有氧運動抑制炎癥反應改善ApoE-/-動脈粥樣硬化小鼠心肌纖維化機制研究

秦芳，馬甜甜，于子夫，劉西花

1.250355 山東省濟南市，山東中醫藥大學康復醫學院

2.250014 山東省濟南市，山東中醫藥大學附屬醫院康復科

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是腦梗死、冠心病等多種心腦血管疾病的病理基礎，其發病機制與脂質代謝、氧化應激及炎癥反應之間復雜的相互作用有關［1］。研究表明，AS發展過程中存在心肌纖維化等心肌改變，進而使心肌適應能力下降，導致心室收縮和舒張功能異常，最終引發心力衰竭等嚴重心血管?。?］。因此抑制AS、限制心肌纖維化的進程對預防患者發生心力衰竭等心血管事件具有重要意義。心肌纖維化的發病機制復雜多樣，受到多種因素的調節和控制，其中炎癥反應和氧化應激是重要的發病機制［3］。長期AS導致缺血和缺氧的環境使炎癥因子釋放增多，激活轉化生長因子β1（TGF-β1）信號通路，加速了促纖維化作用的TGF-β1的釋放。同時，AS發生發展過程中，miR-132誘發細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成會影響心肌細胞的收縮機制，同時還介導巨噬細胞和成纖維細胞之間的相互作用，導致組織氧化應激損傷，此為心肌纖維化的關鍵因素［4-6］。

有規律的運動已被證明可以預防心血管疾病，改善心臟功能，緩解心肌纖維化，并加強防止心肌細胞損傷的機制［7-8］。既往研究表明，長期低強度的體育鍛煉可以改善心力衰竭大鼠的心肌纖維化［9］。但是有氧運動改善AS心肌纖維化具體分子學機制的研究尚不全面，其改善機制是否與減輕炎癥反應及發揮抗氧化作用有關目前研究較少。為此，本研究基于動物模型，探討有氧運動改善AS心肌纖維化的作用以及對炎性因子的影響，旨在為有氧運動改善AS小鼠心肌纖維化的作用機制提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究時間

2022年2—8月。

1.2 實驗材料

1.2.1 實驗動物 選取27只8周齡的雄性ApoE-/-小鼠（20～24 g）作為實驗對象，購自中國科學院實驗動物中心（中國上海），許可證號［SCXK（京）2019-0008］。所有小鼠適應性飼養1周，溫度為（22±1）℃，濕度為45%～55%，光照/黑暗周期為12 h，自由飲水和飲食。本研究通過了山東中醫藥大學附屬醫院倫理委員會批準（AWE-2022-004）。

1.2.2 主要試劑與儀器 NOD受體3（NLRP3）抗體（沈陽萬類生物科技有限公司，貨號：WL02635）；TGF-β1抗體（沈陽萬類生物科技有限公司，貨號：WL02193）；白介素（IL）-1β抗體（沈陽萬類生物科技有限公司，貨號：WL00891）；β-actin（沈陽萬類生物科技有限公司，貨號：WL01372）；超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（沈陽萬類生物科技有限公司，貨號：WLA110）；谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）試劑盒（沈陽萬類生物科技有限公司，貨號：WLA107）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（沈陽萬類生物科技有限公司，貨號：WLA004）；蘇木素（北京索萊寶科技有限公司，貨號：H8070）；超速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號：H-2050R）；顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號：BX53）；石蠟切片機（德國Leica儀器有限公司，型號：RM2235）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組：將小鼠隨機分為對照組、模型組和有氧運動組，每組9只。

1.3.2 AS小鼠模型制備：模型組和有氧運動組小鼠飼以12周“西方類型”膳食飼料（21%脂肪，0.15%膽固醇）建立AS模型，對照組以普通飼料喂養12周。

1.3.3 運動訓練方案：模型組和對照組小鼠不進行運動訓練，有氧運動組小鼠在小動物跑臺上進行遞增運動強度及時間的耐力性運動，參考基因缺陷小鼠的運動量標準［10］。跑臺坡度設置為0，前4周的運動量由10 m/min、30 min/d逐漸增加至13 m/min、60 min/d，剩余8周的運動量為13 m/min，60 min/d。運動5次/周，與建模同時進行，連續運動12周。

1.3.4 Masson染色：將心肌組織進行Masson染色，包埋、切片脫蠟至水，滴加蘇木素染液、麗春紅酸性品紅液，使染液完全覆蓋組織染漿。以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，再向每張切片組織上滴加1%磷鉬酸水溶液分化。用苯胺藍復染后脫水、透明、封片，于顯微鏡下觀察染色效果，400×鏡下拍照。

