轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析互花米草Spartina alterniflora的高鹽度抗性分子機(jī)制

王鵬娜，何英英，李文君，趙 陽，曲長鳳，繆錦來*

（1. 自然資源部 第一海洋研究所，山東 青島 266061；2. 青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 青島 266199）

互花米草（Spartina alternifolia）屬禾本科，鼠尾粟屬，二倍體、四倍體或十二倍體的多年生草本植物，原產(chǎn)于北美洲與南美洲的大西洋沿岸（Rolando et al, 2022）。發(fā)達(dá)的根系使得互花米草具有很強(qiáng)的生長繁殖能力與環(huán)境適應(yīng)能力，可在各種基質(zhì)上定居，使其在與其他植物在競(jìng)爭資源時(shí)占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。互花米草具有較強(qiáng)的連續(xù)擴(kuò)散的能力，Liu等利用Landsat-8 OLI圖像等技術(shù)推算出互花米草在1979年至2018年的平均擴(kuò)張速率約137 km2/10 a（Liu et al, 2018） 。1979年互花米草被引進(jìn)我國（王壽兵等, 2023），用于保灘護(hù)岸、促淤造陸（ 欽佩等, 2012; 楊東等, 2014），因效果良好，后續(xù)在山東、廣東、江蘇等地的沿海灘涂上進(jìn)行廣泛種植，并在我國海岸帶迅速擴(kuò)散（王智晨等, 2006; 沈鴻坤等, 2022），目前在我國的分布面積達(dá)545.80 km2，緯度范圍為39°13′～20°55′N。

互花米草的入侵與擴(kuò)散誘導(dǎo)濕地生態(tài)退化，影響濕地生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能（張雪, 2022; 宗影等, 2023）。互花米草能夠競(jìng)爭取代土著植物（如鹽地堿蓬、蘆葦和紅樹林等），入侵污染土著植物的基因（饒清華, 2020）；且易造成原生態(tài)環(huán)境生物生存空間變窄、群落結(jié)構(gòu)改變，如鳥類、魚類及底棲無脊椎動(dòng)物因食物來源和避難所發(fā)生改變而遷移；與灘涂養(yǎng)殖藻類爭奪營養(yǎng)導(dǎo)致藻類減產(chǎn)，養(yǎng)殖水產(chǎn)品被沖進(jìn)米草群落而無法逃生導(dǎo)致大量水產(chǎn)品減產(chǎn)，威脅海岸帶水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)；改變潮間帶地形并影響海水正常流動(dòng)，引起航道堵塞（王君, 2010）。總之，互花米草的擴(kuò)散造成一系列巨大的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)危害，因此2003年其被列入外來入侵物種（Jiang et al, 2022; Lin et al, 2022; Shen et al, 2022）。

互花米草入侵及擴(kuò)散能力與其繁殖方式和高抗鹽性等密切相關(guān)。其有性繁殖體為種子，無性繁殖體為根狀莖、分蘗形成的分株與折落的植株（Daehler et al, 1994）。研究表明，互花米草為適應(yīng)新的環(huán)境會(huì)選擇不同的繁殖方式（Winkler et al, 1999），傳播通常是人工種植后的無性繁殖，在潮間帶地區(qū)大多呈簇狀分布（Liu et al, 2018）。互花米草作為一種強(qiáng)泌鹽植物，鹽脅迫下能通過鹽腺結(jié)構(gòu)將組織中的鹽分排到莖葉等器官表面，因此互花米草對(duì)高鹽度有較強(qiáng)的耐受能力（適鹽范圍為0～3），同其他植物相比互花米草在鹽度較高的生境中競(jìng)爭優(yōu)勢(shì)明顯（何軍等, 2009; 陳綠青, 2013; 趙陽,2022），這種特性也為其適應(yīng)潮間帶環(huán)境提供了可能（Feng et al, 2017）。

