咖啡豆乙醇部位的化學(xué)成分研究

肜 霖, 王 波, 宋旭艷, 馬舒翼, 周小龍, 董愛君*, 楊新洲*

(1.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心, 武漢 430040; 2.中南民族大學(xué)藥學(xué)院, 武漢 430074)

茜草科咖啡屬植物在全世界范圍內(nèi)均有分布,其原產(chǎn)地在非洲中北部,現(xiàn)國內(nèi)亞熱帶地區(qū)也有廣泛種植.咖啡種類約有90多種,以咖啡豆為原料的飲料制品因風(fēng)味獨(dú)特而深受人們喜愛.我國最早引進(jìn)咖啡種植可以追溯到1884年,首棵咖啡樹在臺(tái)灣種植.目前,云南、海南和廣東等地是我國重要的咖啡生產(chǎn)區(qū),其在食品和藥品領(lǐng)域的應(yīng)用引起了人們廣泛的關(guān)注.咖啡豆性平,微苦偏澀;具有提神醒目、利尿促泄、健胃等功效,現(xiàn)多做提神飲品風(fēng)靡全球[1].咖啡豆含有多種化學(xué)成分,包括酚酸類,黃酮類,萜類等,其中以酚酸類含量為多,具有降糖、降脂、抗氧化、保護(hù)心肌等作用[2].此外咖啡在熱加工食品中可被用作調(diào)味劑或促進(jìn)健康的添加劑,咖啡的化學(xué)成分豐富,是影響咖啡生物活性和風(fēng)味的關(guān)鍵,對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行研究對(duì)于其在食品藥品領(lǐng)域的開發(fā)和質(zhì)量控制具有重要意義.因此本課題綜合利用各種分離提取技術(shù)對(duì)咖啡豆乙醇提取部位中的化學(xué)成分進(jìn)行了分離純化,最終分離鑒定了15個(gè)化合物,其中3個(gè)為首次從該植物中分離得到,分別為1,2,4-苯三酚 (11)、5,7-二羥基色原酮 (13)、新綠原酸內(nèi)酯 (15).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和材料

Bruker DRX-600 MHz核磁共振儀(德國Bruker公司),Waters ACQUITY SQD MS液相質(zhì)譜聯(lián)用儀,Waters 2535半制備型HPLC儀、Waters 2998 PDA檢測(cè)器、Waters 2707自動(dòng)進(jìn)樣器(美國Waters公司),Betasil C18柱 (250 mm × 10 mm, 5 μm, 美國Thermo公司),HP-20大孔樹脂(日本三菱公司),GF254薄層硅膠板(煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司),色譜級(jí)乙腈(美國TEDIA試劑公司).

1.2 植物來源

咖啡豆產(chǎn)自巴西,樣品于2021年8月由湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供,經(jīng)中南民族大學(xué)藥學(xué)院萬定榮教授鑒定為咖啡(CoffeaarabicaL.)的種子.

