piRNA-001184在多發性骨髓瘤中的表達及其與CTGF、CDKN2A基因甲基化的相關性研究

王志紅，賈國榮

piRNA-001184在多發性骨髓瘤中的表達及其與CTGF、CDKN2A基因甲基化的相關性研究

王志紅1，賈國榮2

1.內蒙古科技大學包頭醫學院研究生學院，內蒙古包頭 014010；2.內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院血液內科，內蒙古包頭 014017

探討piRNA-001184在多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）中的表達及其與CTGF、CDKN2A基因甲基化的相關性。選取2020年8月至2022年12月于內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院就診的69例MM患者納入實驗組，收集同期18例缺鐵性貧血患者納入對照組。應用熒光定量聚合酶鏈反應檢測患者的piRNA-001184表達水平，采用Pearson線性相關分析piRNA-001184與CTGF、CDKN2A表達水平的相關性。實驗組患者的piRNA-001184表達水平顯著高于對照組[（21.56±6.19）（10.60±2.45），=7.388，<0.001]。不同病程患者的piRNA-001184表達水平比較差異有統計學意義（=110.977，<0.001），表達水平依次為初發組>復發組>緩解組。不同國際分期系統（international staging system，ISS）患者的piRNA-001184表達水平比較差異有統計學意義（<0.05），表達水平依次為Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期。piRNA-001184表達水平與CTGF、CDKN2A基因表達水平均呈正相關（<0.05）。MM患者piRNA-001184表達明顯上調。監測piRNA-001184可能對MM的診斷、分期及預后判斷有參考價值。

多發性骨髓瘤；piRNA-001184；DNA甲基化

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種漿細胞克隆性增殖性疾病，是來源于終末分化的B淋巴細胞的血液系統惡性腫瘤。目前其發病機制仍未明確，研究證實DNA異常甲基化及非編碼RNA異常表達在MM中普遍存在[1-2]。DNA甲基化可在啟動子區域的CpG島起抑制抑癌基因失活的作用，從而導致癌癥發生，而Piwi相互作用RNA（Piwi-interacting RNA，piRNA）可通過下調腫瘤抑制因子參與腫瘤的發生[3-4]。研究發現DNA甲基轉移酶在MM中表達上調，而piRNA在MM中參與調節DNA甲基轉移酶進一步促進DNA發生甲基化修飾[5-6]。本研究探索MM患者piRNA-001184表達水平及其與CTGF、CDKN2A基因甲基化水平的相關性，為MM的診斷、分期、治療及預后提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2020年8月至2022年12月于內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院就診的69例MM患者納入實驗組，收集同期18例缺鐵性貧血患者納入對照組。納入標準：患者的性別、年齡不限，MM的診斷符合《中國多發性骨髓瘤診治指南（2020年修訂）》[7]相關標準，缺鐵性貧血診斷符合《血液學診斷及診療標準》（第3版）推薦的診斷標準[8]。排除標準：①存在嚴重感染；②合并消化道腫瘤或其他腫瘤。其中實驗組患者男36例，女33例，國際分期系統（international staging system，ISS）Ⅰ期40例，Ⅱ期19例，Ⅲ期10例。對照組患者男8例，女10例。根據病程和預后又將實驗組患者分為初發組（新診斷、未治療的MM患者，18例）、緩解組（療效達到完全緩解的MM患者，9例）和復發組（癥狀性復發的MM患者，42例）。收集所有患者的骨髓血5ml，標本收集均獲得患者同意并簽署知情同意書，本研究經內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院倫理學委員會審核通過。