目前，對(duì)互花米草的研究主要集中在生理特性和經(jīng)濟(jì)價(jià)值上，如互花米草對(duì)土壤的物理和化學(xué)性質(zhì)及生物群落的影響（布乃順等, 2017）、對(duì)金屬物質(zhì)的吸收（李佳枚等, 2011）、藻華抑制作用（Xu et al, 2019）等。但并未有研究闡明互花米草生物入侵分子機(jī)制與其高鹽度抗性之間的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，植物在鹽脅迫下，可以通過調(diào)節(jié)自身的基因表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)、能量代謝及蛋白質(zhì)合成等途徑，來緩解高鹽環(huán)境帶來的不利影響（喬慧萍等, 2007; Badar et al, 2021; Delgado et al, 2021）。因此，本文利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)，從分子生物學(xué)層面揭示互花米草在不同鹽度脅迫下的基因表達(dá)調(diào)控規(guī)律，深度挖掘其與高鹽度抗性相關(guān)的基因及代謝通路，探討其生物入侵分子機(jī)制與其高鹽度抗性之間分子響應(yīng)機(jī)制。以此為互花米草的入侵機(jī)制提供新的啟示，也為互花米草及其他入侵物種的防控手段提供重要的理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及采集

互花米草（Spartina alterniflora）幼苗（3～5葉期）取自青島濱海鹽沼濕地（120°19′00″E，36°15′48″N），樣本無病蟲害，長勢(shì)良好。取樣時(shí)間為2021年8月，取樣地的鹽度為10。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

將取樣的互花米草移栽到帶排水孔的塑料盆中，填充物為淤泥與砂的混合物，兩者比例為3∶1，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)兩周后進(jìn)行鹽度脅迫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。培養(yǎng)條件為16 h/8 h周期的光/暗交替，溫度為（24±2） ℃，相對(duì)空氣濕度60%。每盆種植3棵長勢(shì)一致的互花米草幼苗，每 3 d澆灌1次。

1.2.2 脅迫處理

將適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境且長勢(shì)較好的互花米草隨機(jī)分為3組（每組3個(gè)平行），設(shè)為對(duì)照組（Control Group，CG）（鹽度為10）、低鹽度組（Low Salinity Group，LG）（鹽度為24）和高鹽度組（High Salinity Group，HG）（鹽度為32）。用NaCl、純水和海水分別配制鹽度為10、24和32的水溶液，用以澆灌3組互花米草，脅迫處理12 h后，取下葉片放入液氮中速凍，并于?80 ℃冰箱保存。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法

將互花米草葉片樣本送至生工生物工程（上海）股份有限公司，采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并構(gòu)建其在正常生理?xiàng)l件和脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄組文庫。將測(cè)序所得的原始序列使用Fast QC軟件進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，使用Trimmomatic軟件進(jìn)行質(zhì)量剪切，使用Trinity軟件將樣本有效數(shù)據(jù)進(jìn)行混合拼接。采用NCBI Blast+工具將轉(zhuǎn)錄本與CDD、KOG、COG、NR、NT、PFAM、Swissprot和TrEMBL等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，得到其功能注釋信息。根據(jù)轉(zhuǎn)錄本與Swissprot、TrEMBL的注釋結(jié)果得到GO功能注釋信息，利用KAAS得到轉(zhuǎn)錄本KEGG注釋信息。根據(jù)轉(zhuǎn)錄本與數(shù)據(jù)庫Blast比對(duì)結(jié)果和TransDecoder進(jìn)行CDS（Coding Sequence）預(yù)測(cè)。以q＜0.05（q：多重檢驗(yàn)校正后的P）、|log2Fold Change|＞1為條件，使用DESeq2進(jìn)行Unigene表達(dá)差異分析，基于差異分析結(jié)果繪制熱圖。使用topGO軟件進(jìn)行GO富集分析，繪制顯著性GO有向無環(huán)圖。使用clusterProfiler進(jìn)行KEGG通路和KOG分類富集分析。基于基因功能富集分析結(jié)果繪制關(guān)聯(lián)分析網(wǎng)絡(luò)圖，查找差異表達(dá)Unigene參與的生化代謝途徑和信號(hào)傳導(dǎo)途徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 互花米草測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

