基于網絡藥理學探討健脾益腎化濁方治療多囊卵巢綜合征的作用機制*

李玲義，馮亞宏，張曉靜，馬梅香

1 甘肅中醫藥大學 甘肅蘭州 730030

2 寧夏回族自治區中醫醫院暨中醫研究院 寧夏銀川 750021

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是發生在青少年女性及育齡期婦女的一組癥候群，以高雄激素、排卵障礙、卵巢多囊樣改變為特征[1]。其中醫病因病機關及到肝脾腎等多臟腑，西醫具體病理機制至今仍不十分清楚。近期臨床表現主要為稀發排卵或無排卵引起的月經后錯，甚至閉經、不孕，伴有不同程度的高雄激素血癥（肥胖、多毛、痤瘡、黑棘皮癥）以及糖脂代謝紊亂（肥胖、血脂血糖異常）；遠期影響主要為長期的血糖、血脂代謝障礙而出現糖尿病、高血壓、心腦血管疾病等繼發疾病，持續偏高的雌激素水平還可導致子宮內膜癌、乳腺癌的發生。

健脾益腎化濁方是寧夏回族自治區中醫醫院暨中醫研究院婦科名家王淑斌主任及導師馮亞宏主任根據多年臨床經驗，沿襲經方二仙湯、蒼附導痰丸和四君子湯化裁而成，方中以黃芪、黨參健脾益氣，仙茅、淫羊藿補腎壯陽助氣化，同時溫化脾陽，四藥合為君藥；白術益氣健脾以利水，茯苓健脾利水以滲濕，菟絲子、桑寄生補腎益氣，為臣藥；蒼術、荷葉健脾化濕，香附行三焦之氣，并引諸藥入肝經，陳皮行氣調中，燥濕化痰，為佐藥[2]。在臨床跟師學習過程中總結，發現老師在臨床診治肥胖型PCOS 從“脾腎兩虛、痰濕內聚”立論，以“健脾益腎、化痰祛濁”為法，治療PCOS療效頗佳。課題組前期臨床觀察已證實[3]，此方治療PCOS 療效可觀，動物實驗進一步驗證健脾益腎化濁方治療PCOS 的作用機制可能是通過抑制NLRP3 炎癥小體的激活，減少卵巢組織中炎性因子的釋放，有效減輕 PCOS 炎癥狀態，改善卵巢功能，調節生殖內分泌水平[4]，筆者想通過網絡藥理學進一步探討其他作用機制。

現臨床上中醫藥因可選擇性大、靈活多樣而成為治療多囊的更優選擇，2018 年《多囊卵巢綜合征中國診療指南》[5]首次將中醫治療寫入PCOS 患者治療指南當中，這也說明中醫治療PCOS 確實有效。但中醫藥活性成分復雜，作用機制不明確，闡明中藥藥理作用和分子機制仍存在一定困難。網絡藥理學是一門多學科、多中心綜合的新型學科，能夠對中藥活性成分、作用靶點及作用機制進行預測分析，為中醫藥現代化提供理論依據，有利于中醫藥在臨床治療過程中的科學化。因此，本研究想通過網絡藥理學，探討健脾益腎化濁方治療PCOS 的可能機制，以冀為臨床中醫藥治療PCOS 提供理論依據。現將研究結果總結如下。

資料與方法

1 健脾益腎化濁方活性成分的篩選及有效成分對應靶點的篩選

通過TCMSP 數據庫[6]：以黃芪、白術、黨參、茯苓、淫羊藿、仙茅、菟絲子、桑寄生、陳皮、蒼術、荷葉、香附12 味中藥為關鍵詞，檢索各中藥的活性成分。由于中藥成分復雜多樣，組方藥物較多，故需要對中藥成分進行條件篩選，生物利用度（OB）和類藥性（DL）是網絡藥理學中藥活性成分篩選的重要影響因素，因此，選取同時滿足OB ≥30%、DL ≥0.18 篩選該方的活性成分。進一步篩選各活性成分的作用靶點，去除無明確作用靶點的活性成分。應用Uniport 蛋白數據庫對各中藥的作用靶點進行人類蛋白基因匹配。

2 PCOS 相關靶點的篩選

通 過Gene Cards 數 據 庫[7]：以“polycystic ovary syndrome or PCOS”為關鍵詞檢索與PCOS 相關的疾病蛋白。

3 健脾益腎化濁方與PCOS 交集靶基因的篩選及相互關系（PPI）網絡的構建

通過venny2.1.0 對組方潛在活性成分靶基因和PCOS 相關靶基因制作韋恩圖。用excel 數據處理中藥與疾病的交集基因。將交集基因導入String 數據庫，構建PPI 網絡圖，設置基因來源為人類，置信度為0.9。對String 數據庫中的TSV 文件導入Cytoscape3.9.0 進行可視化分析。