1.2 主要實驗儀器及試劑

實時定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（百源ASA－9600）；Ⅱ-2型生物安全柜（珠海再鑫儀器有限公司）；XiangYiH-1850R高速低溫離心機（長沙湘儀儀器有限公司）。用Trizol法提取RNA；逆轉錄試劑盒及熒光定量試劑盒均購自北京天根生化公司：miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit miRcute增強型 miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒50 rxn（KR211-02）、miRcute Plus miRNA qPCR Kit（SYBR Green）miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒20ulx500rxn（FP411-02）；piRNA-001184引物及hsa-U6檢測引物由北京天根生化公司設計合成；瓊脂糖、5%TBE緩沖液及good view（核酸染料）均購自北京天根生化公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 RNA提取 提取兩組患者的2ml骨髓血，利用Trizol法提取RNA，以供逆轉錄使用。

1.3.2 RNA逆轉錄為cDNA 根據逆轉錄試劑盒說明配制試劑，每次加入1.5μl RNA提取液，反應條件：42℃ 60min（miRNA加A尾反應及逆轉錄反應）、95℃ 3min（酶失活反應），合成的cDNA直接進行下游熒光定量檢測或放置于–20℃保存。

1.3.3 熒光定量PCR反應 根據熒光定量檢測試劑盒配制反應體系，每次加入1μl cDNA溶液及0.4μl piRNA-001184引物溶液。反應條件：95℃起始模板變性15min一個循環，然后94℃ PCR循環中模板變性、20s、60℃ 34s退火及延伸，共42個循環。以U6為內參。piRNA-001184引物序列：-ATTACCAA GGATTTATTGGATCTTCTTG-。計算piRNA-001184相對表達水平。

1.3.4 瓊脂糖凝膠電泳 配制瓊脂糖凝膠，將制成的凝膠電泳板放入電泳槽中，依次加入4μl PCR產物，電壓110V的條件下電泳40min。

1.4 CTGF、CDKN2A基因表達水平與piRNA-001184表達水平的相關性

根據本課題組前期實驗結果[9]，分析在同一MM樣本中CTGF、CDKN2A基因表達水平與piRNA-001184表達水平的相關性。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析?；驒z測結果用相對定量△CT值（△CT值=目的基因CT值–內參基因CT值）表示，兩組比較采用獨立樣本檢驗，三組比較采用單因素方差分析，三組間兩兩比較采用LSD-檢驗。相關性分析采用Pearson線性相關分析。<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者的piRNA-001184表達水平比較

實驗組患者的piRNA-001184表達水平顯著高于對照組[（21.56±6.19）（10.60±2.45），=7.388，<0.001]。

2.2 不同病程患者的piRNA-001184表達水平比較

不同病程患者的piRNA-001184表達水平比較差異有統計學意義（=110.977，<0.001），piRNA-001184表達水平依次為初發組>復發組>緩解組，見圖1。

圖1 三組患者的piRNA-001184表達水平比較

注：與初發組比較，*<0.05；與緩解組比較，#<0.05

2.3 不同ISS分期患者的piRNA-001184表達水平比較

不同ISS分期患者的piRNA-001184表達水平比較差異有統計學意義（<0.05），piRNA-001184表達水平依次為Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期，見圖2。

圖2 不同ISS分期患者的piRNA-001184表達水平比較

注：與Ⅰ期比較，*<0.05；與Ⅱ期比較，#<0.05

2.4 piRNA-001184表達水平與CTGF、CDKN2A基因表達水平的相關性

不同病程患者的CTGF、CDKN2A基因表達水平比較差異均有統計學意義（<0.05），見表1。piRNA-001184表達水平與CTGF、CDKN2A基因表達水平均呈正相關（<0.05），見圖3、圖4。

