經(jīng)典名方開心散不同粉碎方式下成分含量差異研究*

李勝，李超，丁輝，宋新波，2，3

（1.天津中醫(yī)藥大學制藥工程學院，天津 301617；2.省部共建組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；3.現(xiàn)代中藥海河實驗室，天津 301617）

經(jīng)典名方開心散（KXS）最初記載于唐代孫思邈所著的《備急千金藥方·卷十四》，由遠志、人參、茯苓、石菖蒲4 味藥物組成。經(jīng)文獻考證4 味藥物的比例為遠志∶人參∶茯苓∶石菖蒲=1∶1∶2∶1[1]。其中遠志安神益智，交通心腎，祛痰消腫；人參補氣固脫，生津養(yǎng)血，寧心益智；茯苓利水滲濕，健脾寧心；石菖蒲開竅豁痰，醒神益智，化濕開胃[2]。各味藥物活性物質之間相互協(xié)同，配伍主治好忘。臨床常被用來治療阿爾茨海默病[3-4]、血管性癡呆[5]、認知障礙[6]等以記憶功能障礙為主要表現(xiàn)的疾病，同時對抑郁[7-8]、失眠[9]、疲勞[10]、糖脂代謝紊亂[11]等疾病亦有積極的治療效果。

散劑作為中藥常用劑型之一，是指將藥物粉碎后混勻成粉末狀，具有制備簡單、起效迅速、服用方便、有效成分利于溶出、藥材利用度高、節(jié)約藥物資源等優(yōu)勢，在歷代方劑中使用頻率頗高，歷史悠久[12-13]。《中華人民共和國藥典》2015年版記載的粉碎方法有“用時搗碎”“用時打碎”“切碎”“碾碎”“砸碎”“打成碎塊”“研粉”“研末”“挫成粉末”“水飛”等方法[14]。目前，KXS 的相關研究主要集中于化學成分[15-16]、藥理機制[17-18]及體內代謝[19]方面，而關于KXS 制備工藝方面的研究相對較少，其粉碎方式的研究未見文獻報道。因此，本研究以KXS 為研究對象，以傳統(tǒng)搗碎、傳統(tǒng)碾碎、現(xiàn)代機器粉碎對藥材進行處理，采用高效液相-二極管陣列檢測器（HPLCPDA）法檢測非揮發(fā)性成分，頂空固相微萃取-氣質聯(lián)用（HS-SPME-GC/MS）法檢測揮發(fā)性成分，旨在探究不同粉碎方式對KXS 成分含量的影響，為KXS藥材粉碎工藝提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 手持式紅外測溫儀，蘇州特安斯電子有限公司；DLS 粒徑測定儀，美國布魯克海文儀器公司；LC 高效液相色譜儀，SHIMADZU日本島津公司；HyPURITY C18色譜柱（250 mm×4.6 mm），塞默飛世爾科技有限公司；7890B-7000D 三重四極桿氣質聯(lián)用儀，美國Agilent 公司；手動固相微萃進樣器，德國Gerstel 公司；HP-5MS 毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），美國Agilent 公司；SPME 萃取纖維（100 μm PDMS，85 μm Polyacrylate，65 μm PDMS/DVB，50/30 μm DVB/CRA/PDMS），美國Supelco 公司；AL204 型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ2200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；CascadaTM超純水機，美國PALL 公司；中藥搗藥罐（純銅），中藥碾藥槽（純銅），天津市宏興鑄造廠；中草藥粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司。

遠志（批號190601）、人參（批號190704）、茯苓（批號190609）及石菖蒲（批號047-2017122902）均由天津中一制藥有限公司提供，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學張麗娟教授鑒定，遠志為遠志科植物遠志Polygala tenuifoliaWilld.的干燥根，人參為五加科植物人參Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖，茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf 的干燥菌核，石菖蒲為天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowiiSchott 的干燥根莖。

2 方法與結果

2.1 KXS 散劑的制備 按比例稱取各單味藥，混合，以不同粉碎方式（傳統(tǒng)搗碎、傳統(tǒng)碾碎、現(xiàn)代機器粉碎）處理，將細粉過6 號篩，直至95%質量以上的藥材均已過篩，即得KXS 散劑，每種粉碎方法制備3 份。

2.2 KXS 粉碎過程中溫度變化及成品粒徑考察

2.2.1 溫度測定 粉碎前記錄各單味藥材的初始溫度，粉碎過程中30 s 進行1 次測溫（共測5 次），結果見表1 及表2。

表1 各單味藥物的初始溫度℃

表2 KXS 在不同粉碎過程中的溫度變化

2.2.2 粒徑測定 精密稱取3 種粉碎方式制得的KXS 0.01 g，置于10 mL 容量瓶中，加少量純水搖勻，再加純水定容至刻度線，超聲混合30 min，拿出冷卻至室溫，粒徑儀測定粒徑，結果見表3。