4 交集靶基因的GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

將組方靶基因和PCOS 相關靶基因的交集基因通過Meta scape 數據庫進行GO 功能富集和KEGG 信號通路分析并利用微生信作圖將結果可視化分析。

結 果

1 健脾益腎化濁方活性成分的篩選及有效成分對應靶點的篩選

通過TCMSP 數據庫進行檢索，篩選健脾益腎化濁方活性成分122 種，其中黃芪17 種，白術4 種，黨參16 種，茯苓6 種，淫羊藿23 種，仙茅6 種，菟絲子9種，桑寄生2 種，陳皮5 種，蒼術4 種，荷葉14 種，香附16 種，通過Cytoscape3.9.0 軟件構建活性成分網絡圖，見圖1。對有明確作用的靶點通過Uniport 蛋白數據庫進行人類蛋白匹配后導入Cytoscape3.9.0 軟件構建中藥-活性成分-基因靶點網絡圖，見圖2。

圖1 組方活性成分網絡

圖2 中藥-活性成分-基因靶點網絡

2 健脾益腎化濁方與PCOS 交集靶基因的篩選及相互關系（PPI）網絡的構建

檢索Gene Cards 數據庫中PCOS 相關疾病基因1297 個，與組方活性成分靶基因254 個，通過venny2.1.0 在線工具制作韋恩圖，見圖3。再通過excel 數據處理，取中藥組方與疾病的交集基因。將交集基因導入String 數據庫，構建PPI 網絡圖，見圖4。設置置信度0.9，其余設置均為默認設置，PPI 分析：有116 個節點，451 條線，平均節點的度值7.78，平均局部聚類系數0.44。點的連接條數越多表示關聯越大。將交集基因String 數據庫中的TSV 文件導入Cytoscape3.9.0，利用插件Cyto NCA 進行可視化分析，結果見圖5。圖中每個顏色代表一個基因靶點，節點顏色表示度值，度值越大，顏色越深，由黃到綠，圖標也越大。圖中顯示健脾益腎化濁方治療PCOS 排在前十位的靶點有MAPK1、MAPK3、AKT1、TP53、TNF、MAPK14、IL6、ESR1、EGRF、RB1，這些靶點可能是治療PCOS 的關鍵基因。

圖3 疾病靶點Venn

圖4 PPI 網絡

3 交集靶基因的GO 富集分析

通過Meta scape 數據庫：對健脾益腎化濁方治療PCOS 的交集靶點進行GO 富集分析，包括生物過程、細胞成分和分子功能3 個方面的分析。將從數據庫下載的GO.csv 文件通過excel 進行處理，分別選取前20 位GO 條目，結果顯示健脾益腎化濁方治療PCOS主要靶點的生物過程（BP）主要富集在激素、脂質細胞、無機物質、外來刺激、類固醇激素脂多糖、細胞凋亡、細胞群體增殖、代謝和分解過程等的調控；細胞組成（CC）主要富集在內質網膜、膜蛋白、滑面內質網、細胞外基質、細胞質等；分子功能（MF）主要富集在蛋白質結合、酶結合、生長因子結合、細胞因子活性、MAP 激酶活性、腫瘤壞死因子等。再借助微生信在線網站作GO 富集BP、CC、MF 三合一圖，見圖6。

圖6 GO 富集BP、CC、MF

4 交集靶基因的KEGG 富集分析

通過Meta scape 數據庫：對健脾益腎化濁方治療PCOS 的交集靶點進行KEGG 富集分析，將下載的KEGG.csv 文件通過excel 進行處理，選取前20 位為主要信號通路如癌癥通路、AGE-RAGE 信號通路、雌激素信號通路、IL-18、IL-13、IL-4 信號通路、PI3KAkt 信號通路、細胞因子信號通路等，見表1。再借助微生信在線網站作KEGG 富集氣泡圖，見圖7。

表1 KEGG 通路富集分析結果

圖7 KEGG 富集氣泡

討 論

PCOS 作為一種高度異質性疾病，發病率正在呈逐年增長的趨勢，西醫具體病理機制至今仍不十分清楚。但目前臨床公認其發病與胰島素抵抗、糖脂代謝異常、高雄激素有關，且高糖高脂-胰島素抵抗-高雄激素之間是一個惡性循環的過程。長期高糖高脂可導致胰島素抵抗，當發生胰島素抵抗時，卵巢分泌雄激素增多，導致血液中雄激素增加，生成高雄激素血癥，而升高的雄激素反過來又能導致高胰島素血癥[8]。有文獻表明，PCOS 婦女中發生糖代謝異常率為24.5%[9]，血脂異常發生率為24.7%[9]，高雄激素占PCOS 患者的75%[10]，胰島素抵抗發生率占肥胖PCOS的75%[11]。臨床西醫治療主要為改善生活方式、調節飲食結構、降雄、改善胰島素抵抗、降糖降脂等對癥治療[12]。中醫對其治療主要包括分型論治、中成藥、周期療法、針灸治療等[13]。

