基于加權基因共表達網絡分析挖掘茯苓抗食管癌作用靶點

蔣向輝, 徐玉平

(凱里學院大健康學院,貴州 凱里 556011)

食管癌(esophageal cancer,ESCA)是世界上最多見癌癥類型之一.根據《2021年全球癌癥統計》,它的發病率位居第十,死亡率位居第六[1].食管癌的5年生存率為20%,且因性別而有很大差異[2].根據組織學分類,食管癌可分為食管腺癌(esophageal adenocar cinoma,EAC)和食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC).近十年來,食管腺癌發病率在世界各地均呈現逐年增長的趨勢[3],嚴重危害了人類的生命健康.茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriscocos(Schw.) Wolf的干燥菌核,是傳統的藥食兩用中藥,現代藥理學研究表明,茯苓具有抗腫瘤、抗肝纖維化、免疫調節、抗過敏等功效[4].研究食管癌的發病機制并挖掘茯苓治療食管癌的潛在作用靶點將為食管癌的早期篩查和治療提供重要參考.

加權基因共表達網絡分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)是用于探索不同樣本之間高度相關基因模塊的系統生物學方法[5],通過分析模塊與臨床性狀的關聯,挖掘出與臨床性狀緊密相關的關鍵模塊,經過模塊內分析和網絡可視化識別模塊內的關鍵基因,這有助于找到與食管癌發生發展相關的核心基因.WGCNA方法已廣泛應用于腫瘤和其他疾病的預后標志物和治療靶點的篩選,特別是在膠質母細胞瘤[6]、前列腺癌[7]等多種癌癥當中得到了廣泛的應用,效果較好.本研究基于差異表達分析篩選出TCGA-ESCA數據集和GSE22954數據集中的差異表達基因,運用WGCNA方法進行模塊化分析找出與食管癌顯著相關的基因模塊,通過比較兩個關鍵模塊中的差異表達基因,獲得最終的食管癌相關基因.對食管癌相關基因進行gene ontology (GO) 分析和kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) 富集分析,并進行蛋白質相互作用分析將核心基因可視化,進行生存分析對核心基因進行外部驗證,利用臨床相關性分析來考察關鍵基因在不同臨床分組間的表達差異,借助HPA數據庫驗證基因在蛋白水平的表達.研究結果表明MCM2、CHAF1A的低表達與食管癌患者的生存期惡化有關,為食管癌的臨床診治開創了新思路.

1 方法

1.1 研究流程

茯苓有效活性成分及其作用靶點篩選→食管癌轉錄組數據與GEO數據交集基因篩選→交集基因GO和KEGG富集分析→食管癌關鍵基因篩選→關鍵基因臨床分析→小鼠食管癌模型構建→茯苓水煎液對食管癌關鍵基因表達影響檢測.

1.2 茯苓有效活性成分、對應靶點的檢索和候選藥物作用靶點的篩選

在TCMSP數據庫(https://tcmspw.com/tcmsp.php)中獲取茯苓所有的活性成分.根據篩選指標:口服生物利用度(oral bioavailability, OB) ≥ 30%、類藥性(drug likeness, DL) ≥ 0.18,得出茯苓的主要活性成分及其對應的靶點[8].利用universal protein (Uniprot)數據庫將靶基因全稱置換為基因symbol,刪除重復項后將基因名輸入STRING數據庫(https://string-db.org/),構建蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)網絡圖.借助Cytoscape軟件篩選出前6個抗食管癌的候選藥物作用靶點.

1.3 數據收集與預處理

在TCGA數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下載的轉錄組數據共有171例樣本,其中包括160例食管癌和11例正常組織,共19 600個基因.在TCGA數據庫中下載的臨床數據共183例樣本.從GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)中下載的GSE22954數據集共有90例樣本,其中包括80例正常樣本和10例食管癌樣本,將基因探針轉換為基因名,去重后共獲得8 622個基因用于后續分析.