對(duì)不同鹽度脅迫下的9個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果如表1所示。9組樣品分別獲得51852554、39508588、67375654、36726702、37468186、38988834、42742450、42941540、60585594條過濾序列，分別獲得7101166661、5649247965、9605379576、5256817516、5335440311、5562196605、6072862154、6134065719、8719915050 bp過濾堿基。各樣本GC含量為45.78%～54.20%，Q30堿基百分比在94.87%以上，表明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，可用于后續(xù)組裝分析。

表1 9個(gè)互花米草樣品的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果Table 1 Transcriptome sequencing results of 9 Spartina alterniflora samples

對(duì)測(cè)序所得序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本拼接，共獲得121760個(gè)Unigene，長度范圍為201～12705 bp，平均長度為633 bp，N50為1046 bp。具體長度分布情況見圖1。

圖1 Unigene長度分布Fig. 1 Distribution of unigene length

2.2 基因功能注釋

將所得的單Unigene序列與NR、NT、KEGG、PFAM等8個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，有63750個(gè)Unigene注釋到eggNOG數(shù)據(jù)庫，占Unigene總數(shù)的52.36%；58875個(gè)Unigene注釋到NR數(shù)據(jù)庫，占總數(shù)的48.35%。其中70455個(gè)Unigene在至少一個(gè)數(shù)據(jù)庫得到注釋，占總數(shù)的57.86%；1812個(gè)Unigene在8個(gè)數(shù)據(jù)庫均得到注釋，占總數(shù)1.5%。各數(shù)據(jù)庫Unigene注釋數(shù)量及比例如表2所示。

表2 Unigene注釋成功率統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistical result of unigene annotation

將獲得的Unigene在GO （Gene Ontology）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行注釋與分類（孫晶京, 2012），結(jié)果如圖2所示。Unigene共分為67個(gè)功能組，根據(jù)注釋功能的不同又可分為3大類：分子功能（Molecular Function）、生物過程（Biological Process）和細(xì)胞組分（Cellular Component）。其中分子功能共包含19個(gè)功能組，主要為黏合物（Binding）、催化活性（Catalytic Activity）和轉(zhuǎn)運(yùn)活性（Transporter Activity）；生物過程共包含26個(gè)功能組，主要為細(xì)胞過程（Cellular Process）、新陳代謝過程（Metabolic Process）和生物調(diào)節(jié)（Biological Regulation）；細(xì)胞組分共包含22個(gè)功能組，主要為細(xì)胞（Cell）、細(xì)胞組分（Cell Part）和細(xì)胞器（Organelle）。

圖2 Unigene的GO功能分類Fig. 2 GO functional classification of unigene

將獲得的Unigene在KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行注釋與分類（李向真等, 2012），結(jié)果如圖3所示。得到注釋的Unigene共劃分為5大類：細(xì)胞過程（Cellular Processes）、環(huán)境信息處理（Environmental Information Processing）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）、代謝（Metabolism）和機(jī)體系統(tǒng)（Organismal Systems）。細(xì)胞過程中注釋Unigene較多的是運(yùn)輸和分解代謝（Transport and Catabolism）、細(xì)胞生長與死亡（cell growth and death）；環(huán)境信息處理中注釋Unigene較多的是信號(hào)傳導(dǎo)（signal transduction）、膜轉(zhuǎn)運(yùn)（membrane transport）；遺傳信息處理中注釋Unigene較多的是翻譯（translation）、折疊分揀和降解（folding sorting and degradation）；代謝中注釋Unigene較多的是碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）、概述（overview）與氨基酸代謝（amino acid metabolism）；機(jī)體系統(tǒng)中注釋Unigene較多的是內(nèi)分泌系統(tǒng)（endocrine system）、免疫系統(tǒng)（immune system）。