1.3 提取與分離

取500 g咖啡豆,研磨成粉溶于50%甲醇,采用大孔樹脂法對(duì)濃縮提取液進(jìn)行粗分,以水-乙醇梯度洗脫(體積比 98∶2→70∶30→50∶50→30∶70→10∶90→0∶100),TLC檢測(cè)后合并為7個(gè)組分,記為Fr. A～Fr. G.Fr. A樣品5.02 g,過濾后用高效液相色譜柱(Betasil C18柱,乙腈-水,體積比2∶98→30∶70,流動(dòng)相含有0.1%的甲酸)拆段共分為11段 (Fr. A-1～Fr. A-11),其中Fr. A-2用半制備HPLC純化得到化合物10(6.9 mg,tR=17.2 min)、化合物12(2.3 mg,tR=17.5 min);Fr. A-5用半制備HPLC純化得到化合物11(2.7 mg,tR=25.4 min)、化合物6(6.0 mg,tR=25.6 min);Fr. A-7用半制備HPLC純化后得到化合物7(8.7 mg,tR=26.4 min)、化合物8(4.0 mg,tR=26.8 min)、化合物9(1.9 mg,tR=27.5 min);Fr. A-8用半制備HPLC純化得到化合物4(7.5 mg,tR=28.9 min);Fr. A-9用半制備HPLC純化得到化合物5(8.4 mg,tR=29.8 min).Fr. C樣品1.64 g,過濾后用高效液相色譜柱 (Betasil C18柱, 乙腈-水, 體積比2∶98→40∶60, 流動(dòng)相含有0.1%的甲酸)拆段共分為10段 (Fr. C-1～Fr. C-10),其中Fr. C-4得到化合物1(20.7 mg,tR=23.4 min);Fr. C-8用半制備HPLC純化后得到化合物2(5.0 mg,tR=29.8 min);Fr. C-10用半制備HPLC純化后得到化合物3(7.6 mg,tR=30.4 min).同時(shí)將Fr. E樣品1.0 g直接用高效液相色譜(Betasil C18柱, 乙腈-水, 體積比5∶95→40∶60,流動(dòng)相含有0.1%的甲酸)分離純化得到化合物13(5.2 mg,tR=18.1 min),化合物14(4.2 mg,tR=21.5 min)、化合物15(5.4 mg,tR=22.5 min).

圖1 化合物 1～15結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-15

2 結(jié)構(gòu)鑒定

綜合應(yīng)用HP-20大孔樹脂柱層析、半制備高效液相色譜等多種分離方法對(duì)咖啡豆乙醇部位進(jìn)行分離純化,運(yùn)用NMR、MS等現(xiàn)代波譜方法鑒定化學(xué)結(jié)構(gòu),從咖啡豆乙醇部位提取物中分離得到了15個(gè)化合物,分別鑒定為咖啡因 (1)、1,4-二-O-(E)-咖啡酰-β-D-吡喃葡萄糖苷 (2)、1,3-O-二咖啡酰甘油 (3)、咖啡酸 (4)、咖啡酸甲酯 (5)、新綠原酸 (6)、綠原酸 (7)、隱綠原酸 (8)、阿魏酸 (9)、煙酸 (10)、1,2,4-苯三酚 (11)、檸檬酸 (12)、5,7-二羥基色原酮 (13)、3,4-二咖啡酰奎寧酸 (14)、新綠原酸內(nèi)酯 (15).化合物按照結(jié)構(gòu)類型可以分為生物堿、苯丙酸類、酚酸類化合物.

化合物1: C8H10N4O2, 白色晶體, ESI-MS:m/z195 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, CD3OD):δH7.85 (1H, s, H-8), 3.96 (3H, s, N7-CH3), 3.51 (3H, s, N3-CH3), 3.32 (3H, s, N1-CH3).13C-NMR (150 MHz, CD3OD):δC156.64 (C-2), 153.21 (C-6), 149.81 (C-4), 143.97 (C-8), 108.74 (C-5), 33.93 (N7-CH3), 30.12 (N3-CH3), 28.23 (N1-CH3). 其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物基本一致[3],故鑒定該化合物為咖啡因.