1.4 共表達網絡的構建與關鍵模塊的識別

R語言運行WGCNA數據包,將TCGA-ESCA和GSE22954的基因表達數據譜構建成共表達網絡,創建基因聚類樹狀圖.參照Miller等[9]驗證特定的模塊與正常、腫瘤狀態的關聯性,并繪制模塊—性狀熱圖,鑒定出關鍵模塊.其中,相關系數絕對值最大的模塊被看作是與臨床性狀緊密相關的關鍵模塊,將用于后續分析.此外,通過對基因顯著性(gene significance,GS)和模塊隸屬度(module membership,MM)相關性進行計算,以衡量基因與臨床性狀、基因與各模塊特征基因的相關性.

1.5 差異表達分析和交集分析

參照Miao等的方法[10],將limma數據包分別應用于TCGA-ESCA和GSE22954數據集中篩選食管癌組織和正常組織之間的差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs).接著運用R軟件的ggplot2數據包,將TCGA-ESCA和GSE22954數據集的DEGs可視化為火山圖;運行pheatmap數據包繪制DEGs的熱圖,運行VennDiagram數據包,將關鍵模塊中的基因和差異表達基因取交集,獲得最終的食管癌相關基因,并以韋恩圖的形式呈現.將最終的食管癌相關基因與茯苓的前6個候選藥物作用靶點進行對比,最終確定茯苓抗食管癌的潛在作用靶點.

1.6 GO和KEGG富集分析

參照Yu等[11]的方法利用R軟件運行org.Hs.eg.db數據包將基因名轉換成基因ID,再利用clusterProfiler、ggplot2和enrichplot數據包對食管癌相關基因進行GO和KEGG富集分析.借助KEGG orthology based annotation system (KOBAS) 數據庫(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/download.php)中的Gene-list Enrichment功能,檢索出基因富集最顯著的代謝通路圖.

1.7 核心基因的鑒定

參照Szklarczyk等[12]的方法借助STING工具構建食管癌相關基因的PPI網絡圖,導出PPI數據,Shannon等[13]的方法使用Cytoscape對其進行可視化分析,并進行核心基因的查找.已有研究發現,最大團中心性(maximal clique centrality,MCC)算法是尋找PPI網絡中關鍵節點最有效的方法[14],下載Cytoscape軟件的插件CytoHubba,利用它計算每個節點的MCC值并排序.本研究參照張燕玲等[15]的方法,將MCC值位于前十的基因作為核心基因.

1.8 生存分析和臨床相關性分析

根據在TCGA數據庫中下載的食管癌相關核心基因的表達量,將食管癌患者分成高低表達兩組.運行R語言的survival數據包對核心基因進行總生存期(overall surviva, OS) 分析,使用gene expression profiling interactive analysis (GEPIA2) 數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)進行無病生存期(disease free survival, DFS)分析[16],方法選擇RFS,按中位數分組,腫瘤名稱選擇食管癌.若p< 0.05,則說明該核心基因的表達差異對食管癌患者的生存期惡化具有顯著影響.提取臨床數據中的臨床性狀,只保留分期列與基因ID列,并按分期進行排序.運行R語言的ggpubr數據包對核心基因進行臨床相關性分析,當不同分期之間的p< 0.05,則說明該核心基因在食管癌患者不同分期間的表達差異具有統計學意義.

1.9 免疫組化分析

借助HPA數據庫(https://www.proteinatlas.org)獲取核心基因在正常樣品與食管癌樣品中的免疫組化圖片,觀察基因在正常樣品與食管癌樣品間是否真的具有差異.

1.10 茯苓水煎液對關鍵基因表達量影響檢測

1.10.1 不同濃度茯苓水煎液的制備 參照Huang等[17]的方法,取茯苓200 g于90 ℃下水煎三次,每次加水300 mL,過濾,合并三次濾液,40 ℃下減壓蒸餾,得浸膏18 g,加水90 mL得濃度為0.2 g·mL-1的水提液母液(高濃度),取母液30 mL分別稀釋2倍和5倍,制得濃度為0.1 g·mL-1(中濃度)和0.04 g·mL-1(低濃度)的2種茯苓水煎液稀釋液.