表3 不同粉碎方式制得的KXS 粉末平均粒徑nm

2.3 HPLC-PDA 法測定不同粉碎方式下非揮發(fā)性成分含量

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取KXS 2.0 g，置于10 mL 容量瓶中，加適量75%甲醇，超聲45 min，冷卻15 min，再次超聲45 min，冷卻至室溫，加75%甲醇定容至刻度，抽濾，取濾液，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3.3 色譜條件 色譜柱：HyPURITY C18色譜柱（250 mm×4.6 mm）；柱溫：30 ℃；流動相：0.05%磷酸水溶液-乙腈，梯度洗脫：0～25 min，19%～21%乙腈；25～35 min，21%～21%乙腈；35～40 min，21%～32%乙腈；40 ～55 min，32%～40%乙腈；55 ～60 min，40%～95%乙腈；60～65 min，95%～95%乙腈；65～75 min，95%～19%乙腈；流速1 mL/min；進樣體積50 μL；檢測波長203 nm。混合對照品溶液、供試品溶液色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品和KXS 樣品液相色譜圖

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 精密量取系列質量濃度的標準品溶液，75%甲醇配制成6 個不同濃度的混標溶液，按照“2.3.3”項中的色譜條件進樣，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，計算回歸方程及相關系數(shù)，結果見表4，表明其線性關系良好。

表4 KXS 各指標成分的線性關系考察結果

2.4.2 精密度實驗 精密量取“2.3.1”項中5 種標準品溶液各1 mL，置于5 mL 容量瓶中，加75%甲醇定容至刻度線，按照“2.3.3”項中的色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積，計算遠志酮Ⅲ、3，6’-二芥子酰基蔗糖、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1 峰面的RSD 值，結果分別為1.24%、1.48%、1.06%、1.11%、1.35%，RSD 值均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性考察 取“2.1”項中制備的KXS，按“2.3.2”項中的方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項中的色譜條件進樣，記錄各組指標成分的峰面積，計算RSD 值，該條件下各指標成分的峰面積RSD 值分別為2.64%、0.54%、2.49%、2.78%、1.47%，RSD 值均小于3.0%，表明該方法重復性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性考察 取“2.1”項中制備的KXS，按“2.3.2”項中的方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項中的色譜條件進樣，分別在0、2、4、8、12、24 h 分別進樣1 次，記錄各組指標成分的峰面積，計算RSD 值。遠志酮Ⅲ、3，6’-二芥子酰基蔗糖、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1 的峰面積RSD 值分別為1.14%、0.52%、1.47%、1.49%、1.46%，RSD 值均小于3.0%，表明該供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率考察 精密稱取已知指標成分含量的KXS 2.0 g，分別加入約與樣品等量的各對照品，按“2.3.2”項中的方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項中的色譜條件進樣。計算遠志酮Ⅲ、3，6’-二芥子酰基蔗糖、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1 的平均加樣回收率并計算RSD值，平均加樣回收率分別為96.56%、97.88%、99.32%、98.37%、99.20%，RSD 值分別為0.77%、0.83%、1.62%、1.37%、0.96%。

2.4.6 不同粉碎方式對KXS 非揮發(fā)性成分的影響 精密稱取傳統(tǒng)搗碎、傳統(tǒng)碾碎、現(xiàn)代機器粉碎條件下制備的KXS 樣品每份2.0 g，按“2.3.2”項中的方法制備供試品溶液，每種粉碎方法制備3 份供試品，按“2.3.3”項中的色譜條件進樣檢測，記錄峰面積，代入標準曲線方程，計算出各指標成分的含量，結果見表5。

表5 不同粉碎方式下5 種成分的含量測定結果 μg/g

結果顯示，傳統(tǒng)搗碎及碾碎制得的KXS 中各指標成分含量均高于由現(xiàn)代機器粉碎制得的KXS，而搗碎與碾碎相比，由碾碎制備的KXS 中各指標成分含量較高。

2.5 HS-SPME/GC-MS 法測定不同粉碎方式下?lián)]發(fā)性成分含量

2.5.1 頂空固相微萃取條件 分別稱取“2.1”項中的KXS 粉末各0.1 g 于20 mL 的頂空瓶中，迅速壓緊瓶蓋，備用。

2.5.2 色譜質譜條件 色譜柱：Agilent HP-5MS 毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度：250 ℃；載氣為氦氣（＞99.999%）；載氣流速：1 mL/min；分流比為2∶1；程序升溫條件：以初溫45 ℃保持2 min，以12 ℃/min 的速率升至117 ℃，以1 ℃/min 的速率升至138 ℃，再以4 ℃/min 的速率升至142 ℃，保持0.5 min，最后以20 ℃/min 的速率升至230 ℃，保持3 min。孵化溫度為55 ℃，孵化時間為55 min，吸附時間為40 min，解吸時間為300 s；質譜檢測器離子源為EI 離子源，電離電壓為70 eV，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，質量掃描范圍為30～500 amu，全掃描模式采集，質譜標準庫為NIST17。