化合物2: C24H24O12, 白色非晶態(tài)固體, ESI-MS:m/z505 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6):δH7.59 (1H, d,J=15.9 Hz, H-7), 7.49 (1H, d,J=15.9 Hz, H-7′), 7.08 (1H, d,J=2.0 Hz, H-2), 7.05 (1H, d,J=2.0 Hz, H-2′), 7.05 (1H, dd,J=8.1, 2.0 Hz, H-6), 7.02 (1H, dd,J=8.1, 2.0 Hz, H-6′), 6.78 (1H, d,J=8.1 Hz, H-5), 6.77 (1H, d,J=8.1 Hz, H-5′), 6.30 (1H, d,J=15.9 Hz, H-8), 6.27 (1H, d,J=15.9 Hz, H-8′), 5.59 (1H, d,J=7.8 Hz, H-1″), 4.03 (1H, t,J=9.6 Hz, H-4″) 3.59 (2H, overlapped, H-3″, H-5″), 3.44 (1H, brd,J=12.0 Hz, H-6″a), 3.35 (2H, overlapped, H-2″, H-6″b).13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6):δC165.99 (C-9′), 165.83 (C-9), 148.46 (C-4), 148.37 (C-4′), 146.67 (C-7), 145.60 (C-3), 145.35 (C-3′), 145.17 (C-7′), 125.51 (C-1′), 125.45 (C-1), 121.46 (C-6), 121.38 (C-6′), 115.77 (C-5), 114.86 (C-5′), 114.74 (C-2), 114.22 (C-2′), 113.97 (C-8′), 113.25 (C-8), 94.11 (C-1″), 75.44 (C-5″), 73.67 (C-3″), 72.74 (C-2″), 70.75 (C-4″), 60.51 (C-6″). 其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物基本一致[4],故鑒定該化合物為1,4-二-O-(E)-咖啡酰-β-D-吡喃葡萄糖苷．

化合物3:C21H20O9, 黃色粉末, ESI-MS:m/z417 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, CD3OD):δH7.60 (2H, d,J=15.8 Hz, H-7′, 7″), 7.07 (2H, d,J=2.1 Hz, H-2′, 2″), 6.97 (2H, d,J=8.1 Hz, H-5′, 5″), 6.96 (2H, dd,J=8.1, 2.1 Hz, H-6′, 6″), 6.37 (2H, d,J=15.8 Hz, H-8′, 8″), 4.30 (4H, m, H-1,3), 4.17 (1H, m, H-2).13C-NMR (150 MHz, CD3OD):δC169.02 (C-9′), 168.50 (C-9″), 149.59 (C-3″), 149.49 (C-3′), 147.15 (C-7′), 146.97 (C-7″), 146.80 (C-4′), 146.79 (C-4″), 127.97 (C-1′), 127.82 (C-1″), 123.03 (C-6′), 123.00 (C-6″), 116.46 (C-5′), 115.72 (C-5″), 115.23 (C-2′), 115.18 (C-2″), 115.10 (C-8′), 115.10 (C-8″), 70.06 (C-1), 70.06 (C-3), 66.40 (C-2). 其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物基本一致[5],故鑒定該化合物為1,3-O-二咖啡酰甘油．

化合物4: C9H8O4, 白色晶體, ESI-MS:m/z181 [M + H]+.1H-NMR (600 MHz, CD3OD):δH7.53 (1H, d,J=15.9 Hz, H-7), 7.03 (1H, d,J=2.1 Hz, H-2), 6.93 (1H, dd,J=8.2, 2.1 Hz, H-6), 6.78 (1H, d,J=8.2 Hz, H-5), 6.22 (1H, d,J=15.9 Hz, H-8).13C-NMR (150 MHz, CD3OD):δC171.04 (C-9), 149.47 (C-4), 147.03 (C-7), 146.81 (C-3), 127.78 (C-1), 122.85 (C-6), 116.47 (C-5), 115.51 (C-8), 115.05 (C-2). 其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物基本一致[6],故鑒定該化合物為咖啡酸．

化合物5: C10H10O4, 白色晶體, ESI-MS:m/z195 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, CD3OD):δH7.54 (1H, d,J=15.9 Hz, H-8), 7.03 (1H, d,J=2.1 Hz, H-2), 6.94 (1H, dd,J=8.2, 2.1 Hz, H-6), 6.77 (1H, d,J=8.2 Hz, H-5), 6.26 (1H, d,J=15.9 Hz, H-7), 3.75 (3H, s, 9-OCH3).13C-NMR (150 MHz, CD3OD):δC169.75 (C-9), 149.59 (C-4), 146.94 (C-8), 146.82 (C-3), 127.66 (C-1), 122.93 (C-6), 116.47 (C-5), 115.08 (C-2), 114.80 (C-7), 51.99 (9-OCH3). 其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物基本一致[7],故鑒定該化合物為咖啡酸甲酯．