1.10.2 小鼠食管癌模型構建與關鍵基因表達量檢測 雄性SCID小鼠(20～25 g)后肢皮下注射約6×105個ECA109細胞,40只荷瘤小鼠共分成四組,接種后3周開始灌胃茯苓水煎液,實驗組茯苓水煎液濃度分別為0.2 g·mL-1(高濃度)、0.1 g·mL-1(中濃度)和0.04 g·mL-1(低濃度),正常組給等量的水,每日給藥1次,連續15 d.采用TRIZOL試劑分離小鼠食管總RNA,將總RNA逆轉錄成cDNA,采用qRT-PCR方法檢測關鍵基因mRNA表達水平,參照Rubie等[18]的方法以人的磷酸甘露糖酶HMM1基因作為內參基因,qPCR引物序列見表1.

表1 關鍵基因RT-PCR檢測引物

2 結果

2.1 茯苓有效活性成分、對應靶點的檢索和候選藥物作用靶點的篩選

在TCMSP數據庫中檢索到茯苓的活性成分共34種,經篩選得15種有效活性成分(見表2):去氫齒孔酸、常春藤皂苷元、茯苓新酸C、茯苓新酸B、茯苓新酸A、茯苓酸、3β-羥基-24-亞甲基-8-羊毛甾-21-酸、多孔覃酸C、過氧化麥角甾醇、星魚甾醇、去氫土莫酸、啤酒甾醇、去氫茯苓酸、栓菌酸、3β,16α-二羥基羊毛甾-7, 9 (11), 24-三烯-21-酸.其中去氫齒孔酸的OB、DL值最高,故去氫齒孔酸可能是茯苓發揮功效的核心活性成分.

表2 茯苓有效活性成分的相關信息

檢索有效活性成分的靶點并去重,最終獲得17個作用靶點.按MCC算法從大到小排序,篩選得前6個候選藥物作用靶點(圖1):CHRM1、NCOA2、PGR、ADRA1B、ADH1B、PTGS2.

圖1 茯苓候選藥物作用靶點的鑒別Fig.1 Identification of drug target of Poria cocos

2.2 共表達網絡的構建和關鍵模塊的識別

利用WGCNA數據包構建TCGA-ESCA和GSE22954數據集的共表達網絡.過濾掉具有缺失值的基因和樣本,TCGA-ESCA數據中有171例樣本(圖2a),GSE22954數據中有90例樣本,分別被用于構建樣品聚類圖(圖2b),結果表明兩個數據庫中的樣本均未出現離群樣本.

a.基于TCGA-ESCA數據集的樣品聚類圖; b.基于GSE22954數據集的樣品聚類圖圖2 樣品聚類圖Fig.2 Sample cluster diagram

為達到無尺度網絡標準,需篩選合適的軟閾值,利用“pickSoftThreshold”函數計算結果如圖3所示,本研究選取了R2大于0.9的β,最終TCGA-ESCA數據集和GSE22954數據集選取的軟閾值分別為β=2和7.根據這兩個軟閾值,分別對兩個數據庫中的基因作聚類分析,并構建基因聚類樹.使用動態切割法進行基因模塊的識別,設定每個基因模塊中的基因數不少于50,設置MEDissThres的值為0.25,最終TCGA數據庫中的基因被分成10個模塊(圖4a):Black(93個)、Blue(2 722個)、Brown(1 214個)、Green(388個)、Greenyellow(52個)、Magenta(79個)、Pink(91個)、Red(262個)、Turquoise(9 260個)、Yellow(498個).GSE22954數據集中的基因被分成14個模塊(圖4b):Black(387個)、Blue(1 240個)、Brown(2 709個)、Green(589個)、Greenyellow(143個)、Grey(591個)、Magenta(334個)、Pink(351個)、Purple(222個)、Red(423個)、Salmon(70個)、Yellow(920個).其中Grey模塊指難以分配給其余任何模塊的基因簇.

