

1.7 結腸炎的評估

1.7.1 體重

建模期間，每天稱量小鼠體質量并計算體質量下降率。具體計算方法如下：

體質量下降率=（W1-W2）/W1×100

W1：第14 d 的小鼠體質量（g），W2：15～21 d 的小鼠體質量（g）。

1.7.2 脾臟指數

脾臟指數的計算方法如下：

脾臟指數=脾臟質量/最終體質量×10

1.7.3 髓過氧化物酶（MPO）活性

小鼠處死后，收集全血，離心收集血清，于-20 ℃保存備用。取小鼠血清在4 ℃、3 000 r/min 離心20 min得到上清液。按照MPO 檢測試劑盒對各組血清MPO的活性進行測定。

1.7.4 結腸細胞因子

取小鼠結腸組織（30 mg 左右），剪碎后置于研缽中，以1∶9 的比例加入9 倍預冷的無菌PBS 溶液研磨成漿液后以3 000 r/min 離心20 min，收集上清于-20 ℃保存。按照試劑盒說明書進行細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 含量的測定。

1.8 統計分析

采用GraphPad Prism 8.02 軟件作圖并對數據進行統計學分析，試驗結果以平均值±標準差（Mean±SD）表示。所有試驗重復3 次

2 結果與分析

2.1 各菌株黏附能力的差異

乳酸菌與腸上皮細胞的特異性黏附能力的強弱是其發揮益生作用的關鍵[13]。各乳酸菌菌株與Caco-2細胞的黏附結果如圖1 所示。從圖1 可以看出，L.casei ZZ085、L.paracasei ZZ102 和L.plantarum ZZ112具有較高的黏附率，其中L.paracasei ZZ102 的黏附率最高，達到了78.39%。剩余菌株的黏附率在19.78%到68.49%之間不等，與L.paracasei ZZ102 相比具有統計學差異（P＜0.05）。因此，本研究選取L.paracasei ZZ102進行后續研究。

圖1 不同菌株的黏附率

2.2 L.paracasei ZZ102 對小鼠常規指標的影響

2.2.1 體重

小鼠的體質量變化情況如圖2 所示。由圖可以看出，造模期間Control 組小鼠體質量呈現輕微上升趨勢，而其他組小鼠體質量呈現不同程度的下降趨勢。在整個造模期間，DSS 組小鼠體質量與初始體重相比下降了17%，下降趨勢最大；其次為灌胃低、中劑量L.paracasei ZZ102 的小鼠，體質量分別下降了16.67%和15%。與DSS 組相比，灌胃高劑量L.paracasei ZZ102 和美沙拉嗪組的小鼠體質量下降明顯減少，分別下降了13.67%和10%，表明灌胃L.paracasei ZZ102 和美沙拉嗪可以緩解小鼠的體質量下降趨勢。

圖2 小鼠體質量變化

2.2.2 脾臟質量與脾臟指數

脾臟是機體最大的免疫器官，是免疫細胞居住和產生應答的重要產所[18-19]。從圖3 中可以看出，與Control組相比，其余5 組小鼠的脾臟質量和脾臟指數均有所增加，其中DSS 組增加最為明顯。灌胃低、中、高劑量的L.paracasei ZZ102 小鼠的脾臟質量和脾臟指數均有所下降，其中灌胃高劑量L.paracasei ZZ102 小鼠的脾臟質量和脾臟指數下降最為明顯，表明灌胃L.paracasei ZZ102 可以有效改善結腸炎小鼠的脾腫大，進一步調節機體的免疫功能。