化合物6: C16H18O9, 淡黃綠色粉末, ESI-MS:m/z355 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, CD3OD):δH7.59 (1H, d,J=15.9 Hz, H-7′), 7.04 (1H, d,J=2.0 Hz, H-2′), 6.94 (1H, d,J=8.1, 2.0 Hz, H-6′), 6.77 (1H, d,J=8.1 Hz, H-5′), 6.31 (1H, d,J=15.9 Hz, H-8′), 5.35 (1H, m, H-5), 4.15 (1H, m, H-3), 3.64 (1H, dd,J=8.5, 3.4 Hz, H-4), 2.20 (1H, m, H-2a), 2.14 (2H, m, H-2b, 6a), 1.96 (1H, dd,J=13.5, 9.8 Hz, H-6b).13C-NMR (150 MHz, CD3OD):δC178.40 (C-7), 169.04 (C-9′), 149.44 (C-4′), 146.8 (C-3′, 7′), 127.95 (C-1′), 122.89 (C-6′), 116.44 (C-5′), 115.82 (C-8′), 115.07 (C-2′), 75.39 (C-1), 74.75 (C-4), 73.00 (C-3), 68.31 (C-5), 41.47 (C-6), 36.71 (C-2). 其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物基本一致[8],故鑒定化合物為新綠原酸．

化合物7: C16H18O9, 淡黃綠色粉末, ESI-MS:m/z355 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, CD3OD):δH7.56 (1H, d,J=15.9 Hz, H-7′), 7.05 (1H, d,J=2.0 Hz, H-2′), 6.95 (1H, dd,J=8.2, 2.0 Hz, H-6′), 6.78 (1H, d,J=8.2 Hz, H-5′), 6.26 (1H, d,J=15.9 Hz, H-8′), 5.33 (1H, m, H-3), 4.16 (1H, m, H-5), 3.73 (1H, dd,J=8.8, 3.1 Hz, H-4), 2.21 (2H, m, H-6), 2.06 (2H, m, H-2).13C-NMR (150 MHz, CD3OD):δC177.12 (C-7), 168.65 (C-9′), 149.58 (C-3′), 147.07 (C-7′), 146.80 (C-4′), 127.77 (C-1′), 122.98 (C-6′), 116.45 (C-5′), 115.24 (C-8′), 115.15 (C-2′), 76.17 (C-1), 73.45 (C-3), 71.98 (C-4), 71.30 (C-5), 38.78 (C-6), 38.21 (C-2). 其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物基本一致[8],故鑒定該化合物為綠原酸．

化合物8: C16H18O9, 淡黃色粉末, ESI-MS:m/z355 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, CD3OD):δH7.64 (1H, d,J=15.9 Hz, H-7′), 7.07 (1H, d,J=2.0 Hz, H-2′), 6.97 (1H, dd,J=8.1, 2.0 Hz, H-6′), 6.78 (1H, d,J=8.1 Hz, H-5′), 6.36 (1H, d,J=15.9 Hz, H-8′), 4.80 (1H, m, H-4), 4.29 (2H, m, H-3, 5), 2.20 (2H, m, H-6), 2.04 (2H, m, H-2).13C-NMR (150 MHz, CD3OD):δC177.34 (C-7), 169.00 (C-9′), 149.58 (C-4′), 147.13 (C-7′), 146.83 (C-3′), 127.85 (C-1′), 122.97 (C-6′), 116.47 (C-5′), 115.35 (C-8′), 115.12 (C-2′), 79.27 (C-1), 76.57 (C-4), 69.63 (C-3), 65.53 (C-5), 42.69 (C-6), 38.44 (C-2). 其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物基本一致[9],故鑒定為隱綠原酸．