a. 基于TCGA-ESCA數據集的軟閾值的確定; b.基于GSE22954數據集的軟閾值的確定圖3 軟閾值的確定Fig. 3 Determination of soft threshold

a.TCGA-ESCA數據集的基因聚類樹狀圖; b.GSE22,954數據集的基因聚類樹狀圖;c.TCGA-ESCA數據集的基因模塊-特征關系熱圖; d.GSE22,954數據集的基因模塊-特征關系熱圖圖4 聚類分析模塊的確定Fig.4 Determination of cluster analysis module

圖4c和圖4d中每個格子含有兩個數值,上方數值代表該模塊與臨床狀態的相關系數,下方數值指相關性檢驗的p值.在TCGA數據集中,Yellow(r=-0.72,p=9×10-29),Black(r=-0.24,p=0.002),Brown(r=-0.36,p=1×10-6)模塊與食管癌組織呈負相關,Red(r=0.17,p=0.02)模塊與食管癌組織呈正相關,Pink(r=-0.15,p=-0.05),Blue(r=0.083,p=0.3),Green(r=0.1,p=0.2),Greenyellow(r=-0.011,p=0.9),Magenta(r=-0.14,p=0.07)Turquoise(r=-0.15,p=0.06)模塊同臨床性狀的相關性較弱.在GEO數據集中,Blue(r=0.51,p=2×10-7),Red(r=0.21,p=0.04)模塊與食管癌組織呈正相關,Green(r=-0.39,p=1×10-4),Magenta(r=-0.72,p=7×10-16),Salmon(r=-0.42,p=3×10-5),Purple(r=-0.24,p=0.02),Yellow(r=-0.27,p=0.009)與食管癌組織呈負相關.Black(r=0.058,p=0.6),Brown(r=0.14,p=0.2),Greenyellow(r=0.13,p=0.2),Pink(r=-0.094,p=0.4)模塊與臨床狀態的相關性較弱.結果表明TCGA-ESCA中的Yellow模塊和GSE22,954中的Magenta模塊與食管癌組織的相關性最高.進一步對Yellow模塊(cor=0.87,p=1.9×10-15)和Magenta模塊(cor=0.670,p=7.2×10-45)內的GS和MM相關性進行計算,也驗證了這兩個模塊為關鍵模塊(圖5).

a. Yellow模塊的GS與MM相關性; b.Magenta模塊的GS與MM相關性圖5 GS與MM相關性Fig. 5 Correlation between GS and MM

2.3 差異表達分析和取交集基因

利用limma數據包對TCGA-ESCA(圖6a)和GSE22954(圖6b)數據集中的基因進行了差異表達分析,得到差異熱圖.其中橫坐標表示樣品(淺藍色為正常樣品、淺紅色為食管癌樣品),縱坐標表示基因,若某基因在正常樣品中是紅色,表示它在正常樣品中高表達,而在食管癌樣品中有多種顏色,則表明它在食管癌樣品中是低表達.在火山圖中,橫軸上的值表示log FC,縱軸上的值表示校正后的p值.黑點指的是某基因在正常樣品和食管癌樣品中無表達差異,綠點指的是某基因在食管癌樣品中下調,紅點指的是某基因在食管癌樣品中上調.

a. TCGA-ESCA數據集差異基因熱圖; b.GSE22954數據集差異基因熱圖圖6 差異熱圖和火山圖Fig.6 Differential heat map and volcano map

與正常食管組織相比,TCGA數據集中共鑒定出2 394個差異表達基因在食管癌組織中表達失調,其中1 225個下調,1 169個上調.GSE22954數據集中共鑒定出1 505個差異表達基因在食管癌組織中表達失調,其中872個下調,595個上調.通過火山圖(圖6)和熱圖(圖7)可視化.提取TCGA數據集中黃色模塊和GSE22954數據集中品紅色模塊的共表達基因,并與前面所得的差異表達基因進行交集分析,最終識別出29個交集基因,結果通過韋恩圖可視化(圖8).將交集基因與茯苓抗食管癌的6個候選作用靶點作對比,發現ADH1B可能為茯苓抗食管癌的潛在作用靶點.