圖3 Unigene的KEGG代謝通路分類Fig. 3 KEGG pathway classification of unigene

2.3 差異表達(dá)基因分析

將3組樣品兩兩比較進(jìn)行差異表達(dá)分析，以q＜0.05、|log2Fold Change|＞1為條件，篩選差異表達(dá)基因（Different Expression Genes，DEGs），繪制火山圖如圖4所示。共篩選到1190個(gè)DEGs，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示。 LG組與CG組中有411個(gè)DEGs，其中上調(diào)Unigene 169個(gè)，下調(diào)Unigene 242個(gè)；HG組與CG組中有56個(gè)DEGs，其中上調(diào)Unigene 9個(gè)，下調(diào)Unigene 47個(gè)；HG組與LG組中有723個(gè)DEGs，其中上調(diào)Unigene 319個(gè)，下調(diào)Unigene 404個(gè)。與互花米草耐鹽有關(guān)的上調(diào)表達(dá)Unigene有脯氨酸代謝相關(guān)基因（SaP5CS2）、穩(wěn)定Na+/K+比例的陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體基因（HKT7）、鈉/氫交換器基因（NHX2）、抗K+外流基因（K+efflux antiporter 5）、葉綠體中脂氧合酶基因（Lipoxygenase,LOX2）、光系統(tǒng)Ⅱ穩(wěn)定性基因（Photosystem II stability/assembly factor HCF136）、泛素連接酶E3基因（E3 ubiquitin-protein ligase）等。

圖4 樣品組間基因差異表達(dá)分析火山圖Fig. 4 Volcano plot of differentially expressed genes between the two groups

表3 樣品組間的差異表達(dá)基因數(shù)量Table 3 Number of differentially expressed gene between the two groups

2.4 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析

用GO seq軟件對(duì)三組樣本兩兩比較得到的差異表達(dá)Unigene分別進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果如表4所示。3組分別富集到2481、1146、2160個(gè)GO terms，分為分子功能、生物過程和細(xì)胞成分三部分，其中生物過程最多，分別占總數(shù)的74.32%、78.36%和70.93%。將GO富集分析的前10個(gè)結(jié)果作為主要節(jié)點(diǎn)，繪制有向無環(huán)圖（Directed Acyclic Graph，DAG）如圖S（附錄）所示。其中與互花米草高鹽度抗性相關(guān)的為GO: 0022857（跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)形成）、GO: 0098660（無機(jī)離子跨膜運(yùn)輸）、GO:0015318（無機(jī)陽離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性）、GO: 0098662（無機(jī)陽離子跨膜運(yùn)輸）、GO: 0015081（鈉離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)器活性）、GO: 0035725（鈉離子跨膜運(yùn)輸）、GO: 0015078（質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)器活性）、GO:0004129（細(xì)胞色素-C氧化酶活性）、GO: 003310（線粒體呼吸鏈復(fù)合體的組裝）、GO: 0017004（細(xì)胞色素復(fù)合體組裝）、GO: 0070469（呼吸鏈）、GO: 0098803（呼吸鏈復(fù)合體）、GO: 0017062（呼吸鏈復(fù)合體III的組裝）、GO: 0034551（線粒體呼吸鏈復(fù)合體III）、GO: 0045277（呼吸鏈復(fù)合體IV）、GO: 0016661（氧化還原酶活性，作用于其他含氮化合物作為供體）、GO: 0016705（氧化還原酶活性，作用于成對(duì)的供體，結(jié)合或還原分子氧）、GO: 0008940（硝酸還原酶活性）、GO: 0046857（氧化還原酶活性，作用于其他含氮化合物作為供體，NAD或NADP作為受體）、GO: 001670（氧化還原酶活性，作用于成對(duì)的供體，結(jié)合或還原分子氧，NADPH為供體，結(jié)合一個(gè)氧原子）、GO: 0009703（硝酸還原酶NADH活性）、GO: 0009507（葉綠體）、GO: 0034357（光合作用膜）、GO: 0042651（類囊體膜）、GO:0055035（質(zhì)體類囊體膜）、GO: 0009535（葉綠體類囊體膜）、GO: 0046906（四吡咯結(jié)合蛋白）和GO:0016168（葉綠素結(jié)合蛋白）。