化合物9: C10H10O4, 白色晶體, ESI-MS:m/z195 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, CD3OD):δH7.65 (1H, d,J=15.9 Hz, H-7), 7.20 (1H, d,J=1.9 Hz, H-2), 7.07 (1H, dd,J=8.2, 1.9 Hz, H-6), 6.81 (1H, d,J=8.2 Hz, H-5), 6.40 (1H, d,J=15.9 Hz, H-8), 3.90 (3H, s, 3-OCH3).13C-NMR (150 MHz, CD3OD):δC168.86 (C-9), 150.48 (C-3), 149.36 (C-4), 146.65 (C-7), 127.97 (C-1), 124.01 (C-6), 116.45 (C-8), 116.19 (C-5), 111.66 (C-2), 56.42 (3-OCH3). 其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物基本一致[10],故鑒定該化合物為阿魏酸．

化合物10: C6H5NO2, 白色粉末, ESI-MS:m/z124 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, CD3OD):δH9.12 (1H, d,J=1.9 Hz, H-2), 8.71 (1H, d,J=4.9 Hz, H-6), 8.40 (1H, dd,J=7.9, 1.9 Hz, H-4), 7.55 (1H, dd,J=7.9, 4.9 Hz, H-5);13C-NMR (150 MHz, CD3OD):δC168.25 (3-COOH), 153.40 (C-2), 151.28 (C-6), 139.17 (C-4), 129.39 (C-3), 125.17 (C-5). 其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物基本一致[11],故鑒定該化合物為煙酸．

化合物11: C6H6O3, 淡黃色粉末; ESI-MS:m/z127 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, CD3OD):δH7.43 (1H, d,J=1.8 Hz, H-3), 7.41 (1H, dd,J=8.2, 1.8 Hz, H-5), 6.78 (1H, d,J=8.2 Hz, H-6).13C-NMR (150 MHz, CD3OD):δC151.11 (C-4), 145.95 (C-2), 123.72 (C-1), 117.72 (C-6), 115.64 (C-3, 5). 其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物基本一致[12],故鑒定該化合物為1,2,4-苯三酚．

化合物12: C6H8O7, 無色針晶; ESI-MS:m/z193 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, CD3OD):δH2.90 (2H, d,J=15.7 Hz, H-2b, 4b), 2.79 (2H, d,J=15.7 Hz, H-2a, 4a).13C-NMR (150 MHz, CD3OD):δC177.00 (3-COOH), 173.60 (C-1, 5), 74.16 (C-3), 43.89 (C-2, 4). 其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物基本一致[13],故鑒定該化合物為檸檬酸．

化合物13: C9H6O4, 黃色針狀結(jié)晶; ESI-MS:m/z179 [M+H ]+.1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6):δH12.70 (1H, s, OH), 10.89 (1H, s, OH), 8.18 (1H, d,J=5.9 Hz, H-2), 6.35 (1H, d,J=2.1 Hz, H-8), 6.27 (1H, d,J=5.9 Hz, H-3), 6.20 (1H, d,J=2.1 Hz, H-6).13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6):δC181.32 (C-4), 164.38 (C-7), 161.63 (C-5), 157.82 (C-9), 157.50 (C-2), 110.51 (C-3), 104.92 (C-10), 99.02 (C-6), 93.99 (C-8). 其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物基本一致[14],故鑒定該化合物為5,7-二羥基色原酮．