a. TCGA-ESCA數據集差異基因的火山圖; b.GSE22954數據集差異基因的火山圖圖7 差異熱圖和火山圖Fig.7 Differential heat map and volcano map

圖8 交集基因與差異基因Venn圖Fig.8 Venn diagram of intersection genes and differential genes

2.4 GO和KEGG富集分析

GO富集分析結果如圖9所示,29個交集基因主要富集在細胞核分裂、有絲分裂細胞周期相關的調控、細胞周期G2/M期的轉換、姐妹染色單體分離、細胞器分裂等321個生物學過程(biological process,BP),微管結合、微管蛋白結合、3′→5′脫氧核糖核酸解旋酶活性、三磷酸腺苷酶活性等48個分子功能(molecular function,MF),紡錘體、微管、驅動蛋白復合物、中間體等53個細胞組分(cell component,CC).KEGG富集分析結果如圖10所示,29個交集基因富集在細胞周期、范可尼貧血途徑、氮素代謝、孕酮介導的卵母細胞成熟、DNA復制、細胞衰老這6條代謝通路上.

a. GO富集氣泡圖;b. KEGG富集柱狀圖圖9 交集基因的 GO和KEGG富集分析圖Fig.9 GO and KEGG enrichment analysis of the intersection genes

注:紅色節點表示食管癌相關基因.圖10 代謝通路圖Fig. 10 Metabolic pathway diagram

借助KOABS數據庫獲取了交集基因富集最顯著的細胞周期通路圖.如圖10所示,CDKs是該通路中重要的調控酶,不同的CDK結合不同的周期蛋白(cyclin),在細胞周期不同階段使各自的底物蛋白磷酸化,改變其結構和功能,從而調節細胞周期各階段的進程.在G1期,CDK2、CDK4、CDK6將調節因子Rb磷酸化,使HDAC、轉錄因子E2F復合體得以解離,解離后的E2F在c-myc等物質的幫助下與DNA啟動子上的E2F位點結合,啟動轉錄,進一步合成DNA復制所需要的蛋白質.在S期,食管癌相關蛋白MCM被CDC7/DBF4復合體磷酸化,磷酸化的MCM與ORC組成復合體,啟動DNA的復制,因此MCM在DNA復制過程中起著重要的作用.在G2期,周期蛋白cyclinA/cyclinB含量積累達到最大值,它們與食管癌相關蛋白CDK1結合形成復合物,Wee1等激酶對CDK1多個特定位點上的氨基酸殘基磷酸化.隨后在食管癌相關蛋白CDC25B,CDC25C的作用下,去掉某些位點的磷酸基團,此時CDK1開始出現活性,具有活性的食管癌相關蛋白CDK1可以催化多種底物蛋白磷酸化,由此調控細胞從G2期向M期轉換.例如催化組蛋白H1磷酸化,促使染色質凝縮;催化核仁蛋白磷酸化,促進核仁解體;催化C-abl蛋白磷酸化,促使細胞形態調整等.

2.5 核心基因的鑒定

利用STING數據庫構建29個交集基因的蛋白質互作網絡圖,圖中顯示有18個節點和82根邊緣線(圖11a).運用Cytoscape中的CytoHubba插件計算每個節點的MCC值,按MCC值的大小進行排序,可從蛋白互作網絡圖中鑒定出前10個核心基因.結果如圖11b所示,篩選出的核心基因包括DLGAP5、MCM2、CCNA2、CDK1、TPX2、TRIP13、KIF23、KIF2C、CENPF和CHAF1A.另外,網絡圖中節點顏色越紅,則表明該節點越有可能是網絡的核心.