1.3.5 蘇木素-伊紅（HE）染色：石蠟切片脫蠟后用蘇木素染色3～5 min，自來水洗凈后進行分化處理，再次自來水洗后進行返藍處理，之后再次流水沖洗，切片脫水后入伊紅染液染色5 min。在顯微鏡下觀察染色效果。

1.3.6 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測心肌組織NLRP3、IL-1β、TGF-β1：取小鼠新鮮心肌組織，以低溫冷凍離心法提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，以RIPA裂解液調整蛋白樣本終濃度為2mg/mL。配制5%濃縮膠和14%分離膠，每孔上樣40 μg蛋白（20 μL），電泳2.5 h，轉膜1.5 h，用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h后，抗NLRP3（1∶500稀釋）、抗IL-1β（1∶1 000稀釋）、抗TGF-β1（1∶400稀釋），室溫孵育45 min，以肌動蛋白（β-actin）為內參，分析各電泳帶灰度值。將膠片進行掃描，用Gel-Pro-Analyzer處理軟件分析目標條帶的光密度值。

1.3.7 試劑盒檢測SOD和GSH-Px表達量：準確稱取心肌組織重量，按重量（g）∶體積（mL）=1∶9加入0.9%氯化鈉溶液，冰水浴條件下機械勻漿，2 500 r/min離心10 min，半徑15 cm，取上清液按照試劑盒說明步驟測定SOD和GSH-Px表達量。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Masson染色

心肌內膠原纖維被苯胺藍染成藍色，肌纖維被酸性品紅和麗春紅染成紅色。對照組心肌組織紅潤，藍染面積小；模型組心肌組織纖維化較對照組明顯加重；有氧運動組心肌組織纖維化較模型組明顯改善，見圖1。

圖1 心肌組織Masson染色結果（400×）Figure 1 Results of Masson staining of myocardial tissue

2.2 HE染色

HE染色結果顯示，對照組小鼠心肌細胞排列整齊，細胞形態、大小、間隙正常，細胞核分布均勻；模型組小鼠心肌細胞排列較錯亂，細胞形態、大小異常，細胞間隙增大，存在炎性細胞浸潤；有氧運動組小鼠心肌細胞排列尚整齊，細胞形態、大小異常，細胞間隙基本正常，見圖2。

圖2 HE染色心肌組織形態變化（400×）Figure 2 HE staining results of morphological changes in heart tissues

2.3 3組小鼠心肌組織Western blotting檢測結果

3組小鼠心肌組織中NLRP3、IL-1β、TGF-β1蛋白比較，差異有統計學意義（P＜0.05），組間比較結果顯示，模型組NLRP3、IL-1β、TGF-β1蛋白表達高于對照組，有氧運動組NLRP3、IL-1β、TGF-β1蛋白表達低于模型組、高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1、圖3。

表1 3組小鼠心肌組織中NLRP3、IL-1β、TGF-β1蛋白表達情況（±s）Table 1 Expression of NLRP3，IL-1β，TGF-β1 protein in myocardial tissue of 3 groups of mice

表1 3組小鼠心肌組織中NLRP3、IL-1β、TGF-β1蛋白表達情況（±s）Table 1 Expression of NLRP3，IL-1β，TGF-β1 protein in myocardial tissue of 3 groups of mice

注：NLRP3=NOD受體3，IL-1β=白介素1β，TGF-β1=轉化生長因子β1；a表示與對照組比較P＜0.05，b表示與有氧運動組比較P＜0.05。

組別只數NLRP3IL-1βTGF-β1對照組91.123±0.1101.136±0.1191.162±0.184模型組95.741±0.220ab6.447±0.524ab7.906±0.658ab有氧運動組92.851±0.279a3.724±0.140a2.624±0.244a F值353.02201.52215.98 P值＜0.001＜0.001＜0.001

2.4 3組小鼠心肌組織SOD和GSH-Px表達量

3組小鼠心肌組織中SOD、GSH-Px表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05），組間比較結果顯示，模型組SOD、GSH-Px表達量低于對照組，有氧運動組SOD、GSH-Px表達量高于模型組、低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 3組小鼠心肌組織SOD、GSH-Px表達量比較（±s，U/mg）Table 2 Comparison of SOD and GSH-Px expression in myocardial tissue of mice in 3 groups

表2 3組小鼠心肌組織SOD、GSH-Px表達量比較（±s，U/mg）Table 2 Comparison of SOD and GSH-Px expression in myocardial tissue of mice in 3 groups

注：SOD=超氧化物歧化酶，GSH-Px=谷胱甘肽過氧化物酶；a表示與對照組比較P＜0.05，b表示與有氧運動組比較P＜0.05。

組別只數SODGSH-Px對照組932.325±0.75425.464±1.067模型組912.879±0.133ab8.672±1.056ab有氧運動組921.615±0.432a15.990±0.608a F值314.13729.53 P值＜0.001＜0.001