化合物14: C25H24O12, 淡黃色粉末; ESI-MS:m/z517 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6):δH7.45 (2H, d,J=15.9 Hz, H-7′, 7″), 7.04 (1H, d,J=2.0 Hz, H-2′), 7.01 (1H, d,J=2.0 Hz, H-2″), 6.97 (1H, dd,J=8.2, 2.0 Hz, H-6′), 6.94 (dd,J=8.2, 2.0 Hz, H-6″), 6.74 (2H, d,J=8.2 Hz, H-5′, 5″), 6.25 (1H, d,J=15.9 Hz, H-8′), 6.17 (1H, d,J=15.9 Hz, H-8″), 5.43 (1H, m, H-3), 4.95 (1H, dd,J=7.2, 3.2 Hz, H-4), 4.03 (1H, m, H-5), 1.94-2.10 (4H, m, H-2, 6).13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6):δC174.47 (C-7), 165.96 (C-9′), 165.79 (C-9″), 148.45 (C-4′, C-4″), 145.58 (C-7′, C-7″), 145.34 (C-3″, C-3″), 125.50 (C-1′, 1″), 121.44 (C-6′), 121.37 (C-6″),115.86 (C-5′) , 115.75 (C-5″), 114.87 (C-2′, C-2″), 114.19 (C-8′), 113.98 (C-8″), 72.69 (C-1), 68.26 (C-5), 67.23 (C-3), 38.12 (C-2), 37.61 (C-6). 其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物基本一致[15],故鑒定該化合物為3,4-二咖啡酰奎寧酸．

化合物15: C16H16O8, 淡黃色粉末, ESI-MS:m/z337 [M+H]+.1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6): 7.53 (1H, d,J=15.8 Hz, H-7′), 7.03 (1H, brs, H-2′), 7.01 (1H, d,J=8.2, 2.0 Hz, H-6′), 6.77 (1H, d,J=8.2 Hz, H-5′), 6.25 (1H, d,J=15.8 Hz, H-8′), 6.15 (1H, s, 1-OH), 5.69 (1H, s, 4-OH), 4.72 (2H, m, H-3, 5), 4.15 (1H, m, H-4), 2.38 (1H, d,J=11.4 Hz, H-2a), 2.21 (1H, m, H-2b), 2.03 (1H, m, H-6a), 1.94 (1H, t,J=11.7 Hz, H-6b);13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6):δC177.17 (C-7), 165.72 (C-9′), 148.53 (C-4′), 145.62 (C-3′, 7′), 125.49 (C-1′), 121.44 (C-6′), 115.80 (C-5′), 114.81 (C-2′), 113.75 (C-8′), 75.71 (C-3), 71.45 (C-1), 68.53 (C-5), 62.78 (C-4), 36.50 (C-2), 35.63 (C-6). 其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物基本一致[16],故鑒定該化合物為新綠原酸內(nèi)酯．

4 結(jié)語

運(yùn)用NMR、MS等現(xiàn)代波譜方法鑒定化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu),從咖啡豆乙醇部位提取物中分離鑒定了15個(gè)化合物,分別鑒定為咖啡因 (1)、1,4-二-O-(E)-咖啡酰-β-D-吡喃葡萄糖苷 (2)、1,3-O-二咖啡酰甘油 (3)、咖啡酸 (4)、咖啡酸甲酯 (5)、新綠原酸 (6)、綠原酸 (7)、隱綠原酸 (8)、阿魏酸 (9)、煙酸 (10)、1,2,4-苯三酚 (11)、檸檬酸 (12)、5,7-二羥基色原酮 (13)、3,4-二咖啡酰奎寧酸 (14)、新綠原酸內(nèi)酯 (15).其中有3個(gè)化合物為首次從該植物中分離得到,分別為1,2,4-苯三酚 (11)、5,7-二羥基色原酮 (13)、新綠原酸內(nèi)酯 (15).咖啡豆的化學(xué)成分是影響咖啡生物活性和風(fēng)味的關(guān)鍵,本文對(duì)咖啡豆的化學(xué)成分進(jìn)行研究,為進(jìn)一步完善和推進(jìn)咖啡相關(guān)研究提供了一定的參考依據(jù),這對(duì)于其在食品藥品領(lǐng)域的開發(fā)和質(zhì)量控制具有重要意義.