2.6 生存分析、臨床相關性分析和免疫組化分析

篩選出前十個核心基因和茯苓抗食管癌的潛在作用靶點ADH1B后,基于TCGA-ESCA的臨床數據,運用R軟件運行survival數據包作OS分析,結果如圖12所示:DLGAP5(p=0.147)、CCNA2(p=0.613)、CDK1(p=0.111)、TPX2(p=0.977)、TRIP13(p=0.647)、KIF23(p=0.702)、KIF2C(p=0.947)、CENPF(p=0.384)、CHAF1A(p=0.334)、ADH1B(p=0.579)的表達量與食管癌患者的OS相關性低,而MCM2(p=

圖12 核心基因的總體生存分析圖Fig.12 Overall survival analysis diagram of hub genes

0.003)的低表達與食管癌患者的OS惡化顯著相關.利用在線工具GEPIA2數據庫進行DFS分析,結果如圖13所示,CCNA2的結果為logrankp=0.19,HR=1.4,CDK1的結果為logrankp=0.71,HR=0.91,DLGAP5的結果為logrankp=0.15,HR=1.4,TPX2的結果為logrankp=0.21,HR=1.4,TRIP13的結果為logrankp=0.6,HR=1.1,KIF23的結果為logrankp=0.56,HR=0.87,KIF2C的結果為logrankp=0.24,HR=1.3,CENPF的結果為logrankp=0.37,HR=1.2,MCM2的結果為logrankp=0.87,HR=0.96,CHAF1A的結果為logrankp=0.049,HR=0.62.ADH1B的結果為由logrankp=0.56,HR=0.86,由上可知CHAF1A的低表達水平與食管癌患者的DFS惡化顯著相關.

圖13 核心基因的無病生存分析圖Fig.13 Disease-free survival analysis diagram of hub genes

利用R語言的ggpubr數據包對11個基因進行臨床相關性分析,結果如圖14所示,CDK1、CHAF1A、DLGAP5、TPX2和TPIP13的表達量在Ⅰ期與Ⅱ期間的差異顯著性p值依次為0.044,0.039,0.040,0.014,0.035,MCM2的表達量在Ⅱ期與Ⅲ期間的差異顯著性p值為0.017,TPX2在Ⅰ期與IV期間的p值為0.032,均小于0.05.因此CDK1、CHAF1A、DLGAP5、TPX2和TPIP13在Ⅰ期與Ⅱ期之間、MCM2在Ⅱ期與Ⅲ期之間、TPX2在Ⅰ期與IV期的食管癌患者之間的表達量是有顯著差異的,而其它各期之間的p值均大于0.05,因此基因表達量無顯著差異.

圖14 臨床相關性分析圖Fig.14 Clinical correlation analysis

利用HPA數據庫獲取MCM2基因在正常組織(圖15a)和食管癌組織(圖15b)中的免疫組化圖片,圖像顯示MCM2在正常組織中呈現低等強度染色,染色細胞占比小于25%,在食管癌組織中呈現中等強度染色,染色細胞占比為25%～75%.這表明MCM2的表達在食管癌組織中顯著上調.

a. 正常組織; b.食管癌組織圖15 正常組織與食管癌組織的免疫組化圖Fig.15 Immunohistochemical images of normal tissue and esophageal cancer tissue

2.7 茯苓水煎液對關鍵基因表達量影響

對篩選到的CDK1、CHAF1A、DLGAP5、TPX2、TPIP13和MCM2等6個候選靶點基因進行RT-PCR定量表達分析,結果如圖16所示,CDK1、CHAF1A、TPIP13和MCM2基因經不同濃度的茯苓水煎液處理后,表達量與對照存在顯著差異(p< 0.05),其中CDK1、CHAF1A和TPIP13經高濃度的茯苓水煎液處理后表達量顯著增加,而DLGAP5和TPX2表達量變化差異不明顯,但MCM2經不同濃度的茯苓水煎液處理后表達量隨著茯苓水煎液濃度先升高后降低.結果進一步顯示CDK1、CHAF1A、TPIP13和MCM2是茯苓水煎液治療食管癌的主要作用靶點.