表1 不同病程患者的CTGF、CDKN2A基因表達水平比較

圖3 piRNA-001184與CTGF基因表達水平的相關性分析

圖4 piRNA-001184與CDKN2A基因表達水平的相關性分析

3 討論

目前MM的發病率逐年升高，盡管化學藥物及靶向藥物的不斷問世使MM的治療方案有所優化，但MM仍是一種無法治愈的疾病[10]。研究發現，piRNA可通過下調腫瘤抑制因子參與腫瘤的發生，如其在不同分型的大腸癌、肺腺癌、腎母細胞癌、胃癌、肝癌等實體腫瘤中異常表達，為腫瘤的診斷及治療提供新的參考價值[10-13]。研究發現在MM患者中不僅檢測到piRNA-823及其他類型piRNA的異常表達，且發現其可促進DNA發生甲基化修飾[14-16]。本研究發現，實驗組患者的piRNA-001184表達水平明顯高于對照組，說明piRNA-001184在MM發病機制中發揮一定作用。同時發現不同病程MM患者的piRNA-001184表達水平比較差異有統計學意義，依次為初發組>復發組>緩解組，初發患者的腫瘤負荷較緩解及復發者高，提示在MM患者中piRNA-001184表達水平與腫瘤負荷相關。ISS分期是在β2微球蛋白及血清白蛋白基礎上對MM的國際預后分期，對評判MM預后及腫瘤負荷有重要作用。本研究發現隨著ISS分期的增加，MM患者的piRNA-001184表達上調，提示piRNA-001184對MM的預后不良及腫瘤負荷有影響。本課題組前期實驗發現MM患者存在CTGF、CDKN2A啟動子區域異常甲基化[9]，且不同病程中CTGF、CDKN2A表達水平存在差異。本研究表明piRNA-001184與CTGF、CDKN2A表達水平均呈正相關。推測MM患者piRNA-001184的異常表達可能對DNA甲基化水平有影響，進而預測piRNA-001184的抑制劑或激動劑可能在MM的去甲基化藥物治療方面發揮作用。本研究關于piRNA-001184與CTGF、CDKN2A基因甲基化的聯系只進行統計學分析，并未進一步通過體外細胞實驗進行論證，接下來還需進一步研究驗證。

綜上，piRNA-001184在MM的診斷、治療及預后方面具有一定的參考價值，可為MM患者提供新的診療方案。

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Expression of piRNA-001184 in multiple myeloma and its correlation with CTGF, CDKN2A gene methylation

WANG Zhihong, JIA Guorong

1.Graduate School of Baotou Medical College, Inner Mongolia University of Science and Technology, Baotou 014010, Inner Mongolia, China; 2.Department of Hematology, the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College of Inner Mongolia University of Science and Technology, Baotou 014017, Inner Mongolia, China

To investigate the expression of piRNA-001184 in multiple myeloma (MM) and its correlation with CTGF, CDKN2A gene methylation.Sixty-nine MM patients treated in the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College of Inner Mongolia University of Science and Technology from August 2020 to December 2022 were included in experimental group, and 18 patients with iron deficiency anemia were included in control group during the same period. The expression level of piRNA-001184 was detected by fluorescence quantitative polymerase chain reaction, and the correlation between piRNA-001184 and the expression level of CTGF and CDKN2A was analyzed by Pearson linear correlation analysis.The expression level of piRNA-001184 in experimental group was significantly higher than that in control group [(21.56±6.19)(10.60±2.45),=7.388,<0.001]. There was statistical significance in expression level of piRNA-001184 in patients with different disease course (=110.977,<0.001), and the expression level was in initial onset group > relapse group > remission group. The expression level of piRNA-001184 in patients with different international staging system (ISS) was significantly different (<0.05), and the expression level was in stage Ⅰ< stage Ⅱ< stage Ⅲ. The expression level of piRNA-001184 was positively correlated with that of CTGF and CDKN2A genes (<0.05).The expression of piRNA-001184 was significantly up-regulated in MM patients. Monitoring piRNA-001184 may have reference value for the diagnosis, staging and prognosis of MM.

Multiple myeloma; piRNA-001184; DNA methylation

R733.3

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.31.006

內蒙古自治區高等學?？茖W研究項目（NJZY21075）

賈國榮，電子信箱：Jgr2178372@163.com

（2022–12–28）

（2023–10–15）