2.5.3 不同粉碎方式對KXS 揮發(fā)性成分的影響 KXS總離子圖如圖2所示，根據(jù)匹配度、保留指數(shù)及參考文獻對各色譜峰進行定性分析，采用峰面積歸一法確定各成分的相對百分含量[20]，結果見開放科學（資源服務）標識碼（OSID）。從不同粉碎方式處理的KXS 中共鑒定出56 種共有化合物，分別占總揮發(fā)性成分的93.19%（搗碎）、94.16%（碾碎）、94.04%（現(xiàn)代機器粉碎），可將其分為8 類化合物，包括醚類、萜類、醇/酸/醛類、酯/酮類、碳氫化合物。其中醚類占比最高，達80.38%，種類有7 種；萜類種類最多，有36 種，占比為12%；醇/酸/醛類6 種、酯/酮類4 種、碳氫化合物3 種，分別占比為0.99%、0.24%、0.19%。

圖2 KXS 揮發(fā)性成分的總離子流圖

選取8 種相對百分含量較高的化合物進行分析，結果顯示，（+）-長葉環(huán)烯、β-石竹烯、β-細辛醚在傳統(tǒng)搗碎條件下占比最大，分別為1.09%、1.15%、43.98%。其中（+）-長葉環(huán)烯、β-石竹烯在傳統(tǒng)搗碎、碾碎條件下占比差異不大，在現(xiàn)代機器粉碎條件下占比最小，分別為0.93%、1.02%。β-細辛醚在傳統(tǒng)碾碎、現(xiàn)代機器粉碎條件下占比差異不大，在傳統(tǒng)碾碎條件下占比最小，為43.22%；白菖烯、異丁香酚甲醚、γ-細辛醚在碾碎條件下占比最大，分別為1.45%、4.84%、24.32%。其中白菖烯在傳統(tǒng)搗碎、碾碎條件下占比差異不大，在現(xiàn)代機器粉碎條件下占比最小，為1.27%。異丁香酚甲醚、γ-細辛醚在傳統(tǒng)碾碎、現(xiàn)代機器粉碎條件下占比差異不大，在傳統(tǒng)搗碎條件下占比最小，分別為4.21%、23.62%；甲基丁香酚和α-細辛醚在現(xiàn)代機器粉碎條件下占比最大，分別為6.58%、1.40%。甲基丁香酚在傳統(tǒng)碾碎、現(xiàn)代機器粉碎條件下占比差異不大，在傳統(tǒng)搗碎條件下占比最小，為5.54%。α-細辛醚在傳統(tǒng)搗碎、碾碎條件下占比差異不大，在傳統(tǒng)碾碎條件下占比最小，為1.16%。

3 討論

粉碎方式作為中藥材前處理的一種，對其藥效的影響不容忽視，在粉碎過程中溫度與粉末粒徑可能對KXS 的成分含量有所影響，因此本實驗對這兩個因素進行了考察。結果表明，雖然散劑粉末均通過6 號篩，但由于機器粉碎在粉碎過程中混合更加均勻，粉碎力度更大，同時由于機器刀頭劇烈摩擦，因此粒徑較其他兩種粉碎方式要小且在粉碎過程中升溫非常明顯，溫度最高達55 ℃，傳統(tǒng)碾碎比傳統(tǒng)搗碎制得的散劑粒徑更小，在溫度方面差異不大且各批次間基本沒有差異。

對于5 種非揮發(fā)性成分，現(xiàn)代機器粉碎制得的KXS 均低于其他兩種制法，推測由于高溫使各種物質之間發(fā)生了相互作用，導致其部分成分發(fā)生了變化，且粉碎過程中的劇烈攪拌更加加劇了這種情況。而傳統(tǒng)搗碎、碾碎均為人工操作，在粉碎過程中溫度相差不大，但碾碎制得的KXS 成分含量略高于搗碎，推測是由于碾碎更加能夠將各單味藥物混合均勻，也更加能夠將其充分粉碎，所得粉末粒徑更小所造成；HS-SPME/GC-MS 法鑒定出的56 種共有成分均占總揮發(fā)性成分的90%以上，其中由傳統(tǒng)碾碎制備的KXS 揮發(fā)性成分占比最高，為94.16%。除3 種細辛醚外，（+）-長葉環(huán)烯、β-石竹烯、白菖烯、異丁香酚甲醚、甲基丁香酚的占比也高于其他成分，推測在KXS 發(fā)揮藥效時起到潛在作用。此8 種成分中，有6 種在由傳統(tǒng)搗碎、碾碎制得KXS 中的相對百分含量較高，雖然某些成分在傳統(tǒng)搗碎、現(xiàn)代機器粉碎制得的KXS 中占比較高，但均與傳統(tǒng)碾碎相差不大。因此，綜合兩種檢測KXS 成分含量的方法，在其前處理過程中，以傳統(tǒng)碾碎制備KXS 能夠較大程度保留其成分。對于本方，從目前的結果來看不同的粉碎方式已對其成分含量產生了一定影響，此種差異是否會在藥效方面產生影響，還有待進一步研究證實。