表4 差異表達(dá)基因GO富集分析Table 4 GO enrichment analysis of differential expressed genes

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG通路富集分析

使用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)所有差異表達(dá)Unigene的代謝通路進(jìn)行富集分析，對(duì)每組前30個(gè)富集通路做散點(diǎn)圖，富集結(jié)果如圖5所示。在LGvsCG組中，差異表達(dá)Unigene富集到118條代謝通路中，其中顯著富集（P＜0.05）的KEGG通路有20條，顯著富集的通路有血小板激活（platelet activation）、黏著物（focal adhesion）、白細(xì)胞內(nèi)皮遷移（leukocyte transendothelial migration）等信號(hào)通路，主要與細(xì)胞過程有關(guān)；在HG組與CG組中，差異表達(dá)Unigene富集到14條代謝通路中，其中顯著富集（P＜0.05）的KEGG通路有13條，顯著富集的通路有光合作用-天線蛋白（photosynthesis-antenna proteins）、ECM-受體相互作用（ECM-receptor interaction）、黏著物（focal adhesion）等信號(hào)通路，最顯著富集的通路主要與耐鹽相關(guān)；在HG組與LG組中，差異表達(dá)Unigene富集到98條代謝通路中，其中顯著富集（P＜0.05）的KEGG通路有17條，顯著富集的通路有神經(jīng)營養(yǎng)因子信號(hào)通路（neurotrophin signaling pathway）、氰氨酸代謝（cyanoamino acid metabolism）、硫代葡萄糖苷生物合成（glucosinolate biosynthesis）等信號(hào)通路，顯著富集通路可提高互花米草的耐鹽性。

圖5 差異表達(dá)基因的KEGG功能富集Fig. 5 KEGG functional enrichment of differentially expressed genes

2.6 不同鹽度脅迫下功能-基因互作關(guān)系

在KEGG數(shù)據(jù)庫中利用獲得的DEGs進(jìn)行注釋與分類，挑選富集程度最高的前10個(gè)功能和與該功能相關(guān)的差異Unigene繪制不同鹽度脅迫下顯著富集功能-基因互作網(wǎng)絡(luò)圖（Damian et al, 2015; Finn et al, 2016），互作關(guān)系如圖6所示。其中，顯著富集到與互花米草抗逆有關(guān)的途徑有苯丙素代謝途徑（Phenylpropanoid Biosynthesis）、氧化磷酸化途徑（Oxidative Phosphorylation）（LG組與CG組）、氮代謝（Nitrogen Metabolism）、光合作用-天線蛋白（Photosynthesis-Antenna proteins）、ECM-受體相互作用（ECM-Receptor Interaction）、P13K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt Signaling Pathway）、氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation）等途徑（HG組與CG組），氰基氨酸代謝（Cyanoamino Acid Metabolism）、硫代葡萄糖苷生物合成（Glucosinolate Biosynthesis）、油菜素類固醇生物合成（Brassinosteroid Biosynthesis）、角質(zhì)、木栓和蠟生物合成（Cutin, Suberine and Wax Biosynthesis）（HG組與LG組）。顯著富集到的與互花米草抗逆有關(guān)的上調(diào)Unigene主要有K04392-ko04014 Ras信號(hào)通路（LG組與CG組）、 K02149-ko00190氧化磷酸化（LG組與CG組）、K04392-ko04014 Ras信號(hào)通路（HG組與LG組）、K06630-ko04722 神經(jīng)營養(yǎng)素信號(hào)通路（HG組與LG組）、K13027-ko00966 硫代葡萄糖苷生物合成（HG組與LG組）。