3 討論

AS及其相關的心肌纖維化是心血管疾病防治的主要方向［11］，臨床上治療主要以抗炎、降脂等藥物治療為主，但治療效果有限。運動有助于降低心血管疾病發生的風險。研究表明，運動訓練明顯改善了心肌梗死引起的心臟功能障礙和纖維化［12］。此外，也有研究證明運動訓練減輕了因年老導致的心肌纖維化，并促進了血管內皮生長因子的釋放［7］。上述研究表明，有氧運動可能在改善AS引起的心肌纖維化方面也發揮重要作用。

運動訓練可以預防或減輕心肌纖維化，其機制與運動訓練抑制心肌細胞炎癥和細胞凋亡，清除胞質內受損蛋白質和代謝產物等有關［13-14］。本研究顯示，模型組小鼠心肌細胞形態、大小、間隙均有所增寬，存在炎性細胞的浸潤，這表明AS激活了炎癥反應。免疫炎癥反應在加重心肌損傷和纖維化過程中發揮著至關重要的作用［15］。NLRP3炎癥小體作為AS中調節炎癥的關鍵因子，其激活可以加劇心肌纖維化的進程［16-17］。也有研究證明，抑制NLRP3炎癥小體激活可以通過調節IL-1β分泌來減少巨噬細胞的募集，同時對成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化也有抑制作用，以此改善心肌纖維化［18］。IL-1β是另一個致AS的關鍵因子，主要來源于血管內皮細胞和心臟成纖維細胞，可以誘導促炎細胞因子IL-6和IL-8的表達以及其他參與纖維化的蛋白表達增加［19］。此外，IL-1β還可通過加速心肌細胞凋亡來促進心肌纖維化［20］。本研究結果發現，AS模型組小鼠心肌組織中NLRP3、IL-1β蛋白表達均顯著升高，經12周的有氧運動后，小鼠NLRP3、IL-1β蛋白表達顯著減少，炎性損傷和心肌纖維化均減輕。蒲詠秋［21］的研究也表明，跑臺運動顯著降低了心力衰竭小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-1β和IL-6的水平，改善心肌功能并減弱心肌損傷。

作為調節纖維化過程的關鍵生長因子，TGF-β1活性在心肌損傷后顯著增加，并參與調節所有促進心肌纖維化細胞的表型和功能［22］。許多研究已經表明血管緊張素、醛固酮等多種因素導致的心肌纖維化與TGF-β信號傳導通路的激活有關［23-24］。本研究與劉亞等［25］的研究結果大致吻合，均顯示運動可以減少TGF-β1的水平，從而改善心肌纖維化。其原因可能是：TGF-β1是AS心肌纖維化的主要開關之一，AS誘導的氧化應激和慢性炎癥環境使TGF-β1表達增加，以發揮抑制過度炎癥反應的作用。慢性炎癥反應使TGF-β1受體表達發生改變的同時激活了TGF-β1信號通路，刺激成纖維細胞的增殖和分化，活化的TGF-β1還會誘導細胞外基質沉積，加重心肌纖維化［26-27］。有氧運動具有抗炎、抗氧化的作用，可以減輕AS小鼠炎癥反應，減少TGF-β1的過度釋放，從而減緩AS心肌纖維化。

ROS的過度釋放會觸發多種信號傳導，導致炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6以及轉化生長因子的過量產生，促進心肌纖維化［28-29］。SOD和GSH-Px是心肌組織內重要的抗氧化酶，能夠間接反映心肌氧化應激水平和自由基的代謝水平，保護組織免受氧化應激的損傷［30］。研究表明，抗氧化酶活性的增加在抑制糖尿病大鼠心肌纖維化方面發揮潛在作用［26］。有研究報道，抑制自發性高血壓心肌組織氧化應激反應，可以抑制高血壓導致的心肌纖維化［31］。本次實驗結果表明，模型組的抗氧化指標SOD和GSH-Px較對照組低，有氧運動后小鼠心肌組織中抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性較模型組有所升高。其機制可能是有氧運動激活小鼠的酶促抗氧化系統，調節機體氧化應激，增強AS小鼠抗氧化能力，抑制了ROS產生炎性細胞因子以及轉化生長因子的某些通路，從而改變心肌纖維化的進程。

綜上所述，本研究結果顯示，有氧運動減輕AS小鼠心肌纖維化可能與抑制小鼠心肌組織炎癥反應、激活抗氧化應激水平，發揮心臟保護作用有關。然而需要指出的是，本研究僅是對該方面做了初步探討，有氧運動改善AS小鼠心肌纖維化的具體機制還需要進一步深入研究。

作者貢獻：秦芳負責文章構思；馬甜甜、于子夫負責數據統計、繪制圖表；劉西花對整體研究方案、設計、研究實施過程等進行指導，對論文整體負責。

本文無利益沖突。