注:不同小寫字母表示差異達到顯著水平(p< 0.05),相同字母則表示無統計學差異.圖16 茯苓水煎液對關鍵基因表達量影響Fig.16 Effect aqueous extract from Poria cocos to key gene expression

3 小結與討論

本研究利用TCMSP數據庫檢索出茯苓的有效活性成分,其中OB、DL值最高的是去氫齒孔酸,故去氫齒孔酸可能是茯苓發揮功效的核心活性成分.另外對有效活性成分對應的作用靶點進行研究,共獲得其作用靶點17個,按MCC排序,最終篩選出6個候選藥物作用靶點:CHRM1、NCOA2、PGR、ADRA1B、ADH1B和PTGS2,其中ADHIB被認為是茯苓抗食管癌的潛在作用靶點.ADH1B是乙醇脫氫酶,已有研究表明,ADH1B基因的多態性與食管癌的發病風險有關,ADH1B在乙醇轉化為乙醛的代謝途徑中起著關鍵作用,攜帶ADH1BAA基因型的人,其編碼的

乙醇脫氫酶活性較高,乙醇較容易被轉換為乙醛.研究發現,茯苓可能是通過其有效活性成分增加ADH1B的活性,從而增強人體抵抗力,抑制食管癌腫瘤細胞的生長.

本研究基于差異表達分析和WGCNA探討食管癌發生發展相關的核心基因.通過對差異基因進行GO富集分析發現,這些基因主要參與細胞核分裂、有絲分裂細胞周期的G2/M期轉換、細胞器分裂等生物學過程,主要與3′→5′脫氧核糖核酸解旋酶活性、微管結合、單鏈DNA結合等分子功能有關,主要影響有絲分裂紡錘體、微管、驅動蛋白復合物等細胞組分.KEGG富集分析結果表明,29個食管癌相關基因富集最顯著的通路是細胞周期代謝通路,在該通路中,食管癌相關基因MCM2是S期內啟動DNA復制的重要因子,CDK1在G2/M期轉換起著重要的調控作用,它們通過控制細胞周期運轉,防止細胞增殖失控,甚至細胞癌變.本研究根據Cytoscape中的插件CytoHubba計算每個節點的MCC值,篩選出前10個核心基因:DLGAP5、MCM2、CCNA2、CDK1、TPX2、TRIP13、KIF23、KIF2C、CENPF和CHAF1A,其中MCM2的低表達與食管癌患者的總生存期惡化顯著相關;DFS分析發現CHAF1A的低表達與食管癌患者的無病生存期惡化顯著相關.同時,臨床相關性分析發現CDK1、CHAF1A、DLGAP5、TPX2和TPIP13表達量在Ⅰ期與Ⅱ期的食管癌患者之間的表達量存在顯著差異.CHAF1A是染色體組裝因子,它能夠調控DNA修復和細胞增殖[19].李雪玲等[20]研究發現,CHAF1A在多種腫瘤中均高表達,其中包括食管癌,并可能是影響肺癌、肝細胞癌和乳腺癌預后的治療靶點.MCM2是微小染色體維持蛋白2,位于細胞核當中,具有調控DNA復制的功能.目前它已被視作S期內部檢驗點激活的重要因子、特異性增殖相關因子, 且被認為是癌前標記[21].本研究分別對TCGA-ESCA和GSE22954數據集進行差異表達分析,分析結果均顯示CHAF1A和MCM2在食管癌樣品中顯著上調;生存分析結果顯示,CHAF1A和MCM2的低表達水平與食管癌患者的預后不良有關;臨床相關性分析提示MCM2從Ⅱ期到Ⅲ期的表達量顯著下降,而CHAF1A從Ⅰ期到Ⅱ期表達量顯著上升.Zhong等[22]通過食管鱗癌GEO數據庫和TCGA數據庫比對發現MCM2 與總體生存無相關性.因此MCM2和CHAF1A可能是影響食管癌預后的治療靶點,同時也是影響食管癌分期的靶點.本研究結果可能為食管癌的早期篩查與靶向治療提供重要參考.