圖3 小鼠脾臟質量與脾臟指數變化

2.2.3 血清MPO 活性

MPO 活性是衡量結腸炎炎癥程度的重要指標之一，與腸道炎癥呈正相關關系，同時還可進入到細胞外液參與循環[20]。通過灌胃不同劑量L.paracasei ZZ102 來探究小鼠血清MPO 活性的變化，結果如圖4 所示。由圖可以看出，與Control 組相比，DSS 組的MPO 活性顯著提高（P＜0.0001）。與DSS 組相比，低、中、高劑量組和藥物組MPO 活性均呈現顯著下降趨勢（P＜0.0001）。其中灌胃106、107、108L.paracasei ZZ102 組的MPO 活性分別為0.224 U/mL、0.208 U/mL、0.194 U/mL，隨著L.paracasei ZZ102 劑量的增加，MPO 的活性逐漸降低，因此MPO 活性變化對L.paracasei ZZ102 呈現出一定的劑量依賴性，表明灌胃L.paracasei ZZ102 可以在一定程度上顯著降低小鼠的炎癥水平。

圖4 MPO 活性變化

2.3 L.paracasei ZZ102 對小鼠炎癥因子質量濃度的影響

2.3.1 促炎因子

在正常情況下，腸道內的促炎細胞因子和抗炎細胞因子處于一個動態平衡狀態，但當腸道炎癥發生時，腸道內促炎因子數量表達過多，抗炎因子表達過少，腸道內的平衡狀態會被破壞[21-24]。乳酸菌可以通過調節機體免疫細胞因子的分泌來發揮其免疫作用[25]。其中促炎因子TNF-α、IL-6 和IL-1β是反應炎癥程度的常規指標[26-27]。促炎因子的結果如圖5(a)～5(c)所示，與Control 組相比，DSS 組小鼠的促炎因子TNFα、IL-1β和IL-6 均顯著升高，表明由DSS 誘導炎癥程度增加，進而誘導了多種促炎因子的分泌。與DSS組相比，灌胃低、中、高劑量L.paracasei ZZ102 以及美沙拉嗪干預的小鼠的TNF-α、IL-1β和IL-6 的含量均有不同程度的降低，表明灌胃L.paracasei ZZ102 以及藥物干預均可以對結腸炎有一定的緩解作用。對于低、中、高劑量組而言，其中灌胃高劑量L.paracasei ZZ102 的效果最好，因此，促炎因子的分泌量表現出一定的劑量依賴性。

2.3.2 抗炎因子

抗炎因子IL-10 的含量變化如圖5(d)所示，與Control 組比，DSS 組小鼠的IL-10 表達量輕微上升，但無統計學差異。與Control 以及DSS 組相比，灌胃106、107和108L.paracasei ZZ102 的小鼠IL-10 的分泌量均顯著上調，且呈現劑量依賴性，同時美沙拉嗪組IL-10 的分泌量也呈現上升的趨勢（P＜0.01）。因此結果表明本研究中灌胃L.paracasei ZZ102 后可以增加抗炎細胞因子IL-10 的分泌，達到緩解小鼠的腸道炎癥的作用。

3 結論

潰瘍性結腸炎是一種非特異性、反復發作的慢性疾病，近幾年來發病率呈逐年上升趨勢[28]，其發病機制受遺傳、免疫、飲食、環境等多種因素影響。目前對于結腸炎的治療主要集中在免疫抑制劑、氨基水楊酸制劑等領域[29]，但這些藥物價格昂貴且治療效果不佳，需尋求天然無明顯副作用的藥物來治療潰瘍性結腸炎。陳巖勤等[30]研究表明微生態制劑可以降低TNF-α、IL-6、IL-17A 分泌水平,提高IL-10 含量,并有助于維持腸黏膜上皮細胞的完整，保持腸黏膜屏障功能。

本研究將篩選出的黏附能力最強的菌株L.paracasei ZZ102 應用于由DSS 誘導的結腸炎小鼠模型，通過研究表明L.paracasei ZZ102 可以有效改善小鼠的體質量減小、脾臟指數升高、MPO 活性升高等情況。通過檢測結腸組織細胞因子表達水平發現，經不同劑量的L.paracasei ZZ102 灌胃后，促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6 的含量顯著降低，抗炎因子IL-10 的含量顯著升高，且與L.paracasei ZZ102 劑量呈現相關性。綜上所述，益生菌制劑可有效緩解小鼠的腸道炎癥，可為基于微生物法的靶向治療IBD 提供理論參考，同時也為臨床治療腸道炎癥提供依據。