圖6 樣品間顯著富集功能-基因互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 6 Significant enrichment functional-gene interaction network diagram between the two groups

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)及差異基因分析

將各鹽度脅迫處理的互花米草葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，得到的RNA-seq整體質(zhì)量評(píng)估較好，所測(cè)樣本無論是在測(cè)序數(shù)據(jù)量、測(cè)序錯(cuò)誤率或是GC含量等方面都足以支撐后續(xù)實(shí)驗(yàn)及分析的要求。共獲得121760個(gè)Unigene，長度范圍201～12705 bp，平均長度633 bp，N50為1046 bp。將獲得的Unigene與NR、NT、KEGG、PFAM等8個(gè)常用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明57.86%的Unigene被至少1個(gè)數(shù)據(jù)庫注釋。

本文共得到1190個(gè)差異表達(dá)Unigene，其中LG組與CG組中有411個(gè)（上調(diào)Unigene 169個(gè)，下調(diào)Unigene 242個(gè)）、HG組與CG組中有56個(gè)（上調(diào)Unigene 9個(gè)，下調(diào)Unigene 47個(gè)）、HG組與LG組中有723個(gè)（上調(diào)Unigene 319個(gè)，下調(diào)Unigene 404個(gè)）。對(duì)各組差異Unigene進(jìn)行深入挖掘分析，發(fā)現(xiàn)大量與互花米草抗鹽性相關(guān)的基因上調(diào)，如葉綠體中的脂氧合酶基因、磷脂酶基因、光系統(tǒng)Ⅱ穩(wěn)定性因子基因等。Mei等（2023）研究發(fā)現(xiàn)玉米可通過調(diào)控脂質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)光合膜中的脂質(zhì)組成，維持其在鹽脅迫下的光合活性和正常生長（Mei et al, 2023）。Temme等（2020）通過鹽度脅迫向日葵發(fā)現(xiàn)，累積的Na+會(huì)造成離子毒性風(fēng)險(xiǎn)，耐鹽植物可以通過離子轉(zhuǎn)運(yùn)體將體內(nèi)多余鈉離子（Na+）轉(zhuǎn)運(yùn)出體外，穩(wěn)定Na+/K+比例，也是維持植物正常代謝的必要條件（Temme et al, 2020）。在本研究中，LG組與CG組和HG組與LG組中富集到的陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體基因、鈉/氫交換器基因、抗K+外流基因和鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因等Unigene表達(dá)量均顯著上調(diào)。非生物脅迫作用下，植物體內(nèi)脯氨酸作為兼容的滲透劑合成代謝會(huì)顯著提升（Hildebrandt, 2018; Batista-Silva et al, 2019），在LG組與CG組，與脯氨酸、蛋氨酸、絲氨酸和谷氨酸等氨基酸代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)Unigene顯著上調(diào)，包括SaP5CS2、蛋氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（Methionine S-methyltransferase）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶EDR1基因（Serine/threonine-protein kinase EDR1）谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶2基因（Glutamate glyoxylate aminotransferase 2）等。此外，本研究中泛素連接酶（E3）Unigene表達(dá)量顯著上調(diào)，有報(bào)道稱該基因在植物-非生物脅迫（如高鹽度、干旱）相互作用中起調(diào)節(jié)作用（Shu et al, 2017）。因此，互花米草在受到鹽脅迫時(shí)，可以高度調(diào)動(dòng)相關(guān)基因大量表達(dá)，從而使其具有較強(qiáng)的適應(yīng)性與競(jìng)爭優(yōu)勢(shì)。