本研究通過對健脾益腎化濁方治療PCOS 進行網絡藥理學分析，主要從組方的活性成分、作用靶點、信號通路等方面進行探討，得到健脾益腎化濁方的潛在活性成分有槲皮素、山奈酚、植物甾醇、木犀草素、異鼠李素等，可能通過絲裂原活化蛋白激酶受體（MAPK1、MAPK3、MAPK14）、蛋白激酶（AKT1）、白介素受體（IL-6）、腫瘤抑制因子（TP53）、腫瘤壞死因子（TNF）、雌激素受體（ESR1）等多靶點，可以作用于AGE-RAGE 信號通路、雌激素信號通路、炎癥信號通路、PI3K-Akt 信號通路、癌癥通路、細胞因子信號通路等多通路發揮治療PCOS 的作用。

首先，從TCMSP 數據庫篩選后，健脾益腎化濁方的潛在活性成分主要有槲皮素（MOL000098）、山奈酚（MOL000422）、植物甾醇（MOL000359）等，組方共同活性成分結果，見表2。

表2 組方共同成分

健脾益腎化濁方的潛在活性成分可能發揮的治療作用分析如下：槲皮素是一種黃酮類化合物，它可能具有抗炎和抗氧化特性[14]。王針織通過動物實驗證實[15]，槲皮素可能通過抑制TLR/NF-κB 信號通路，改善多囊卵巢胰島素抵抗微環境炎癥，從而逆轉胰島素抵抗。有文獻進一步表述[16]，槲皮素有上述作用。因此，槲皮素是一個潛在的，對胰島素抵抗有較好治療效果的藥物。山奈酚也是一種廣泛存在于自然界的黃酮類化合物[17]，其生物活性主要為抗炎、抗氧化以及抗癌[18]。植物甾醇及其衍生物具有降血糖、調血脂、降膽固醇、抗腫瘤、抗炎、抗氧化和預防心血管疾病等生理活性[19]，而糖脂代謝紊亂是PCOS 重要的病理改變。木犀草素也是黃酮類化合物，具有抗氧化，抗炎，抗糖尿病等作用，可以通過調控PI3K/Akt 通路抑制IR[20]。綜上所述，健脾益腎化濁方中篩選出來的潛在活性成分可通過調節糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗、卵泡發育等發揮治療PCOS 的作用。

另外，PCOS 患者因糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗、高雄激素血癥，機體長期處于慢性炎癥或氧化應激狀態[21]。從關鍵靶點分析，IL-6 是人體多種細胞分泌的一種多肽物質，作用于機體免疫、內分泌和心血管等多系統，是參與機體各種調節的重要因子。首先，IL-6 作為一種炎癥標志物，在PCOS 的發病過程中有著多方面影響[22]。另外，PCOS 患者的血清IL-6 水平與糖脂代謝有關[23]，血清IL-6 水平與BMI 呈正相關，且IL-6 主要與IR 有關[24]。MAPK 是一類進化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，能將細胞外刺激轉化為廣泛的細胞反應從而參與增殖、分化、遷移、凋亡等多種細胞功能[25]。本研究顯示，MAPK1、MAPK3、MAPK14 都是排在前十位的關鍵靶點，MAPK3 又叫細胞外信號調節激酶1（ERK1），ERK1 和ERK2 在 功 能 上 相 似[26]；MAPK14 是MAPK家族中最豐富，最具特征的重要成員，在多種腫瘤中高度表達，如乳腺癌、卵巢癌[27]。

KEGG 富集分析顯示，AGE-RAGE 信號通路、雌激素信號通路和PI3K-Akt 信號通路是健脾益腎化濁方發揮治療PCOS 的主要通路，其中AGE-RAGE 信號通路和PI3K-Akt 信號通路均與胰島素抵抗有關。研究表明，大約50%～70%患有PCOS 的女性有一定程度的胰島素抵抗[28]。PI3K-Akt 作為胰島素信號轉導的主要通路，具有調節控制機體中的葡萄糖吸收、糖原降解和合成的作用，增強PI3K/Akt 信號通路的表達可減輕胰島素抵抗。AGE-RAGE 信號通路是一個和糖尿病（DM）及其并發癥聯系相當密切的通路[29]，AGEs 為糖基化終末產物（advanced glycosylation end products），RAGE 屬于細胞表面免疫球蛋白超家族多配體受體成員，若兩者結合，可以激活并促進炎性反應、氧化應激，最終導致IR 及DM 其他并發癥的發生[29]。本研究結果得出的關鍵靶點在內分泌拮抗通路上顯著富集，表明健脾益腎化濁方可通過多靶點調節PCOS 患者內分泌穩態從而發揮治療作用。

綜上所述，推測健脾益腎化濁方的活性成分、關鍵靶點、信號通路可能以“多成分-多靶點-多通路”調節糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗、卵泡發育等方面發揮治療PCOS 的作用。后續本課題組將對其活性成分及具體機制進行深入探討，以期為健脾益腎化濁方在臨床治療中的辨證用藥提供科學依據。