3.2 GO注釋分析

對(duì)差異表達(dá)Unigene進(jìn)行GO功能注釋與分類，主要分為3大類：細(xì)胞組分、分子功能和生物過程，其中生物過程占比最多，均達(dá)到70.93%及以上。生物過程中的細(xì)胞過程、代謝過程、刺激應(yīng)答、生物調(diào)節(jié)、生物過程調(diào)控和定位等表達(dá)基因被大量富集，此外，還大量富集到與催化活性有關(guān)的分子功能相關(guān)基因和與細(xì)胞、細(xì)胞成分、細(xì)胞器、膜等細(xì)胞組分等有關(guān)的表達(dá)基因（圖2）。其中，刺激應(yīng)答、生物調(diào)節(jié)、生物過程調(diào)控和細(xì)胞膜相關(guān)過程與植物的生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答調(diào)控密切相關(guān)，這些基因在互花米草應(yīng)對(duì)鹽脅迫過程中被大量富集，其耐鹽響應(yīng)是多生物過程共同調(diào)控（王濤濤, 2020）。

3.3 KEGG注釋分析KEGG

代謝通路富集分析表明，差異表達(dá)Unigene富集到118條代謝通路中，其中有多條代謝通路可以響應(yīng)鹽度脅迫。細(xì)胞過程（如運(yùn)輸和分解代謝（Juan et al, 2023））、遺傳信息處理過程（如翻譯、折疊分揀和降解（Monika et al, 2022））、環(huán)境信息處理過程中的信號(hào)傳導(dǎo)（如信號(hào)傳導(dǎo)（Wu et al, 2018）、膜轉(zhuǎn)運(yùn)（Yuriko et al, 2014））和與應(yīng)對(duì)脅迫有關(guān)的代謝過程（如碳水化合物代謝（Gao et al, 1998）、與氨基酸代謝（Batista‐Silva et al, 2019））都有大量基因被富集。因此互花米草可通過調(diào)動(dòng)體內(nèi)多條代謝途徑來共同響應(yīng)鹽度脅迫。

3.4 基因蛋白互作分析

高鹽度對(duì)比低鹽度的功能-基因互作網(wǎng)絡(luò)圖中也可見高表達(dá)的抗逆相關(guān)途徑。本研究中互花米草啟動(dòng)多條代謝通路來響應(yīng)高鹽度脅迫，同時(shí)有多個(gè)基因參與應(yīng)答。其中互花米草的角質(zhì)、木栓和蠟生物合成，苯丙素、氮代謝，P13K-Akt信號(hào)通路、ECM-受體相互作用，氧化磷酸化等途徑在互花米草高鹽度脅迫處理時(shí)顯著激活。角質(zhì)和蠟是植物表皮的主要前體，能提供其各種脅迫保護(hù)，植物最適環(huán)境的改變會(huì)調(diào)動(dòng)合成表皮前體基因的表達(dá)（Ayaz et al, 2021），因此，互花米草通過增加其莖葉等器官中角質(zhì)和蠟的表達(dá)，來增強(qiáng)其生物入侵能力及高鹽度抗性。鹽度脅迫會(huì)抑制植物吸收、運(yùn)輸和利用含氮離子氮元素，進(jìn)而影響氮代謝，進(jìn)而影響植物代謝的中心“樞紐”——苯丙素途徑，該途徑在調(diào)控植物抗鹽度脅迫過程中發(fā)揮重要作用，可直接影響木質(zhì)素的積累量（Xu et al, 2022; 尚軍等, 2022），氮還可與硫代葡萄糖苷等物質(zhì)協(xié)作干預(yù)外源脅迫（Ashraf et al, 2018; Landi et al, 2019; Jia et al, 2022）。而硫代葡萄糖苷合成代謝的某一種調(diào)控途徑由油菜素內(nèi)酯參與。油菜素內(nèi)酯是國際公認(rèn)的最有效、無毒的植物生長激素，能調(diào)節(jié)植物的光合作用、呼吸作用、蒸騰作用，還能提高植物的抗逆性（Liu et al, 2022）。另外，在高鹽的環(huán)境中，植物可通過保持有效的光合作用和防止氧化損傷來抵御鹽脅迫（陳健妙等, 2009; Rados?aw et al, 2021）。在基因-功能互作HG組與CG組中多次被富集到的P13K-Akt信號(hào)通路的研究集中在抗炎抗病性，尤其是動(dòng)物腫瘤方面（Yu et al, 2022; Wang et al,2023），推測(cè)在高鹽脅迫下互花米草調(diào)動(dòng)了該通路應(yīng)對(duì)脅迫。ECM-受體相互作用在HG組與CG組和LG組與CG組都明顯富集到，可能與柳樹、白刺等（武香等, 2012）滲透調(diào)節(jié)的生理相應(yīng)相似，互花米草為應(yīng)對(duì)NaCl脅迫可能調(diào)動(dòng)了細(xì)胞外基質(zhì)受體的應(yīng)對(duì)機(jī)制，調(diào)節(jié)K+/Na+比例及其他可以調(diào)節(jié)滲透壓的物質(zhì)以適應(yīng)鹽度脅迫。以上途徑的正常運(yùn)作都需要大量能量供給，而且需要大量的能量來轉(zhuǎn)運(yùn)離子以維持滲透壓（梁書榮等, 2021; Ikram et al, 2022）。本研究發(fā)現(xiàn)氧化磷酸化通路在鹽度為24（LG）和32（HG）時(shí)被大量富集，而且與CG組相比，處于高鹽度環(huán)境中的LG與HG組中，NADH脫氫酶（ND4）與細(xì)胞色素C氧化酶（COX1、COX3）也顯著上調(diào)，這表明鹽脅迫下互花米草通過激活氧化磷酸化通路來響應(yīng)鹽脅迫，驅(qū)動(dòng)ATP合成增加來供給各高抗途徑。此外，還有大量與鹽脅迫相關(guān)的代謝通路，如脯氨酸（湯華等, 2007）、糖代謝（許興等, 2006） 、氰基氨酸代謝（Xu et al, 2023）等，在本研究的轉(zhuǎn)錄組中也被富集到。湯華等（2007）研究玉米苗期耐鹽性發(fā)現(xiàn)游離脯氨酸隨著鹽度增高而增高（湯華等, 2007），在本實(shí)驗(yàn)中與脯氨酸合成代謝有關(guān)的基因SaP5CS2被富集到。氰化物是一種抑制細(xì)胞呼吸的有毒化學(xué)物質(zhì)，Xu等在擬南芥耐鹽性研究中發(fā)現(xiàn)與氰基氨酸代謝有關(guān)的氰基丙氨酸合酶和氧化酶相互作用對(duì)于提高植物耐鹽性是必不可少的，與本實(shí)驗(yàn)氰基氨酸代謝途徑上調(diào)相符。

4 結(jié)語

互花米草作為一種鹽沼植物，其在我國濱海濕地地區(qū)的大量入侵及擴(kuò)散與其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性機(jī)制有重要的聯(lián)系，因此對(duì)互花米草的防治要從其關(guān)鍵的入侵機(jī)制進(jìn)行研究。本文主要通過對(duì)10（CG）、24（LG）和32（HG）三種不同鹽度處理的互花米草進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序及分析，挖掘到互花米草響應(yīng)鹽度脅迫的多個(gè)關(guān)鍵耐鹽基因（如SaP5CS2、HKT7、NHX2等）及代謝通路（如脯氨酸代謝通路、氮代謝通路等），這些基因及代謝通路通過調(diào)控互花米草體內(nèi)脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、角質(zhì)和蠟等抗脅迫物質(zhì)、調(diào)控Na+/K+平衡、激活P13K-Akt等信號(hào)通路等多種途徑共同影響互花米草的入侵及擴(kuò)散能力。本研究在分子水平上揭示了互花米草對(duì)高鹽度脅迫的響應(yīng)機(jī)制，并初步探討了與其在生物入侵及擴(kuò)散過程中的重要作用，為互花米草等鹽生入侵物種防控手段提供新的啟示。

附 錄